Adeno-associated Virus-gemedieerde transgenic expressie in genetisch gedefinieerde neuronen van het ruggenmerg
12 mei 2018
Intraspinal injectie van recombinase afhankelijk recombinante adeno-associated virus (rAAV) kan worden gebruikt om te manipuleren alle genetisch gelabelde celtype in het ruggenmerg. Hier beschrijven we hoe transduce van neuronen in de dorsale Hoorn van het lumbale ruggenmerg. Deze techniek maakt functionele ondervraging van het subtype gemanipuleerde neuron.
Het algemene doel van intraspinale toediening van recombinante adeno-geassocieerde virussen is om de histologische markering en functionele manipulatie van genetisch gedefinieerde neuronen in het dorsale ruggenmerg mogelijk te maken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van pijn, zoals welke neuronale circuits nodig zijn voor de perceptie van verschillende pijnmodaliteiten. Het grote voordeel van deze techniek is dat genetisch gelabelde neuronen op een speciaal beperkte en tijdelijk gecontroleerde manier kunnen worden gemanipuleerd.
Lokaliseer het meest caudale ribbenpaar door te palperen langs de wervelkolom van de verdoofde muis. Maak vervolgens een longitudinale snede van 1,5 tot 2,5 centimeter in de huid, beginnend net rostrale van het meest caudale ribbenpaar. Til de huid op met pincetten en los deze los van de onderliggende spier met een schaar.
Gedurende de hele operatie de blootgestelde weefsels vochtig houden met steriele 0,9% natriumchloride. Maak met behulp van fijne pincetten en kleine schaar een incisie in de dunne vliezige laag, direct naast de middenlijn, en snijd deze los van de doornuitsteeksels. Verschillende anatomische kenmerken kunnen helpen bij het identificeren van de juiste wervels om te targeten.
Hier beschrijven we drie alternatieven. Palpeer langs de wervelkolom. Het meest caudale ribbenpaar bevindt zich net rostrale van de T13-wervel en het bekkenbeen op heupniveau bevindt zich op het niveau van de L6-wervel.
Alternatief kan de huid naar de staart worden getrokken om de crista iliaca bloot te leggen. Op hetzelfde niveau sluiten de meest caudale zichtbare intertransversale ligamenten zich aan bij het L6-werveluitsteeksel. Tel achteruit in caudale naar rostrale richting om de wervels van belang te identificeren.
Anders lokaliseert u de plek waar de pees langs de zijkant van de wervelkolom het witste en meest mediale is. De T13-wervel bevindt zich net rostrale. Het lumbale ruggenmergsegment L4 bevindt zich binnen deze wervel.
Plaats het dier vervolgens op een kussen van opgerold weefsel om het naar de spinale klemmen van het stereotactische frame te tillen. Lijn de klemmen uit naast de doelwervels. Fixeer één klem in positie, houd vervolgens de wervelkolom vast met Adson-pincetten terwijl u de tweede klem fixeert.
Bevestig de juiste klemming door voorzichtig op de beoogde wervels te drukken. Verwijder vervolgens de paraspinale spier boven de wervels van belang. Maak eerst een incisie net mediaal van de pezen, parallel aan de wervelkolom.
Maak vervolgens loodrechte insnijdingen rostrale en caudale van de doelwervels. Gebruik vervolgens ronguiers om de paraspinale spier boven de gewenste wervels los te scheuren of weg te snijden. Gebruik pincetten indien nodig om weefsel te verwijderen dat op de wervels of boven de dura in de intravertebrale ruimte achterblijft.
Het dorsale bloedvat zou nu zichtbaar moeten zijn, waarmee de middenlijn van het ruggenmerg wordt gemarkeerd. Voor unilaterale injecties voert u een gedeeltelijke laminectomie uit met behulp van een fijne tandborstelboor voorzien van een 0,5 millimeter bolle frees om zeer voorzichtig een gat in het midden van de doelzijde van de wervels te boren. Verwijder eventuele resterende botfragmenten met een 26 gauge afgeschuinde naald om het ruggenmerg bloot te leggen.
Gebruik de naald om de dura in de intravertebrale ruimtes rostrale en caudale van de doelwervels te doorboren, ongeveer 300 micron lateraal van het dorsale bloedvat. Boor vervolgens de dura onder het geboorde gat. Op dit punt zou hersenvocht uit de gaten moeten ontsnappen en moet het ruggenmerg licht uitpuilen.
Bereid de injectiespuit voor door eerst de glazen capillair op een microliter spuit te monteren. Draai de moer stevig vast om een strakke en veilige pasvorm te garanderen. Vul de microliter spuit met steriele gedistilleerd water en druk vervolgens op de zuiger.
Als het water niet gemakkelijk uit de punt wordt geperst, is de micropipet waarschijnlijk geblokkeerd en moet deze worden vervangen. Monteer de spuit op een micromanipulator verbonden met een elektronisch bestuurde micro-injector. Gebruik vervolgens de micro-injector om ongeveer een microliter lucht op te trekken om het water en het virus te scheiden.
Pipetteer vervolgens een druppel van 2,5 microliter verdunde virusoplossing op een stuk paraffinefilm. Beweeg voorzichtig de punt van de micropipet in de druppel en trek hem op in de micropipet met behulp van het stereotactische frame. Druk vervolgens op dispenseren tot er een druppel virusoplossing uit de punt komt.
Trek de spuit terug en gebruik een pen om de micropipet met een schaal te markeren om het gedispenseerd volume te controleren. Gebruik de stereotactische arm om de punt van de micropipet over een van de gaten in de dura te bewegen en vervolgens omlaag totdat er een lichte verdieping op het oppervlak van het blootgestelde ruggenmerg verschijnt. Om de injectie naar de dorsale hoef van het ruggenmerg te richten, beweegt u de punt naar een diepte van 500 micron in stappen van 100 micron en vervolgens 200 micron omhoog om mechanische stabilisatie van het weefsel mogelijk te maken.
De uiteindelijke diepte van de punt is 300 micron. Nadat u de pomp hebt geprogrammeerd om 300 nanoliter te injecteren met een injectiesnelheid van 50 nanoliter per minuut, drukt u op de startknop om de infusie te starten. Nadat de injectie is voltooid, controleert u de schaal op de micropipet om te zien of het virusniveau is gedaald.
Laat de micropipet nog drie minuten op zijn plaats om de druk te laten stabiliseren. Trek na drie minuten langzaam de micropipet terug en herhaal vervolgens de procedure voor de andere twee injectieplaatsen. Verwijder na de laatste injectie de spinale klemmen en het kussen onder de muis.
Sluit de incisielaagjes met onderbroken hechtingen, waarbij de oppervlakkige weefsellagen worden gehecht met absorbeerbare hechtdraad en de huid met niet-absorbeerbare hechtdraad. Breng jodiumdesinfectiemiddel aan op de gehechte wond. Beëindig de anesthesie en laat het die
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft de methode voor intraspinale injectie van recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) om genetisch gelabelde neuronen in het lumbale ruggenmerg te manipuleren. De studie richt zich op de transductie van neuronen in de achterhoorn, wat een hulpmiddel biedt voor functionele ondervraging van specifieke neuron-subtypen die betrokken zijn bij pijnperceptie.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschap
- Pijnonderzoek
- Genetische manipulatietechnieken
Achtergrond
- Intraspinale toediening van rAAV maakt specifieke targeting van genetisch gedefinieerde neuronen mogelijk.
- Deze benadering vergroot het begrip van neurale circuits bij pijnperceptie.
- Functionele manipulatie van neuronen kan temporeel worden aangestuurd.
- De techniek is veelbelovend voor de verdere ontwikkeling van modellen voor pijnmechanismen.
Doel van de studie
- Om een methode te beschrijven voor de transductie van neuronen in het lumbale ruggenmerg.
- Om het onderzoek naar pijnmodaliteiten via manipulatie van neuronale circuits te faciliteren.
- Om een betrouwbaar chirurgisch protocol voor het ruggenmerg bij muizen te bieden.
Gebruikte methoden
- De methode omvat intraspinale injectie van rAAV in het lumbale ruggenmerg van muizen.
- De identificatie van de doelwervels wordt uitgevoerd via anatomische referentiepunten.
- De injectiediepte en het volume worden nauwkeurig gecontroleerd voor precisie.
- Postoperatief onderzoek van het spinale weefsel is essentieel om succesvolle transductie te verifiëren.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt een precieze afgifte van virale vectoren aan specifieke neuronpopulaties mogelijk.
- Het waarborgt minimale weefselschade terwijl een effectieve gentransfer wordt gerealiseerd.
- Het vergemakkelijkt de kwantificering en het onderzoek van virale expressieniveaus.
- Het benadrukt het potentieel van deze techniek voor het onderzoeken van pijncircuits.
Conclusies
- Deze studie demonstreert een waardevolle techniek voor het bestuderen van neuronen in het ruggenmerg.
- Het maakt een gerichte functionele analyse van pijnbanen in diermodellen mogelijk.
- De methode biedt inzicht in neuronale mechanismen die relevant zijn voor het begrijpen van pijnperceptie.
Veelgestelde Vragen
Industriële Relevantie
Precieze manipulatie van genetisch gedefinieerde spinale neuronen met behulp van rAAV maakt gerichte analyse van sensorische paden mogelijk, wat bijdraagt aan mechanistische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase. Deze aanpak vergroot de voorspellende betrouwbaarheid bij de validatie van targets voor pijn- en sensorisch onderzoek, waardoor de afhankelijkheid van complexe transgene modellen wordt verminderd. De methode stroomlijnt de triage van portfolio's door snelle, locatie-specifieke functionele studies in ziekterelevante systemen mogelijk te maken.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt functionele ondervraging mogelijk van specifieke neurale circuits die betrokken zijn bij sensorische verwerking en pijn.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door tijdelijk en ruimtelijk beperkte genexpressie in gedefinieerde celpopulaties mogelijk te maken.
- Faciliteert snelle hypothese-toetsing zonder dat er meerdere transgene lijnen gegenereerd hoeven te worden.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde neuronale systemen voor op vervolgonderzoeken naar gedrag en zintuiglijke waarneming.
- Ondersteunt een reproduceerbare, kwantitatieve beoordeling van transgene expressie en neuronale manipulatie.
- Maakt schaalbare evaluatie van meerdere reporter- of effectorconstructen in een enkele genetische achtergrond mogelijk.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelevante sensorische pathways voor translationele biomarker-exploratie.
- Biedt continuïteit van genetische manipulatie naar gedragsfenotypering in preklinische modellen.
- Vermindert biologische risico's in een laat stadium door de mechanistische rollen van getargete neuronpopulaties te verduidelijken.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze rAAV-gemedieerde methode voor transgeen-aflevering integreert op het snijvlak van vroege ontdekking en preklinische validatie, waardoor de identificatie van genetische targets wordt verbonden met de beoordeling van functionele uitkomsten.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesegestuurd testen van neuronale functies in gedefinieerde spinale circuits.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve readouts van transgene expressie en gedragsrespons.
- Analytiek: Maakt directe vergelijking mogelijk tussen gemanipuleerde en controle-neuronale populaties met behulp van histologische en gedragsmatige metrieken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt genetische manipulatie met fenotypische outputs die relevant zijn voor pijn- en sensorische aandoeningen.
- Bedrijfsmatig hergebruik: Biedt een modulair platform voor het testen van diverse genetische constructen over meerdere neuronale subtypen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie en het mechanistische begrip van sensorische paden.
- Operationele waarde: Stroomlijnt workflows door de noodzaak voor complexe kweekstrategieën te verminderen en locatie-specifieke manipulatie mogelijk te maken.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming door het leveren van snelle, robuuste functionele gegevens in relevante modellen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van targets en versnelt de voortgang van gevalideerde kandidaten.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in stereotaxische chirurgie en intraspinale injectietechnieken.
- Vereist toegang tot micro-injectie-instrumentatie en infrastructuur voor histologische analyse.
- Standaardprotocollen zijn noodzakelijk voor reproduceerbaarheid tussen onderzoeksteams.
- Aanpassing aan andere modelsystemen kan anatomische en procedurele optimalisatie vereisen.
- Variabiliteit in de expressie van het reportergen en de chirurgische complexiteit moeten worden beheerst voor consistente resultaten.
