RNA Pull-down te identificeren van RNA doelen van een lang niet-coderende RNA Procedure
10 april 2018
Deze RNA pull-down methode kunt identificeren van de RNA-doelstellingen van een lang niet-coderende RNA (lncRNA). Gebaseerd op de kruising van zelfgemaakte, ontworpen anti-zin DNA oligonucleotide sondes specifiek voor deze lncRNA in een passende vaste weefsel of cellijn, hierdoor efficiënt de opname van alle RNA doelen met de lncRNA.
Het algemene doel van deze procedure is om in gekweekte cellen of in weefsel, de RNA-moleculaire partners van een lang non-coderend RNA van belang te identificeren. Deze methode kan helpen om de biologische functies van een lang non-coderend RNA te ontcijferen door nieuwe belangrijke kennis te verschaffen over RNA-regulatie door lang non-coderend RNA. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het bruikbaar is voor de meeste toepassingen omdat we het hebben geoptimaliseerd, eerst voor verschillende lange non-coderende RNA's en ten tweede voor zowel gekweekte cellen als weefselextracten.
Onze methode is gebaseerd op de mix van twee eerdere methoden, de ChIRP, wat staat voor Chromatin Isolation by RNA Purifications, en de CHART, wat staat voor Capture Hybridization Analysis of RNA Targets. De specificiteit van onze methode is dat de oligonucleotide-sondes zijn ontworpen met behulp van bio-informaticamodellering van een secundaire structuur van een lang non-coderend RNA en het doel was om de RNA-doelen te identificeren. Het demonstreren van de procedure zullen twee technici van mijn team zijn, Benedicte Boyer en Severine Guillen.
Na het kweken van GH4C1-cellen volgens het tekstprotocol, verwijder het medium van een celcultuurplaat en gebruik één volume PBS om de cellen te spoelen. Voeg 10 milliliter 1%PFA in PBS toe om de cellen te fixeren. Kruis vervolgens de cellen onder agitatie bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
Doe de PFA-werking uit door 1 milliliter 1,25 molair glycine toe te voegen en agiteer het monster bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Gooi vervolgens de oplossing weg door aspiratie en gebruik 10 milliliter PBS om de plaat twee keer te spoelen gedurende vijf minuten elk. Voeg vervolgens één milliliter PBS toe, gebruik een celschraper om cellen te verzamelen en breng ze over naar een centrifugeerbuis.
Centrifugeer het monster gedurende vijf minuten bij 510 g en vier graden Celsius. Verwijder vervolgens zoveel supernatant mogelijk en bewaar de pellets onbeperkt bij min 80 graden Celsius. Om weefselkruisverbinding uit te voeren, dompel vijf milligram vers verkregen muis hypofyse weefsel onder in een 10X volume van 1%PFA in PBS en agiteer het monster bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
Doe de PFA uit door 0,05 milliliter 1,25 molair glycine-oplossing toe te voegen en agiteer het weefsel bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Aspireer het medium en gebruik 0,5 milliliter PBS om het weefsel twee keer te spoelen. Na het verwijderen van zoveel supernatant mogelijk, bewaar het gekruiste weefsel onbeperkt bij min 80 graden Celsius.
Bereid vervolgens de lysisbuffer om monsters te lyseren zonder vooraf te ontdooien. Gebruik de buffer om monsters te resuspenderen in ongeveer één milliliter per 100 milligram celpellet of weefsel. Plaats de geliseerde monsters in een waterbad van vier graden Celsius en start de sonicatieserie geoptimaliseerd volgens het tekstprotocol.
Direct na sonicatie, centrifugeer de monsters gedurende vijf minuten bij 12.000 g en vier graden Celsius. Breng vervolgens de supernatanten over in nieuwe buisjes. De sonicatieserie moet worden geoptimaliseerd om efficiënt genoeg te zijn om de viscositeit van het DNA te verminderen zonder andere gefragmenteerde RNA's te verkrijgen.
Voer hybridisatie uit op de gesoniceerde monsters door twee volumes hybridisatiebuffer toe te voegen aan de buisjes en te vortexen. Breng 20 microliter van elk monster over in centrifugeerbuisjes en bewaar bij min 20 graden Celsius. Voeg 100 picomolen biotinyleerde oligonucleotide-sondes toe aan elk monster.
Bekijk vervolgens de monsters onder matige agitatie op een buisrotator bij kamertemperatuur gedurende vier tot zes uur. Voeg na de incubatie 50 microliter magnetische streptavidine-kralen toe aan de monsters, aangevuld met 200 eenheden per milliliter van een RNase-remmeroplossing en een 5 microliter per milliliter proteaseremmercocktail. Incubeer de buisjes bij kamertemperatuur onder matige agitatie op de buisrotator gedurende een nacht.
De volgende dag voert u RNA-isolatie uit door de buisjes op een magnetische ondersteuning te plaatsen en de supernatant weg te gooien. Voeg vervolgens 900 microliter wasbuffer toe aan de kralen en plaats de buisjes op een rotator bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Plaats vervolgens de monsters op de magneet, gooi de buffer weg en herhaal de wassing vijf keer.
Na het verwijderen van de laatste wassing, voeg 95 microliter Proteinase K-buffer en vijf microliter 20 milligram per milliliter proteinase-K toe aan het monster. Ontdooi vervolgens de inputmonsters op ijs en voeg 75 microliter Proteinase K-buffer en vijf microliter proteinase-K toe. Incubeer de monsters gedurende 45 minuten bij 50 graden Celsius en vervolgens gedurende 10 minuten bij 95 graden Celsius.
Koel de monsters gedurende drie minuten op ijs, plaats ze vervolgens op de magneet en verzamel het supernatant met de RNA's en gooi de kralen weg. Gebruik een RNA-zuiveringskit om de RNA's te zuiveren. Bewaar tenslotte de RNA's bij min 80 graden Celsius en voer RT en qPCR uit en bouw DNA-bibliotheken op volgens het tekstprotocol.
Op basis van bio-informaticamodellering van de secundaire structuur van lncRNA, hier geïllustreerd, zijn sondes ontworpen tegen twee lncRNA's, ratten Neat1 of Malat1 voor gekweekte GH4C1-cellen en muis Neat1 voor hypofyseweefselextracten. De relatieve verrijking van Neat1 of Malat1 werd berekend voor niet-specifieke en specifieke sondes in verhouding tot de inputmonsters. Deze figuur toont de efficiëntie van de specifieke sondes om Neat1 in de rat GH4C1-hypofysecellijn en in muishypofysetweefselextracten naar beneden te trekken.
Toen het protocol voor specifieke oligonucleotiden of SO-sondes werd gericht op Malat1, werd één efficiënte sonde gegenereerd samen met één inefficiënte sonde die werd weggegooid. Na RNA-pull-downs en RT qPCR, waren de RNA's geassocieerd met Neat1 in GH4C1-celextracten ook geassocieerd met Neat1 in hypofysetweefselextracten. Inderdaad, na Neat1 RNA-pull-down werd Malat1 gevonden om door Neat1 te worden getargetet zowel in de GH4C1-cellijn als in hypofysemuisweefselextracten.
Bovendien was
Overzicht
Deze RNA pull-down methode identificeert RNA-doelen van lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) met behulp van specifieke anti-sense DNA-oligonucleïde probes. Het is toepasbaar op zowel gekweekte cellen als weefselextracten, waardoor ons begrip van RNA-regulatie wordt verbeterd.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Moleculairbiologie
- RNA-biologie
Achtergrond
- Lange niet-coderende RNA's spelen een belangrijke rol in genexpressie.
- Het begrijpen van hun RNA-partners is cruciaal voor het ontcijferen van hun biologische functies.
- Deze methode combineert elementen uit ChIRP- en CHART-technieken.
- Bioinformatica-modellering helpt bij het ontwerpen van specifieke probes voor lncRNA's.
Doel van de studie
- Om RNA-moleculaire partners van specifieke lncRNA's te identificeren.
- Om de kennis over RNA-regulatie door lncRNA's te verbeteren.
- Om een methode te optimaliseren die bruikbaar is voor verschillende toepassingen.
Gebruikte methoden
- Cross-linking van cellen en weefsel met PFA.
- Sonicatie om monsters te lyse en de viscositeit te verminderen.
- Hybridisatie van monsters met gebiotineerde oligonucleotide probes.
- RNA-isolatie en zuivering gevolgd door RT en qPCR.
Belangrijkste resultaten
- Specifieke probes trokken effectief lncRNA Neat1 aan in zowel cel- als weefselextracten.
- Malat1 werd geïdentificeerd als een doelwit van Neat1 in beide contexten.
- Co-regulatoire relaties tussen Neat1 en Malat1 werden aangetoond.
Conclusies
- Deze methode biedt een betrouwbare aanpak om lncRNA-interacties te bestuderen.
- De bevindingen suggereren belangrijke regulerende rollen voor Neat1 en Malat1.
- Verder onderzoek zou de functionele implicaties van deze interacties kunnen verduidelijken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Identifying RNA interactors of long non-coding RNAs (lncRNAs) is critical for de-risking target validation in early discovery, particularly for regulatory RNAs with poorly defined mechanisms. This pull-down method enables mechanistic interrogation of lncRNA function by mapping direct and indirect RNA partners, supporting hypothesis-driven target assessment. The approach provides predictive confidence in target selection by revealing co-regulatory networks that may influence disease-relevant pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of lncRNA-mediated regulatory hypotheses by identifying associated RNA molecular partners.
- Operational Value: Uses bioinformatics-guided probe design to increase specificity and reduce false-positive interactions in target validation workflows.
- Predictive Value: Supports target de-risking by revealing co-regulatory lncRNA relationships, such as Neat1-Malat1, that may influence phenotypic outcomes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates purified RNA complexes suitable for downstream quantitative analysis, including RT-qPCR and high-throughput sequencing.
- Reproducibility: Standardized cross-linking and wash conditions improve consistency across cell and tissue models, supporting assay transferability.
- Scalability: Compatible with both cultured cells and tissue extracts, enabling flexible application across discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Demonstrated applicability in both rat cell lines and mouse tissue extracts supports cross-species target validation.
- Mechanistic De-risking: Identification of functionally relevant RNA partners, such as Malat1 as a Neat1 target, aids in prioritizing lncRNAs with regulatory impact.
- Predictive Biomarker Alignment: RNA interactome data can inform biomarker strategies when linked to disease-associated expression patterns.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target identification to lead optimization, providing RNA interaction data that informs target suitability and mechanistic rationale.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing RNA-based mechanisms of lncRNA action, reducing ambiguity in target function.
- Screening: Outputs purified RNA fractions amenable to quantitative profiling, enabling scalable evaluation of lncRNA interactors.
- Analytics: Enables quantitative measurement of RNA enrichment (e.g., via qPCR or sequencing) to compare specific versus control probe conditions.
- Translational Research: Demonstrated consistency between cell and tissue models supports extrapolation to preclinical systems.
- Enterprise Reuse: Standardized probe design and hybridization workflow allows reuse across multiple lncRNA targets with minimal reoptimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic uncertainty in lncRNA target validation by defining RNA interaction networks.
- Operational Value: Standardized fixation, lysis, and hybridization steps enhance reproducibility across laboratories and sample types.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by revealing whether a lncRNA engages in functionally relevant RNA-mediated regulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of lncRNA targets based on demonstrated interactome complexity and disease relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lncRNA bioinformatics to model secondary structure and design effective antisense probes.
- Dependent on access to sonication equipment optimized to reduce viscosity without excessive RNA fragmentation.
- Necessitates standardized cross-linking and quenching protocols to preserve native RNA-protein-RNA interactions.
- Adaptation across model systems may require validation of fixation efficiency and probe accessibility.
- Practical limitation: Probe efficiency can vary with lysate conditions, necessitating empirical testing of multiple candidates.
