Name: RNA Pull-down te identificeren van RNA doelen van een lang niet-coderende RNA Procedure (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Leer RNA pull-down om RNA-doelen van lange niet-coderende RNA's te identificeren met behulp van biotin-gemerkte antisense-oligonucleotideprobes. Deze methode combineert ChIRP- en CHART-technieken voor zowel gekweekte cellen als weefselextracten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de Universiteit van Aix-Marseille en CNRS en gefinancierd door een subsidie van Pfizer laboratoria.

Alle procedures werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de Europese Economische Gemeenschap voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (86/609/EEG en 2010/63/UE) en onder een licentie verleend aan D. Becquet (Préfecture des Bouches-du-Rhône, vergunning nr. 13-002).
1. sonde Design
<ol><li>
Met behulp van de primaire opeenvolging van de lncRNA van belang, genereren de secundaire structuur op de 'RNAstructure Webserver'5. Opmerking: Op deze site, verschillende algoritmen kunnen worden gebruikt. De voorspelling van de drie hulpprogramma's die de beste resultaten geven voor de sonde ontwerpen zijn: "Fold" (laagste vrije energie structuur), "MaxExpect" (zeer waarschijnlijk basenparen) en "Probnot" (waarschijnlijk basenparen met inbegrip van pseudoknots). Deze drie analyses kunnen worden uitgevoerd en vergeleken. Andere webservers, zoals de Wenen RNA websuite7, kunnen ook worden gebruikt.<ol>
<li>Selecteer de regio's die een lage kans op interne basis koppeling weergeven en ontwerpen van anti-zin oligonucleotide sondes voor 25 honken schoon met een sterke affiniteit voor deze regio's. Opmerking: De GC-inhoud van deze sondes moeten bestaan tussen de 40 en 60%. Met behulp van een alignment search tool (Blast), zorg ervoor dat de geselecteerde anti-zin oligonucleotide sondes nucleotidesequenties in andere RNA uitgedrukt in het gekozen cel-systeem niet herkent.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ook het ontwerp van een niet-specifieke DNA oligonucleotide sonde van 25 bases waarin noch affiniteit voor de lncRNA van belang noch voor andere RNA-sequenties in het genoom van belang.</li>
	<li>Bestel de sondes met biotine aan de 3'-eind. Opmerking: Teneinde de sterische hinder, moet de afstand tussen oligonucleotide en biotine worden verhoogd met een spacer triethyleneglycerol. Voor een optimaal resultaat, en om te kunnen beoordelen van het specifieke karakter van de resultaten van de pull-down, het is aanbevolen om ontwerp 3 verschillende anti-zin oligonucleotide sondes waarna experimenteel vergelijken hun efficiëntie.</li>
</ol>2. dwarsbinding
<ol><li>
Gekweekte cel dwarsbinding
	<ol>
<li>Sommatolactotroph hypofyse cellen van de cultuur de GH4C1 in Ham van F10 medium aangevuld met 15% paard serum en 2% foetaal kalfsserum. De cellen groeien tot de samenvloeiing in 78,5 cm2 cultuur platen. Dit correspondeert met ongeveer 1 x 107 cellen.</li>
		<li>Het kweekmedium cel verwijderen uit een plaat confluente GH4C1 78,5 cm2 cultuur, dan spoelen met 1 x de gemiddelde hoeveelheid fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)</li>
		<li>Herstellen van de cellen met een 1% paraformaldehyde-oplossing in PBS (10 mL voor een 78,5 cm2 gerechten); deze oplossing moet vers worden bereid uit een paraformaldehyde-stockoplossing van 4%. Cross-link onder roeren gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT). Let op: Paraformaldehyde (PFA) is giftig en moet met voorzichtigheid worden behandeld.</li>
		<li>De actie paraformaldehyde doven door het toevoegen van 1/10 volume van glycine 1,25 M (1 mL per 10 mL van oplossing paraformaldehyde); agitate 5 min op RT.</li>
		<li>Gooi de media door aspiratie en spoel twee keer (5 min) met 1 X de Mediuminhoud van PBS.</li>
		<li>Toevoegen van een volume van PBS overeenkomt met 1/10de van de omvang van de media, verzamelen cellen met een cel schraper, en dan overdracht aan een centrifugebuis.</li>
		<li>Draaien op 510 g bij 4 ° C gedurende 5 min.</li>
		<li>Verwijder zoveel supernatant mogelijk.</li>
		<li>Opslaan van pellets voor onbepaalde tijd indien nodig bij-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Weefsel dwarsbinding
	<ol>
<li>Zet 5 mg van vers verkregen muis slijmachtige klier weefsel in een oplossing van 1% paraformaldehyde verdund in PBS (ongeveer 10 x het volume van het weefsel), doorroeren voor 10 min op RT.</li>
		<li>De actie paraformaldehyde doven door het toevoegen van een 1.25M glycine oplossing (1 mL per 10 mL paraformaldehyde oplossing) en doorroeren 5 min op RT.</li>
		<li>Negeren van de media door aspiratie en spoel tweemaal met PBS (ongeveer 10 x het volume van het weefsel). Verwijder zoveel supernatant mogelijk.</li>
		<li>Opslaan van de kruiselings gekoppelde weefsel voor onbepaalde tijd bij-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. cel of weefsel Lysis
<ol><li>Bereiden de Lysis Buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.0, van 10 mM EDTA, 1% SDS aangevuld met 200 U/mL van een oplossing van de Inhibitor van de omwenteling RNAse en een cocktail van proteasen remmer 5 µL/mL).</li>
	<li>Voor het verkrijgen van lysed monsters zonder voorafgaande ontdooien, resuspendeer de cel pellets of kruislings gekoppelde weefsels met deze buffer (ongeveer 1 mL per 100 mg cel pellet of weefsel). Een cel pellet 1 x 107 cellen verkregen aanleiding geven tot een lysed monster ongeveer 20 mg eiwit bevat. Opmerking: Afhankelijk van het weefsel gebruikt, een stap van de verstoring van de mechanische moet worden toegevoegd. In dit geval is het belangrijk te voorkomen dat de verwarming van de monsters tijdens deze extra stap.</li>
</ol>4. ultrasoonapparaat
<ol><li>
Optimalisatie van de ultrasoonapparaat voorwaarden
	<ol>
<li>Program het ultrasoonapparaat met 30 s ON reeks 2 tot en met 5 en 30 s af.</li>
		<li>Voer tests om te optimaliseren ultrasoonapparaat voorwaarden op verdunde lysed monsters (verdunningsfactor ½ of ¼ overeenkomt met ongeveer 10 of 5 mg van eiwitten). Plaats verdund lysed monsters in het waterbad van 4 ° C en beginnen met het ultrasoonapparaat serie.</li>
		<li>Zuiveren RNAs met een RNA zuivering kit of met een RNA isolatie reagens wordt gebruikt (bijvoorbeeldTrizol).</li>
		<li>Laden van de totaliteit van gezuiverde RNA op een 1% agarose gelelektroforese in TBE buffer, check de lengte van de fragmenten van RNA. Deze lengte moet variëren tussen 200 en 800 bp. Opmerking: Afhankelijk van de grootte van RNA fragment, de anti-zin oligonucleotide sondes efficiëntie kan variëren. Het is dan raadzaam om de efficiëntie van de sondes onder verschillende omstandigheden van ultrasoonapparaat te controleren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ultrasoonapparaat van de lysed monsters
	<ol>
<li>Plaats lysed monsters overeenkomt met 20 mg van eiwitten (verkregen na stap 3.2) in de 4 ° C water bad en beginnen met het ultrasoonapparaat serie zoals in stap 4.1 geoptimaliseerd.</li>
		<li>Onmiddellijk na ultrasoonapparaat, Centrifugeer gedurende 5 min bij 12.000 g bij 4 ° C. Overdracht supernatant in nieuwe centrifuge buizen. Opmerking: Teneinde homogeniteit te waarborgen, repliceren supernatant kunnen worden gebundeld en herverdeeld op deze stap.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. RNA Pull-down
<ol><li>
Dag 1 – kruising stap
	<ol>
<li>2 delen van hybridisatie buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.0, 750 mM NaCl, 1 mM EDTA, SDS 1%, 15% Formamide toegevoegd gebruik) toevoegen aan het supernatant verzameld na de ultrasoonapparaat stap. Vortex.</li>
		<li>Breng 20 µL van elk monster in een centrifugebuis (input monsters) en opgeslagen bij-20 ° C.</li>
		<li>100 pmol van biotinyleerd oligonucleotide sondes (specifieke of niet-specifiek; Zie tabel 1) toevoegen aan elk monster. Incubeer van 4 tot en met 6 h onder matig roeren op een buis rotator op RT.</li>
		<li>Voeg toe 50 µL van magnetische daar kralen aangevuld met 200 U/mL van een oplossing van de Inhibitor van de omwenteling RNAse en een cocktail van proteasen remmer 5 µL/mL.</li>
		<li>Na een nacht bebroeden onder gematigde agitatie op de buis rotator op RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dag 2 – RNA isolatie stap
	<ol>
<li>Magnetische ondersteuning aanwenden om te scheiden van de parels van cel lysate, verwijder het supernatant en wassen van de kralen met 900 µL van was buffer (SDS 0,5%, SSC 2 x). Herhaal 5 keer afgewisseld met 5 min agitatie op de rotator op RT.</li>
		<li>Na de laatste wassen, decanteren in een laatste keer en voeg 95 µL van Proteinease K buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.0, van 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% SDS) en 5 µL van proteïnase-K (20 mg/mL) aan de monsters.</li>
		<li>Op het ijs, Ontdooi de input monsters (20 μL) en voeg 75 µL van Proteinease K buffer en 5 µL van proteïnase-K (20 mg/mL).</li>
		<li>Incubeer alle monsters met proteïnase K voor 45 min bij 50 ° C dan 10 min bij 95 ° C.</li>
		<li>Chill de steekproef op het ijs gedurende 3 minuten vóór het scheiden van de parels van de RNAs met de magnetische steun. Behouden van het supernatant en negeren van de kralen.</li>
		<li>Zuiveren RNAs met een RNA zuivering kit, met inbegrip van een DNA spijsvertering stap. Winkel RNAs bij-80 ° C.</li>
		<li>Uitvoeren van omgekeerde transcriptie qPCR (RT-qPCR) met behulp van een RT kit gevolgd door qPCR met behulp van specifieke primers (tabel 1).</li>
		<li>Construeer twee DNA-bibliotheken die overeenkomt met de twee zwembaden van RNA verkregen met elk van de specifieke Neat1 sondes (tabel 1). Rangschikken op een volgende-generatie sequencing-systeem uitvoeren</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Chu, C., Qu, K., Zhong, F. L., Artandi, S. E., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+maps+of+long+noncoding+RNA+occupancy+reveal+principles+of+RNA-chromatin+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genomic maps of long noncoding RNA occupancy reveal principles of RNA-chromatin interactions.</a> Mol Cell. , 667-678 (2011).</li>
<li>Chu, C., Quinn, J., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+isolation+by+RNA+purification+%28ChIRP%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Chromatin isolation by RNA purification (ChIRP).</a> J Vis Exp. , e3912(2012).</li>
<li>Simon, M. D., Wang, C. I., Kharchenko, P. V., West, J. A., Chapman, B. A., Alekseyenko, A. A., Borowsky, M. L., Kuroda, M. I., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+binding+sites+of+a+noncoding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The genomic binding sites of a noncoding RNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , 20497-20502 (2011).</li>
<li>Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+hybridization+analysis+of+RNA+targets+%28CHART%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Capture hybridization analysis of RNA targets (CHART).</a> Curr Protoc Mol Biol. , Unit 21.25 (2013).</li>
<li>Reuter, J. S., Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAstructure%3A+software+for+RNA+secondary+structure+prediction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis.</a> BMC Bioinformatics. 11, 129(2010).</li>
<li>Sun, X., Haider Ali, M. S. S., Moran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+interactions+of+long+non-coding+RNAs+and+heterogeneous+nuclear+ribonucleoproteins+in+regulating+cellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The role of interactions of long non-coding RNAs and heterogeneous nuclear ribonucleoproteins in regulating cellular functions.</a> Biochem J. , 2925-2935 (2017).</li>
<li>Gruber, A. R., Lorenz, R., Bernhart, S. H., Neuböck, R., Hofacker, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Vienna+RNA+websuite%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The Vienna RNA websuite.</a> Nucleic Acids Res. , W70-W74 (2008).</li>
<li>Tollervey, J. R., Curk, T., Rogelj, B., Briese, M., Cereda, M., Kayikci, M., König, J., Hortobágyi, T., Nishimura, A. L., Zupunski, V., Patani, R., Chandran, S., Rot, G., Zupan, B., Shaw, C. E., Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+RNA+targets+and+position-dependent+splicing+regulation+by+TDP-43%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43.</a> Nat Neurosci. , 452-458 (2011).</li>
<li>Riva, P., Ratti, A., Venturin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long+non-coding+RNAs+in+neurodegenerative+diseases%3A+novel+mechanisms+of+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Alzheimer+Res%22%5BJournal%5D)">The long non-coding RNAs in neurodegenerative diseases: novel mechanisms of pathogenesis.</a> Curr Alzheimer Res. (27338628), (2016).</li>
<li>Barry, G., Briggs, J. A., Hwang, D. W., Nayler, S. P., Fortuna, P. R., Jonkhout, N., Dachet, F., Maag, J. L., Mestdagh, P., Singh, E. M., Avesson, L., Kaczorowski, D. C., Ozturk, E., Jones, N. C., Vetter, I., Arriola-Martinez, L., Hu, J., Franco, G. R., Warn, V. M., Gong, A., Dinger, M. E., Rigo, F., Lipovich, L., Morris, M. J., O'Brien, T. J., Lee, D. S., Loeb, J. A., Blackshaw, S., Mattick, J. S., Wolvetang, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long+non-coding+RNA+NEAT1+is+responsive+to+neuronal+activity+and+is+associated+with+hyperexcitability+states%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The long non-coding RNA NEAT1 is responsive to neuronal activity and is associated with hyperexcitability states.</a> Sci Rep. , 40127(2017).</li>
<li>Adriaens, C., Standaert, L., Barra, J., Latil, M., Verfaillie, A., Kalev, P., Boeckx, B., Wijnhoven, P. W., Radaelli, E., Vermi, W., Leucci, E., Lapouge, G., Beck, B., van den Oord, J., Nakagawa, S., Hirose, T., Sablina, A. A., Lambrechts, D., Aerts, S., Blanpain, C., Marine, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+induces+formation+of+NEAT1+lncRNA-containing+paraspeckles+that+modulate+replication+stress+response+and+chemosensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">p53 induces formation of NEAT1 lncRNA-containing paraspeckles that modulate replication stress response and chemosensitivity.</a> Nat Med. , (2016).</li>
<li>Fang, J., Qiao, F., Tu, J., Xu, J., Ding, F., Liu, Y., Akuo, B. A., Hu, J., Shao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+expression+of+long+non-coding+RNA+NEAT1+indicates+poor+prognosis+of+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">High expression of long non-coding RNA NEAT1 indicates poor prognosis of human cancer.</a> Oncotarget. , (2017).</li>
<li>Torres, M., Becquet, D., Blanchard, M. P., Guillen, S., Boyer, B., Moreno, M., Franc, J. L., François-Bellan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+RNA+expression+elicited+by+3%27-UTR+IRAlu-paraspeckle+associated+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Circadian RNA expression elicited by 3'-UTR IRAlu-paraspeckle associated elements.</a> Elife. , (2016).</li>
<li>Fox, A. H., Lamond, A. I. Paraspeckles. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://cshperspectives.cshlp.org/content/2/7/a000687.long">http://cshperspectives.cshlp.org/content/2/7/a000687.long</a> (2010).</li>
<li>Chen, L. L., DeCerbo, J. N., Carmichael, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alu+element-mediated+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Alu element-mediated gene silencing.</a> EMBO J. , 1694-1705 (2008).</li>
<li>Tripathi, V., Ellis, J. D., Shen, Z., Song, D. Y., Pan, Q., Watt, A. T., Freier, S. M., Bennett, C. F., Sharma, A., Bubulya, P. A., Blencowe, B. J., Prasanth, S. G., Prasanth, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear-retained+noncoding+RNA+MALAT1+regulates+alternative+splicing+by+modulating+SR+splicing+factor+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The nuclear-retained noncoding RNA MALAT1 regulates alternative splicing by modulating SR splicing factor phosphorylation.</a> Mol Cell. , 925-938 (2010).</li>
<li>Engreitz, J. M., Sirokman, K., McDonel, P., Shishkin, A. A., Surka, C., Russell, P., Grossman, S. R., Chow, A. Y., Guttman, M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-RNA+Interactions+Enable+Specific+Targeting+of+Noncoding+RNAs+to+Nascent+Pre-mRNAs+and+Chromatin+Sites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA-RNA Interactions Enable Specific Targeting of Noncoding RNAs to Nascent Pre-mRNAs and Chromatin Sites.</a> Cell. , 188-199 (2014).</li>
<li>Nakagawa, S., Ip, J. Y., Shioi, G., Tripathi, V., Zong, X., Hirose, T., Prasanth, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malat1+is+not+an+essential+component+of+nuclear+speckles+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Malat1 is not an essential component of nuclear speckles in mice.</a> RNA. , (2012).</li>
<li>Zhang, B., Arun, G., Mao, Y. S., Lazar, Z., Hung, G., Bhattacharjee, G., Xiao, X., Booth, C. J., Wu, J., Zhang, C., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lncRNA+Malat1+is+dispensable+for+mouse+development+but+its+transcription+plays+a+cis-regulatory+role+in+the+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The lncRNA Malat1 is dispensable for mouse development but its transcription plays a cis-regulatory role in the adult.</a> Cell Rep. , 111-123 (2012).</li>
<li>Trapnell, C., Roberts, A., Goff, L., Pertea, G., Kim, D., Kelley, D. R., Pimentel, H., Salzberg, S. L., Rinn, J. L., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. , 562-578 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Lang noncoding RNAs (lncRNAs) door hun aantal en de diversiteit vertegenwoordigen een groot gebied van onderzoek en de meeste van hun functies zijn nog steeds om ontdekt te worden. Veel van deze lncRNAs hebben een nucleaire localisatie en onder hen, sommige zijn betrokken bij de regelgevende trajecten van de genexpressie door middel van de mechanismen van transcriptionele of posttranscriptional. Een van de huidige uitdagingen op dit gebied is te begrijpen de relevantie van die lncRNAs in post-transcriptional verwerking van RNAs. Voor dit doel moeten RNAs gericht door lncRNAs worden geïdentificeerd. Geïnspireerd door eerdere studies gericht op de vereniging van lncRNAs met chromatine, ontwikkelden we een procedure waarmee de identificatie van de RNAs, die is gekoppeld aan een lncRNA. Het succes van dit protocol, met de naam RNA pull-down, is voornamelijk afhankelijk van twee cruciale stappen, namelijk het ontwerp van anti-zin DNA oligonucleotide sondes die moet specifiek en uitsluitend te vermengen met de lncRNA van belang, en de voorwaarden van weefsel of fixatie van de cel dat hebben voor het behoud van de integriteit van het netwerk tussen alle moleculaire partners.
Eerder gepubliceerd protocollen geboden procedures voor het isoleren van een lncRNA samen met de bijbehorende chromatine sequenties (Tjilpen1,2, grafiek3,4). In deze protocollen werkten verschillende strategieën te ontwerpen die de anti-zin DNA biotinyleerd oligonucleotide sondes. In de procedure van de Tjilpen gebruikt de auteurs een pool van DNA biotinyleerd oligonucleotide sondes omvat de gehele lengte van de lncRNA van belang na uitsluiting van alle redundante en niet-drugspecifieke sondes1,2. In het protocol van de grafiek, de auteurs geïdentificeerd van de regio's van de lncRNA, die meer toegankelijk zijn voor hybridisatie en ontworpen vangen oligonucleotides, die gericht zijn op deze gebieden. Deze gebieden werden geselecteerd op basis van hun gevoeligheid RNase-H. Inderdaad, met behulp van de eigenschap van RNAse-H te hydrolyseren RNAs op sites van RNA-DNA-bindende, de oligonucleotides die aan toegankelijke sites in de lncRNA te vermengen produceren van RNA-DNA hybriden en leiden tot enzymatische splitsing van de lncRNA. De auteurs drie van deze kandidaat-capture oligonucleotides geselecteerd en gebruikt ze in een cocktail3,-4.
De procedure die we gewend ontwerp de anti-zin DNA biotinyleerd oligonucleotide sondes was dicht bij die in het DIAGRAM-protocol gebruikt, maar de kruising-beschikbare regio's van de gewenste lncRNA niet werden geselecteerd op basis van hun RNAse-H gevoeligheid, maar volgens hun lage waarschijnlijkheid van interne base paren zoals bepaald door bioinformatics modellering van de secundaire structuur van de lncRNA. Het moet opgemerkt worden dat verschillende secondaire structuren zal worden voorspeld met behulp van verschillende algoritmes, en sondes worden geselecteerd die aan beschikbaar sequenties van de lncRNA in het grootste aantal secondaire structuren voorspeld te vermengen. Dezelfde resultaten werden verkregen met een cocktail van drie ontworpen, specifieke sondes of één sonde individueel. Dit leidde tot het gebruik van twee afzonderlijke, specifieke sondes en de afweging van de positieve resultaten als die welke voor deze twee sondes gelden. Ten slotte, het is daarom raadzaam aan het begin van de ontwikkeling van de methode, voor een optimaal resultaat en om te kunnen beoordelen van het specifieke karakter van de resultaten van de pull-down, ontwerpen van 3 verschillende anti-zin oligonucleotide sondes en vervolgens om te vergelijken experimenteel hun efficiëntie, vooral omdat de efficiëntie van de sonde mag worden gewijzigd door cel lysate voorbereiding. Niettemin, de procedure van de sonde ontwerp op basis van bioinformatica modellering van lncRNA secundaire structuur die we gebruikten minder duur dan die gebaseerd op pools van tegels oligonucleotide sondes2bleef, en dit was minder tijdrovend dan de methode op basis op RNAse-H gevoeligheid4.
Een negatieve controle moet ook worden uitgevoerd met behulp van als negatief vastleggen oligonucleotide ofwel de zin DNA biotinyleerd oligonucleotide sondes of vervormd oligonucleotide sondes of oligonucleotides gericht tegen een ongerelateerde RNA. Vanwege het bestaan van natuurlijke antisense afschriften lncRNAs evenwel gebruik van zin oligonucleotide sondes soms ontoereikend. Ongeacht de oligonucleotide sonde geselecteerd voor de negatieve controle, is het noodzakelijk om te controleren door de explosie die het niet te met een bekende RNA vermengen doet en houd in gedachten dat deze oligonucleotide om een nog niet-geannoteerde lncRNA vermengen kunt.
De cel lysates gebruikt in deze RNA pull-down experimenten werden verkregen uit 106 tot 107 cellen bij het werken met gekweekte cellen en van 1 tot 10 mg bij het werken met weefsel. De voorbereiding van cel lysates dient te worden aangepast volgens het type van het weefsels of cellen gebruikt met twee belangrijke stappen die moeten worden geoptimaliseerd: namelijk de cross-linking stap waarmee de vorming van covalente bindingen tussen de lncRNA en haar moleculaire partners, en de ultrasoonapparaat stap waardoor de viscositeit door Shredder chromatine.
Het doel van de cross-linking stap is om ervoor te zorgen dat alle RNA doelen gesloten voor de lncRNA blijven door de vorming van een netwerk tussen alle moleculaire partners inducerende. Een paraformaldehyde behandeling stap die covalente bindingen tussen de lncRNA en haar partners vormen zullen kan het netwerk worden genetwerkt. In het protocol van de grafiek, werd gesuggereerd als over het geheel genomen lysate werken met nucleaire lncRNA, voor het uitvoeren van een eerste behandeling met paraformaldehyde cel en een tweede behandeling op de geïsoleerde stikstofbase breuk3,4. We hebben vastgesteld dat deze aanvullende stap de efficiëntie van de sondes, waarschijnlijk daalde door het verminderen van de toegankelijkheid van de lncRNA in de cellen. Vandaar, de mate van filigraan door paraformaldehyde moet worden aangepast rekening houdend met de cel of weefseltype gebruikt, de lokalisatie van de lncRNA van belang, en de efficiëntie van de ontworpen sondes.
Terwijl het lysing van cellen, het chromatine is uitgebracht in de lysate en verhoogt de viscositeit; het is dan nodig is om het versnipperen van de chromatine met het ultrasoonapparaat te verhogen van de doorstroming van de monsters en vandaar het vergemakkelijken van de toegankelijkheid van de oligonucleotide sondes aan de lncRNA van belang. Ultrasoonapparaat zal echter ook verscheuren de RNAs uitgepakt met de lncRNA van belang. Het is dan belangrijk om het ultrasoonapparaat tijd op een zodanige wijze dat terwijl het efficiënt de viscositeit van de lysate vermindert, het ook mogelijk maakt dat de accumulatie van RNA fragmenten met een lengte te minimaliseren bestaat tussen 200-800 bp. Merk op dat de ultrasoonapparaat tijd zullen zeer afhankelijk van zowel de hoeveelheid en het soort weefsel of gekweekte cellen die worden gebruikt.
Tot slot, kunt de hier beschreven procedure in 2-3 dagen het vangen van de RNA-doelstellingen van een gewenste lncRNA. In combinatie met RT-qPCR, zal deze methoden toestaan op zoek naar een specifieke vereniging en de regulering van een mRNA door de gewenste lncRNA als een kandidaat-aanpak. Voor de aanpak van een genoom-brede, kunnen RNA pull-down experimenten worden geanalyseerd door hoge gegevensdoorvoer RNA-sequentiebepaling waardoor het ophalen van alle RNAs gekoppeld aan de gewenste lncRNA. Ongeacht de analytische strategie gekozen, moet de RNA pull-down procedure bieden nieuwe belangrijke kennis op RNA verordening door lncRNAs.

Het algemene doel van de hier beschreven methode is het identificeren van de moleculaire partners RNA van een lang noncoding RNA (lncRNA). LncRNA komen overeen met de reeksen van meer dan 200 nucleotiden zonder een gedefinieerde leesraam. Sommigen van hen hebben aangetoond te worden betrokken bij de expressie genregulatie, niet alleen op het transcriptional niveau, maar ook bij de verschillende stappen van RNA co- en post-transcriptional rijping. Moleculaire partners van de lncRNA zijn in de laatste gevallen RNAs die moeten worden vermeld. Een methode voor het inschakelen van de identificatie van RNAs verbonden direct of indirect met een lncRNA van belang zou zijn essentieel om te ontwikkelen.
Methoden, eerder gepubliceerd als chromatine isolatie door RNA zuivering (Tjilpen)1,2 en vangen hybridisatie analyse van RNA doelen (grafiek)3,4, stellen hoge gegevensdoorvoer ontdekking van RNA-afhankelijke eiwitten en genomische bandplaatsen voor een specifieke lncRNA. In deze twee methoden, de lncRNA van belang voor het eerst naar biotinyleerd aanvullende oligonucleotides was gekruist, en het complex was geïsoleerd met behulp van daar kralen. Het belangrijkste verschil tussen deze twee technieken is gerelateerd aan het ontwerp van sondes die gericht zijn op lncRNAs. Tjilpen, de strategie geïnspireerd door RNA vis, bestond uit het ontwerpen van een pool van korte complementaire DNA oligonucleotide sondes aan de tegel van de gehele lengte van de lncRNA. Daarentegen in de grafiek, de auteurs aangepast een RNase H toewijzing assay op lncRNAs sonde plaatsen beschikbaar voor hybridisatie.
De hier voorgestelde ontwerp de anti-zin DNA biotinyleerd oligonucleotide sondes gebruikt bioinformatics modellering van lncRNA secundaire structuur5 Schakel sondes met een sterke affiniteit voor regio's die weer een lage waarschijnlijkheid van interne procedure baseren in paren rangschikken. Deze procedure heeft het voordeel dat ze minder duur dan die gebaseerd op pools van tegels oligonucleotide sondes2 en minder tijdrovend dan die gebaseerd op RNAse-H gevoeligheid4.
Want er een groeiend lichaam van bewijsmateriaal voor post-transcriptional genregulatie door lncRNAs6 is, is het handig om een benadering toelatend de vang van de RNAs, die zijn het doelwit van een lncRNA te ontwikkelen. Bovendien, om het bruikbaar is voor de meeste toepassingen, is de aanpak geoptimaliseerd zowel in gekweekte cellen en weefsel extracten.

<table><tbody><tr><td>Bioruptor Plus</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td>Sonicator</td></tr><tr><td>Dynabeads My One</td><td>Thermo-Fisher</td><td>65001</td><td>Magnetische streptavidinkralen</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15515-026</td><td></td></tr><tr><td>Gel elektroforese apparaat</td><td>Advance</td><td>Mupid-One</td><td>Gel elektroforese apparaat</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>RNA XS zuiveringskit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740902</td><td>RNA zuiveringskit</td></tr><tr><td>RNAseOUT</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10777-019</td><td>RNAse remmer</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15596018</td><td>RNA zuivering</td></tr><tr><td>Tube Rotator</td><td>Stuart</td><td>SB2</td><td>Eppendorf buisrotator</td></tr><tr><td>RNA naar DNA</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4387405</td><td>Omgekeerde transcriptie kit</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>1725124</td><td>qPCR reagens</td></tr><tr><td>Applied 7500 Fast</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4351107</td><td>qPCR apparaat</td></tr><tr><td>Illumina TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation kit</td><td>Illumina</td><td>20020594</td><td>DNA bibliotheek constructie kit</td></tr><tr><td>Illumina NextSeq 500</td><td>Illumina</td><td>SY-415-1002</td><td>NGS systeem</td></tr></tbody></table>

rna pull-down te identificeren van rna doelen van een lang niet-coderende rna procedure

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Lang niet-coderende RNA (lncRNA), die zijn reeksen van meer dan 200 nucleotiden zonder een gedefinieerde leesraam, behoren tot de regelgevende niet-coderende-RNA's familie. Hoewel hun biologische functies grotendeels onbekend blijven, het nummer van deze lncRNAs is gestaag toegenomen en nu geschat wordt dat dat mensen meer dan 10.000 dergelijke afschriften wellicht. Sommige van deze zijn bekend te worden betrokken bij belangrijke regelgevende trajecten van genexpressie die op het transcriptional niveau, maar ook op de verschillende stappen van RNA co- en post-transcriptional rijping plaatsvinden. In de laatste gevallen moeten de RNAs, die zijn gericht door de lncRNA worden geïdentificeerd. Dat is de reden waarom is het nuttig om het ontwikkelen van een methode waardoor de identificatie van RNAs verbonden direct of indirect met een lncRNA van belang.
Dit protocol, die werd geïnspireerd door de eerder gepubliceerde protocollen waardoor het isolement van een lncRNA samen met de bijbehorende chromatine-sequenties, werd aangepast aan het isolement van de bijbehorende RNAs toestaan. Wij vastbesloten dat twee stappen cruciaal voor de efficiëntie van dit protocol zijn. De eerste is het ontwerp van specifieke anti-zin DNA oligonucleotide sondes kunnen kruisen aan de lncRNA van belang. Te dien einde, de secundaire structuur van lncRNA werd voorspeld door bioinformatics en anti-zin oligonucleotide sondes zijn ontworpen met een sterke affiniteit voor regio's die een lage kans op interne basis koppeling weergeven. De tweede cruciale stap van de procedure is afhankelijk van de kleefpoeders voorwaarden van de weefsels of gekweekte cellen die voor het behoud van het netwerk tussen alle moleculaire partners. In combinatie met hoge doorvoersnelheid RNA sequencing, bieden dit RNA pull-down-protocol de hele RNA interactome voor een lncRNA van belang.

Verschillende recente studies hebben aangetoond dat de lncRNAs een essentiële rol in bijna elke belangrijke biologisch proces spelen en dat deze rol wordt bereikt door het besturingselement voor de expressie van genen die zich zowel op de transcriptionele en de post-transcriptional niveau in dit laatste geval tonen dat RNAs kunnen het doelwit worden van lncRNAs6.
De lncRNA nucleaire verrijkt overvloedige transcript 1 (Neat1) is betrokken bij verschillende neuropathologies als Frontotemporale dementie, Amyotrofische laterale sclerose, of epilepsie8,9,10, en is ook misregulated in verschillende kankers11,12.
Deze lncRNA is ook bekend om de structurele component van specifieke nucleaire organen, de paraspeckles, en te worden betrokken bij post-transcriptional circadiane regulering van gen expressie13. Paraspeckles die zijn gevonden in elke celkern en worden gevormd rond niet alleen Neat1, die nodig voor hun vorming, maar ook rond de verschillende RNA-bindende eiwitten (RBP)14 is, inderdaad bekend is dat ze kunnen behouden van RNA doelen binnen de nucleus15 . De vorming van paraspeckles wordt bereikt door de vereniging van de verschillende onderdelen. Deze formatie werd aangetoond dat een circadiane ritmisch patroon rijden een ritmische nucleaire eigendomsvoorbehoud RNA doelen13weergeven. De nucleaire retentie van RNA doelstellingen door paraspeckles kan optreden door middel van binding aan RBP of rechtstreeks via RNA/RNA vereniging, maar de omvang van de RNAs doelwit van paraspeckles moest worden bepaald. Identificeren van het RNA gericht direct of niet indirect door Neat1, een RNA pull-down protocol werd ontworpen waarmee de isolatie en de identificatie van alle Neat1 RNA doelen in gekweekte cellen zo goed zoals in weefselmonsters (Zie Figuur 1 voor een grafische presentatie van de techniek).
Het protocol was ook succesvol toegepast op de identificatie van RNA doelen van een andere lncRNA metastase verbonden Lung adenocarcinoom Transcript 1 (Malat1). Malat1 is een zeer geconserveerde en uitgesproken lncRNA gevonden in nucleaire spikkels samen met verschillende RNA splicing factoren. Malat1 is bekend worden betrokken bij de regulering van de splicing van verschillende ontluikende pre-mRNA16,17.
Specifieke (SO) en niet-specifieke oligonucleotide (NSO) sondes werden gegenereerd met behulp van de sonde design strategie beschreven hier. Deze strategie berust op de selectie van regio's die weer een lage waarschijnlijkheid van interne base paren zoals voorspeld door de secundaire structuur van de lncRNA en het ontwerp van specifieke sondes met een sterke affiniteit voor deze regio's. Als een representatief resultaat van deze voorspellingen van bioinformatica, een beeld van de voorspelde secundaire structuur van een opeenvolging van Neat1 (nucleotiden 1.480 tot 2.000) samen met de positie van twee ontworpen zodat sondes worden gegeven in Figuur 2.
De ontworpen sondes werden omgeleid naar rat Neat1 of Malat1 voor GH4C1 gekweekte cellen en muis Neat1 voor hypofyse weefsel extracten (tabel 1). De relatieve verrijking in Neat1 of Malat1 werd berekend voor niet-specifieke en specifieke sondes ten opzichte van de invoer monsters. Figuur 3 toont de efficiëntie van de specifieke sondes naar pull-down in de rat GH4C1 hypofyse cellijn (figuur 3A) Neat1 en in muis hypofyse weefsel extracten (figuur 3B). Bij gebruik van de sonde ontwerp-protocol voor het genereren van specifieke oligonucleotide (dus) sondes gericht aan Malat1, verwijderd een efficiënte sonde werd verkregen, terwijl andere niet efficiënt genoeg was en was (figuur 4A).
Na een RNA pull-down procedure gevolgd door RT-qPCR experimenten, sommige RNAs beoordeeld met specifieke primers (tabel 1) bleken te worden gekoppeld aan Neat1 of Malat1 in de extracten van de GH4C1. De RNAs gekoppeld Neat1 in cel extracten van de GH4C1 werden ook getoond te worden geassocieerd met Neat1 in de extracten van de hypofyse weefsel. Inderdaad, na Neat1 RNA pull-down, Malat1 bleek te worden gericht op de Neat1, zowel in de lijn van de cel GH4C1 hypofyse muis weefsel extracten (figuur 5A). Samengebouwd, werd Neat1 aanzienlijk verrijkt na Malat1 RNA pull-down uitgevoerd met een specifieke sonde in GH4C1 cellen (figuur 4B). Door te wijzen op de nauwe relatie tussen de twee lncRNAs, deze resultaten stroken met de mogelijke verband met coregulering rol van Neat1 en Malat1, voorgesteld door Malat1 knock-out muizen die variaties in Neat1 RNA expressie18, weergeven 19. de transcripties van de twee belangrijkste hypofyse hormonen, groeihormoon (Gh) (figuur 5B) en prolactine (Prl) (figuur 5C) werden aanzienlijk verrijkt na Neat1 RNA pull-down met specifieke sondes in zowel de GH4C1 cellen en de hypofyse extracten, hetgeen wijst op een mogelijke regulering van de twee hormonen door Neat1. Bij het vergelijken van de twee specifieke sondes gebruikt, is het bleek dat hun efficiëntie afhankelijk van het RNA doelwit beschouwd (figuur 5B en figuur 5C variëren kan). Deze resultaten wijzen op de noodzaak van het ontwerpen van verschillende specifieke sondes om te selecteren die niet alleen de beste efficiëntie in de verrijking van de lncRNA van de pull-down, maar ook de beste efficiëntie in de verrijking van de RNA-doelstellingen weer te geven.
De RNA pull-down methode kan ook worden gevolgd door RNA high-throughput sequentiebepaling te verkrijgen van de uitgebreide lijst met RNA doelen van een lncRNA van belang13. Een analyse van de RNA-seq op GH4C1 hypofyse cellen na Neat1 RNA pull-down met behulp van de twee specifieke sondes die hierboven beschreven werd uitgevoerd. Opgemerkt moet worden dat een negatieve controle met behulp van een NSO kan ook onderhevig zijn aan RNA-seq analyse, als het niveau van RNA hersteld nadat de RNA pull-down met NSO voldoende is om de bouw van bibliotheken. Dit was niet het geval in eerdere ervaring13. Bibliotheken die zijn gegenereerd na het gebruik van specifieke sondes zijn geanalyseerd met behulp van Tophat/Manchetknopen pijpleiding20 en alleen chat-kopieën met de waarden van fragment per kilobase per miljoen van toegewezen luidt (FPKM) hoger dan 1 in aanmerking werden genomen. De lijsten verkregen met de twee specifieke sondes gericht aan Neat1 (tabel 1) werden gekruist om te beoordelen van het specifieke karakter van de resultaten. 4,268 genen werden gevonden die zijn gekoppeld aan paraspeckles, die 28 procent van de geuite afschriften in GH4C1 cellen13vertegenwoordigd. Overeen met resultaten die zijn verkregen met behulp van qPCR analyse (Figuur 5A-C), de transcripties van Gh, Prl en Malat1 bleken te zijn gekoppeld aan Neat1. Daarom is de RNA pull-down methode gebleken een efficiënt hulpmiddel om het verkennen van de interactie tussen lncRNAs en de bijbehorende doelen van RNA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57379/57379fig1v2.jpg"> Figuur 1: grafische weergave van het RNA pull-down procedure. Op de eerste dag, waren cellen of weefsels kruiselings gekoppelde met paraformaldehyde lysed en sonicated vóór de kruising stap die werd uitgevoerd door het toevoegen van biotinyleerd specifieke sondes. Magnetische daar kralen werden vervolgens toegevoegd aan specifiek materiaal gescheiden van de rest van de cel lysate. Op de tweede dag, waren de kralen geïsoleerd door een magneet en meerdere keren gewassen. De stap van een de-crosslinking toegestaan herstel van RNAs die werden gezuiverd en gebruikt voor RT-qPCR of RNA-seq analyse. <a href="/files/ftp_upload/57379/57379fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57379/57379fig2.jpg"> Figuur 2: secundaire structuur van een Neat1-reeks (nucleotide 1.480 tot 2.000) zoals voorspeld door bioinformatics resource (de RNAstructure-webserver; laagste vrije energie structuur). De structuur is gekleurd volgens de mate van waarschijnlijkheid van base-paring. De twee oligonucleotides sondes (SO1 en SO2) in het rood zijn geplaatst langs de Neat1 RNA-structuur. <a href="/files/ftp_upload/57379/57379fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57379/57379fig3.jpg"> Figuur 3: qPCR validatie van Neat1 verrijking versus input. qPCR valideren van de verrijking van de Neat1 tegenover ingang na Neat1 RNA pull-down door twee verschillende specifieke sondes (SO1-rn en SO2-rn voor GH4C1 cellen en SO1-mm en SO2-mm voor de hypofyse weefsel) in vergelijking met een niet-specifieke (NSO-rn voor GH4C1 cellen en NSO-mm voor hypofyse weefsel) extracten in GH4C1 rat cellen (A) en in muis hypofyse weefsel (B). Resultaten zijn gemiddelde ± SEM verkregen in 3 tot 10 experimenten. <a href="/files/ftp_upload/57379/57379fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57379/57379fig5.jpg">
Figuur 4: qPCR validatie van Malat1 en Neat1 verrijking versus input na Malat1 RNA pull-down. qPCR validatie van Malat1 (A) en Neat1 (B) verrijking versus input na Malat1 RNA pull-down door twee verschillende specifieke sondes (SO3-rn en SO4-rn) in vergelijking met een niet-specifieke een (NSO-rn) in GH4C1 rat cellen. Resultaten zijn gemiddelde ± SEM verkregen in 3 experimenten. <a href="/files/ftp_upload/57379/57379fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57379/57379fig4.jpg"> Figuur 5: qPCR validatie van Malat1, Gh, verrijking van de Prl versus input nadat Neat1 RNA pull-down. qPCR validatie van Malat1 (A), Gh (B), Prl (C) verrijking versus input na Neat1 RNA pull-down met behulp van verschillende specifieke sondes in vergelijking met een niet-specifieke GH4C1 rat cellen en muis hypofyse weefsel extracten. Resultaten zijn gemiddelde ± SEM verkregen in experimenten van 3 tot en met 8. <a href="/files/ftp_upload/57379/57379fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>SONDE NAMEN</td>
			<td colspan="2">Sequenties</td>
		</tr>
<tr>
<td>NSO-Rn</td>
			<td colspan="2">TAAAATACCATTTGATGTTTGAAATTAT</td>
		</tr>
<tr>
<td>SO1-Rn</td>
			<td colspan="2">CTCCACCATCATCAATCCTCTGGAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>SO2-Rn</td>
			<td colspan="2">GCCTTCCCACATTTAAAAACACAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>SO3-Rn</td>
			<td colspan="2">AACTCGTGGCTCAAGTGAGGTGACA</td>
		</tr>
<tr>
<td>SO4-Rn</td>
			<td colspan="2">AAGACTCTCAGGCTCCTGCTCATTC</td>
		</tr>
<tr>
<td>NSO-mm</td>
			<td colspan="2">GTTTGTGGTTTAACAGTGGGAAGGC</td>
		</tr>
<tr>
<td>SO1-mm</td>
			<td colspan="2">GCCTTCCCACTGTTAAACCACAAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>SO2-mm</td>
			<td colspan="2">CTCACCCGCACCCCGACTCCTTCAA</td>
		</tr>
<tr>
<td>qPCR PRIMERS:</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td>Rattus norvegicus</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Neat1</td>
			<td colspan="2">AAGGCACGAGTTAGCCGCAAAT</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">TGTGCACAGTCAGACCTGTCATTC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Malat1</td>
			<td colspan="2">GAAGGCGTGTACTGCTATGCTGTT</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">TCTCCTGAGGTGACTGTGAACCAA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Gh1</td>
			<td colspan="2">CCGCGTCTATGAGAAACTGAAGGA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">GGTTTGCTTGAGGATCTGCCCAAT</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Parti réformateur libéral</td>
			<td colspan="2">TGAACCTGATCCTCAGTTTGGT</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">AGCTGCTTGTTTTGTTCCTCAA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mus musculus</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Neat1</td>
			<td colspan="2">TGGGCCCTGGGTCATCTTACTAGATA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CACAGCTGTTCCAATGAGCGATCT</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Gh1</td>
			<td colspan="2">CTCGGACCGTGTCTATGAGAAACTGA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">TTTGCTTGAGGATCTGCCCAACAC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Parti réformateur libéral</td>
			<td colspan="2">TGAACCTGATCCTCAGTTTGGT</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">AGCTGCTTGTTTTGTTCCTCAA</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Opeenvolgingen van DNA oligonucleotide sondes en qPCR primers

Deze RNA pull-down methode kunt identificeren van de RNA-doelstellingen van een lang niet-coderende RNA (lncRNA). Gebaseerd op de kruising van zelfgemaakte, ontworpen anti-zin DNA oligonucleotide sondes specifiek voor deze lncRNA in een passende vaste weefsel of cellijn, hierdoor efficiënt de opname van alle RNA doelen met de lncRNA.

RNA Pull-down te identificeren van RNA doelen van een lang niet-coderende RNA Procedure

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Het algemene doel van deze procedure is om in gekweekte cellen of in weefsel, de RNA-moleculaire partners van een lang non-coderend RNA van belang te identificeren. Deze methode kan helpen om de biologische functies van een lang non-coderend RNA te ontcijferen door nieuwe belangrijke kennis te verschaffen over RNA-regulatie door lang non-coderend RNA. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het bruikbaar is voor de meeste toepassingen omdat we het hebben geoptimaliseerd, eerst voor verschillende lange non-coderende RNA's en ten tweede voor zowel gekweekte cellen als weefselextracten.Onze methode is gebaseerd op de mix van twee eerdere methoden, de ChIRP, wat staat voor Chromatin Isolation by RNA Purifications, en de CHART, wat staat voor Capture Hybridization Analysis of RNA Targets. De specificiteit van onze methode is dat de oligonucleotide-sondes zijn ontworpen met behulp van bio-informaticamodellering van een secundaire structuur van een lang non-coderend RNA en het doel was om de RNA-doelen te identificeren. Het demonstreren van de procedure zullen twee technici van mijn team zijn, Benedicte Boyer en Severine Guillen.Na het kweken van GH4C1-cellen volgens het tekstprotocol, verwijder het medium van een celcultuurplaat en gebruik één volume PBS om de cellen te spoelen. Voeg 10 milliliter 1%PFA in PBS toe om de cellen te fixeren. Kruis vervolgens de cellen onder agitatie bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.Doe de PFA-werking uit door 1 milliliter 1,25 molair glycine toe te voegen en agiteer het monster bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Gooi vervolgens de oplossing weg door aspiratie en gebruik 10 milliliter PBS om de plaat twee keer te spoelen gedurende vijf minuten elk. Voeg vervolgens één milliliter PBS toe, gebruik een celschraper om cellen te verzamelen en breng ze over naar een centrifugeerbuis.Centrifugeer het monster gedurende vijf minuten bij 510 g en vier graden Celsius. Verwijder vervolgens zoveel supernatant mogelijk en bewaar de pellets onbeperkt bij min 80 graden Celsius. Om weefselkruisverbinding uit te voeren, dompel vijf milligram vers verkregen muis hypofyse weefsel onder in een 10X volume van 1%PFA in PBS en agiteer het monster bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.Doe de PFA uit door 0,05 milliliter 1,25 molair glycine-oplossing toe te voegen en agiteer het weefsel bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Aspireer het medium en gebruik 0,5 milliliter PBS om het weefsel twee keer te spoelen. Na het verwijderen van zoveel supernatant mogelijk, bewaar het gekruiste weefsel onbeperkt bij min 80 graden Celsius.Bereid vervolgens de lysisbuffer om monsters te lyseren zonder vooraf te ontdooien. Gebruik de buffer om monsters te resuspenderen in ongeveer één milliliter per 100 milligram celpellet of weefsel. Plaats de geliseerde monsters in een waterbad van vier graden Celsius en start de sonicatieserie geoptimaliseerd volgens het tekstprotocol.Direct na sonicatie, centrifugeer de monsters gedurende vijf minuten bij 12.000 g en vier graden Celsius. Breng vervolgens de supernatanten over in nieuwe buisjes. De sonicatieserie moet worden geoptimaliseerd om efficiënt genoeg te zijn om de viscositeit van het DNA te verminderen zonder andere gefragmenteerde RNA's te verkrijgen.Voer hybridisatie uit op de gesoniceerde monsters door twee volumes hybridisatiebuffer toe te voegen aan de buisjes en te vortexen. Breng 20 microliter van elk monster over in centrifugeerbuisjes en bewaar bij min 20 graden Celsius. Voeg 100 picomolen biotinyleerde oligonucleotide-sondes toe aan elk monster.Bekijk vervolgens de monsters onder matige agitatie op een buisrotator bij kamertemperatuur gedurende vier tot zes uur. Voeg na de incubatie 50 microliter magnetische streptavidine-kralen toe aan de monsters, aangevuld met 200 eenheden per milliliter van een RNase-remmeroplossing en een 5 microliter per milliliter proteaseremmercocktail. Incubeer de buisjes bij kamertemperatuur onder matige agitatie op de buisrotator gedurende een nacht.De volgende dag voert u RNA-isolatie uit door de buisjes op een magnetische ondersteuning te plaatsen en de supernatant weg te gooien. Voeg vervolgens 900 microliter wasbuffer toe aan de kralen en plaats de buisjes op een rotator bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Plaats vervolgens de monsters op de magneet, gooi de buffer weg en herhaal de wassing vijf keer.Na het verwijderen van de laatste wassing, voeg 95 microliter Proteinase K-buffer en vijf microliter 20 milligram per milliliter proteinase-K toe aan het monster. Ontdooi vervolgens de inputmonsters op ijs en voeg 75 microliter Proteinase K-buffer en vijf microliter proteinase-K toe. Incubeer de monsters gedurende 45 minuten bij 50 graden Celsius en vervolgens gedurende 10 minuten bij 95 graden Celsius.Koel de monsters gedurende drie minuten op ijs, plaats ze vervolgens op de magneet en verzamel het supernatant met de RNA's en gooi de kralen weg. Gebruik een RNA-zuiveringskit om de RNA's te zuiveren. Bewaar tenslotte de RNA's bij min 80 graden Celsius en voer RT en qPCR uit en bouw DNA-bibliotheken op volgens het tekstprotocol.Op basis van bio-informaticamodellering van de secundaire structuur van lncRNA, hier geïllustreerd, zijn sondes ontworpen tegen twee lncRNA's, ratten Neat1 of Malat1 voor gekweekte GH4C1-cellen en muis Neat1 voor hypofyseweefselextracten. De relatieve verrijking van Neat1 of Malat1 werd berekend voor niet-specifieke en specifieke sondes in verhouding tot de inputmonsters. Deze figuur toont de efficiëntie van de specifieke sondes om Neat1 in de rat GH4C1-hypofysecellijn en in muishypofysetweefselextracten naar beneden te trekken.Toen het protocol voor specifieke oligonucleotiden of SO-sondes werd gericht op Malat1, werd één efficiënte sonde gegenereerd samen met één inefficiënte sonde die werd weggegooid. Na RNA-pull-downs en RT qPCR, waren de RNA's geassocieerd met Neat1 in GH4C1-celextracten ook geassocieerd met Neat1 in hypofysetweefselextracten. Inderdaad, na Neat1 RNA-pull-down werd Malat1 gevonden om door Neat1 te worden getargetet zowel in de GH4C1-cellijn als in hypofysemuisweefselextracten.Bovendien was

rna-pull-down-procedure-to-identify-rna-targets-long-non-coding

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Vanwege het tijdelijke karakter van de pre-mRNA, kan het moeilijk zijn te isoleren en te...

Een snelle High-throughput Methode voor Mapping Ribonucleoproteins (RNP&#39;s) op de menselijke pre-mRNA

Een stap voor stap-protocol om het isoleren en identificeren van RNA bijbehorende complexen door middel van RIP-Chip.

Werkwijze voor het isoleren en identificeren van mRNAs, microRNA en eiwitcomponenten van ribonucleoproteïne complexen uit celextracten met RIP-Chip

Luminofore identificatie van functionele elementen in 3’ niet-getransleerde gebieden (3’UTR's) (3’LIFE) is een techniek om functionele regulatie in 3’UTR's door miRNA's of andere regulerende factoren te identificeren. Dit protocol maakt gebruik van high-throughput methodologie zoals 96-well transfectie en luciferase assays om honderden vermeende interacties voor functionele repressie te screenen.

Detectie van miRNA Doelen in High-throughput Met de 3&#39;LIFE Assay

Een RNA-pull-down protocol is hier geoptimaliseerd voor detectie van interacties tussen RNA-bindende eiwitten (RBPs) en niet-coderende en coderende RNAs. Een RNA fragment uit androgeenreceptor (AR) werd gebruikt als een voorbeeld om te demonstreren hoe de RBP halen uit lystate primaire bruine adipocyten.

Detectie van RNA-bindende eiwitten door<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA Pull-down in Adipocyte Cultuur

Dit manuscript beschrijft een aanpak om selectieve cognate RNP's te isoleren die in eukaryote cellen worden gevormd via een specifieke oligonucleotide-gestuurde verrijking. We tonen de toepasbaarheid van deze aanpak door een cognate RNP te isoleren die gebonden is aan het retrovirale 5' niet-vertaalde gebied dat is samengesteld uit DHX9/RNA-helicase A.

Isolatie van Cognate RNA-eiwitcomplexen van cellen met behulp van oligonucleotide-gerichte Elution

RNA-eiwitinteracties liggen aan de basis van veel cellulaire processen. Hier beschrijven we een in vivo methode om specifiek RNA te isoleren en nieuwe eiwitten te identificeren die ermee geassocieerd zijn. Dit kan nieuw licht werpen op hoe RNA's in de cel worden gereguleerd.

Novel-RNA-bindende eiwitten Isolatie door de snelle Methodologie

We beschrijven een protocol te identificeren van RNA-bindende proteÃ¯nen en kaart van de regio's hun RNA-bindende in levende cellen met behulp van UV-gemedieerde photocrosslinking en massaspectrometrie.

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

Dit verslag wordt een snelle en betrouwbare methode voor het valideren van mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs beschreven. Het gebruik van de methode synthetische biotinyleerd vergrendeld nucleïnezuur LNA gebaseerde miRNA bootst te vangen target mRNA. Vervolgens daar beklede magnetische kralen pulldown worden gebruikt de doelstelling mRNA voor kwantificering van qPCR polymerase-kettingreactie.

Biotine gebaseerde Pulldown Assay te valideren mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs

Een tandem RNA isolatie procedure (reis) voor herstel van endogeen gevormde mRNA-eiwitcomplexen wordt beschreven. Specifiek, RNA-eiwitcomplexen kruisverwijzende in vivo, polyadenylated RNAs zijn geïsoleerd uit extracten met oligo(dT) kralen en bepaalde mRNAs met gemodificeerde RNA antisense oligonucleotides worden vastgelegd. Eiwitten gebonden aan mRNAs worden gedetecteerd door analyse van de immunoblot.

Een Oligonucleotide gebaseerde Tandem RNA isolatie Procedure om te herstellen van eukaryotische mRNA-eiwitcomplexen

Hier presenteren we een geoptimaliseerde in vitro methode om eiwitinteractoren van specifieke RNA-sequenties te ontdekken, kwantificeren en valideren, met behulp van totaal eiwitextract uit menselijke cellen, streptavidineparels bedekt met gebiotinyleerd RNA en massaspectrometrie-analyse.

Een geoptimaliseerde kwantitatieve pull-down analyse van RNA-bindende eiwitten met behulp van kort gebiotinyleerd RNA

Leer RNA pull-down om RNA-doelen van lange niet-coderende RNA's te identificeren met behulp van biotin-gemerkte antisense-oligonucleotideprobes. Deze methode combineert ChIRP- en CHART-technieken voor zowel gekweekte cellen als weefselextracten.

RNA Pull-down te identificeren van RNA doelen van een lang niet-coderende RNA Procedure

Meer video's verkennen