Name: Adeno-associated Virus-gemedieerde transgenic expressie in genetisch gedefinieerde neuronen van het ruggenmerg (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Leer intraspinale injectie van rAAV voor functionele manipulatie van genetisch gelabelde neuronen in de dorsale hoorn van het ruggenmerg bij muizen. Deze methode maakt gerichte bestudering van pijncircuits mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Hanns Ulrich Zeilhofer voor royaal ondersteunen dit werk. Hendrik Wildner werd gesteund door de Stichting Olga Mayenfisch. Wij danken Carmen Birchmeier voor het antilichaam Lmx1b.

<ol><li>Goulding, M., Bourane, S., Garcia-Campmany, L., Dalet, A., Koch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+downunder%3A+an+update+from+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition downunder: an update from the spinal cord.</a> Curr Opin Neurobiol. 26, 161-166 (2014).</li>
<li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (12), 823-836 (2010).</li>
<li>Sandkuhler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+and+mechanisms+of+hyperalgesia+and+allodynia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia.</a> Physiol Rev. 89 (2), 707-758 (2009).</li>
<li>Zeilhofer, H. U., Wildner, H., Yevenes, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+synaptic+inhibition+in+spinal+sensory+processing+and+pain+control%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fast synaptic inhibition in spinal sensory processing and pain control.</a> Physiol Rev. 92 (1), 193-235 (2012).</li>
<li>Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skilled+reaching+relies+on+a+V2a+propriospinal+internal+copy+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit.</a> Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).</li>
<li>Cui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Early+RET%2B+Deep+Dorsal+Spinal+Cord+Interneurons+in+Gating+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Identification of Early RET+ Deep Dorsal Spinal Cord Interneurons in Gating Pain.</a> Neuron. 91 (6), 1413(2016).</li>
<li>Foster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation%2C+silencing%2C+and+activation+establish+glycinergic+dorsal+horn+neurons+as+key+components+of+a+spinal+gate+for+pain+and+itch%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch.</a> Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).</li>
<li>Francois, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Brainstem-Spinal+Cord+Inhibitory+Circuit+for+Mechanical+Pain+Modulation+by+GABA+and+Enkephalins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Brainstem-Spinal Cord Inhibitory Circuit for Mechanical Pain Modulation by GABA and Enkephalins.</a> Neuron. 93 (4), 822-839 (2017).</li>
<li>Peirs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+Horn+Circuits+for+Persistent+Mechanical+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dorsal Horn Circuits for Persistent Mechanical Pain.</a> Neuron. 87 (4), 797-812 (2015).</li>
<li>Petitjean, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+Horn+Parvalbumin+Neurons+Are+Gate-Keepers+of+Touch-Evoked+Pain+after+Nerve+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Dorsal Horn Parvalbumin Neurons Are Gate-Keepers of Touch-Evoked Pain after Nerve Injury.</a> Cell Rep. 13 (6), 1246-1257 (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+local+and+descending+inputs+for+primary+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Identifying local and descending inputs for primary sensory neurons.</a> J Clin Invest. 125 (10), 3782-3794 (2015).</li>
<li>Haenraets, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+nociceptive+circuit+analysis+with+recombinant+adeno-associated+viruses%3A+the+impact+of+serotypes+and+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Spinal nociceptive circuit analysis with recombinant adeno-associated viruses: the impact of serotypes and promoters.</a> J Neurochem. , (2017).</li>
<li>Abraira, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cellular+and+Synaptic+Architecture+of+the+Mechanosensory+Dorsal+Horn%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Cellular and Synaptic Architecture of the Mechanosensory Dorsal Horn.</a> Cell. 168 (1-2), 295-310 (2017).</li>
<li>Wildner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+analysis+of+Ptf1a-+and+Ascl1-deficient+mice+reveals+new+markers+for+distinct+dorsal+horn+interneuron+populations+contributing+to+nociceptive+reflex+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression analysis of Ptf1a- and Ascl1-deficient mice reveals new markers for distinct dorsal horn interneuron populations contributing to nociceptive reflex plasticity.</a> J Neurosci. 33 (17), 7299-7307 (2013).</li>
<li>Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+injection+of+a+viral+vector+for+conditional+gene+manipulation+in+the+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord.</a> J Vis Exp. (73), e50313(2013).</li>
<li>Kohro, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+minimally-invasive+method+for+microinjection+into+the+mouse+spinal+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A new minimally-invasive method for microinjection into the mouse spinal dorsal horn.</a> Sci Rep. 5, 14306(2015).</li>
<li>Bourane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gate+control+of+mechanical+itch+by+a+subpopulation+of+spinal+cord+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gate control of mechanical itch by a subpopulation of spinal cord interneurons.</a> Science. 350 (6260), 550-554 (2015).</li>
<li>Bourane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+spinal+circuit+for+light+touch+and+fine+motor+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control.</a> Cell. 160 (3), 503-515 (2015).</li>
<li>Duan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+spinal+circuits+transmitting+and+gating+mechanical+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain.</a> Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).</li>
<li>Gutierrez-Mecinas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preprotachykinin+A+is+expressed+by+a+distinct+population+of+excitatory+neurons+in+the+mouse+superficial+spinal+dorsal+horn+including+cells+that+respond+to+noxious+and+pruritic+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Preprotachykinin A is expressed by a distinct population of excitatory neurons in the mouse superficial spinal dorsal horn including cells that respond to noxious and pruritic stimuli.</a> Pain. 158 (3), 440-456 (2017).</li>
<li>Awatramani, R., Soriano, P., Rodriguez, C., Mai, J. J., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptic+boundaries+in+roof+plate+and+choroid+plexus+identified+by+intersectional+gene+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Cryptic boundaries in roof plate and choroid plexus identified by intersectional gene activation.</a> Nat Genet. 35 (1), 70-75 (2003).</li>
<li>Kim, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+genetically+defined+neurons+to+behavior+through+a+broadly+applicable+silencing+allele%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Linking genetically defined neurons to behavior through a broadly applicable silencing allele.</a> Neuron. 63 (3), 305-315 (2009).</li>
<li>Kim, J. C., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+fate-mapping+approaches%3A+new+means+to+explore+the+embryonic+origins+of+the+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic fate-mapping approaches: new means to explore the embryonic origins of the cochlear nucleus.</a> Methods Mol Biol. 493, 65-85 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Intraspinal injectie van AAVs kan worden een krachtige techniek in een laboratorium van het onderzoek, waardoor de analyse van spinale cellen met een hoge temporele en ruimtelijke oplossing. Dit protocol maakt de transductie van de drie belangrijkste spinale segmenten wordt geïnnerveerd door de sensorische neuronen uitbreiding van hun perifere axonen naar de stuk. Transducing drie segmenten produceert robuuste en reproduceerbare gedrags-gegevens. Ook kunnen testen van een grotere sensorische ruimte dan mogelijk na een en...

Het dorsale ruggenmerg is essentieel voor de uitwisseling van informatie tussen de periferie van het lichaam en de hersenen. Zintuiglijke prikkels zoals warmte, koude, aanraking, of schadelijke stimuli worden gedetecteerd door gespecialiseerde perifere neuronen, die deze informatie voor de neuronen van de dorsale Hoorn van het ruggenmerg. Hier, een complex netwerk van remmende en excitatory interneuronen moduleert en uiteindelijk de sensorische informatie relais via spinale projectie neuronen te supraspinal1,2sites. De berekeningen uitgevoerd door spinale inter- en projectie neuronen gate zintuiglijke informatie, dus bepalen welke informatie wordt onderdrukt of doorgegeven bij welke intensiteit. Wijzigingen in de integratie van sensorische stimuli, zoals een gewijzigd evenwicht tussen inhibitie en excitatie, kunnen leiden tot sensorische stoornissen zoals overgevoeligheid of allodynia (pijnlijke gewaarwordingen na normaal niet-pijnlijke stimulatie). Deze wijzigingen worden beschouwd als dat de onderliggende oorzaak van verschillende chronische pijn staat3,4. Spinale circuits zijn dus van groot belang zijn bij de verwerking van zintuiglijke en bijgevolg in de perceptie van een organisme milieu en zelf. Met de recente komst en combinatie van moleculaire, genetische, en chirurgische technieken waarmee de precieze manipulatie van genetisch geïdentificeerde spinale neuron subpopulaties, beginnen wetenschappers nu te begrijpen van de onderliggende spinale circuits verantwoordelijk voor de verwerking van de afzonderlijke zintuiglijke modaliteiten.
Intraspinal injectie van rAAV in wild-type of transgene muizen heeft bijgedragen aan de manipulatie, analyse en begrip van de functie van specifieke deelverzamelingen van ruggenmerg neuronen5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11. deze techniek maakt het mogelijk de levering van marker eiwitten (zoals GFP / GFP fusion eiwitten), verslaggever eiwitten (zoals GCaMP) of effector eiwitten (zoals bacteriële toxines, channelrhodopsin of Farmacogenetische receptoren) in een ruimtelijk beperkte wijze ruggenmerg neuronen. Lokale injectie van Cre-afhankelijke rAAVs in transgene muizen uiting van Cre recombinase in een specifieke subset van ruggenmerg neuronen kan de specifieke analyse van de respectieve neuronale bevolking. We hebben gebruikt deze techniek te etiketteren, lasertherapie, remmen of spinale glycinergic neuronen die aantonen dat zij zijn een essentieel onderdeel van de spinal gate beheersing van pijn en jeuk van transmissie7activeren. In deze experimenten, intraspinal injectie van Cre-afhankelijke rAAV in GlyT2::Cre muizen ingeschakeld de selectieve manipulatie van glycinergic neuronen in de lumbale ruggemerg. Gelijktijdige manipulatie van supraspinal circuits waarin glycinergic neuronen cruciaal voor de overleving van het dier kan worden vermeden.
Terwijl een intraspinal injectie van rAAVs infectie aan de plaats van injectie beperkt, kan virale transductie optreden niet alleen in lokale neuronen, maar ook in neuronen die verbinding met de injectieplaats via axonale projecties maken. De laatste wordt vaak gebruikt om trace CNS gebieden leveren van neuronale informatie aan een bepaalde kern in de hersenen. De besmetting van axonale projecties, maar ook kan een storende factor wanneer een gedefinieerde populatie van neuronen zal worden bestudeerd op een bepaalde site. Om deze kwesties te behandelen, hebben we onlangs een uitgebreide analyse van AAV serotypen en expressie cassettes te identificeren serotypes en initiatiefnemers die kunnen worden gebruikt om te minimaliseren of maximaliseren retrograde transductie uitgevoerd. In het kader van dit specifieke onderzoek in spinale circuits geanalyseerd wij het vermogen van verschillende serotypes en initiatiefnemers om retrogradely transduce neuronen in de achterwortelganglia, bevatten (DRG), de rostraal ventromediale medulla (RVM) en de Somatosensorische cortex 12. de techniek beschreven in dit protocol kan daarom worden gebruikt voor het analyseren van ruggenmerg neuronen op de injectieplaats of analyseren van projectie neuronen die inbreng op de ingespoten site van het ruggenmerg. In het protocol beschreven hier, worden drie injecties van rAAV in de linker kant van het lumbale ruggemerg uitgevoerd zodat transductie van neuronen in de drie lumbale segmenten (L3-L5). De L3-L5 segmenten ontvangen de meerderheid van de sensorische input het stuk ipsilaterale om de injectieplaats. Wij laten zien dat functionele manipulatie van genetisch gelabelde neuronen in L3-L5 voldoende te roepen robuuste gedragsveranderingen, waardoor het functionele bewijs voor de functie van de circuit van dergelijke een genetisch gelabelde neuron-subtype.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>micropipette puller: DMZ-Universal-Electrode-Puller</td><td>Zeitz</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>anesthesia unit: Oxymat3 oxygen concentrator</td><td>Weinmann</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>anesthesia unit: VIP 3000 Veterinary Vaporizer</td><td>Midmark</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Heat mat: Mio Star Thermocare 100</td><td>Migros</td><td>717614700000</td><td></td></tr><tr><td>Electric shaver</td><td>Philips</td><td>BT9290</td><td></td></tr><tr><td>surgical microscope (OPMI pico)</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Small animal stereotaxic apparatus</td><td>Kopf</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Neurostar StereoDrive (optional)</td><td>Neurostar</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Model 51690 Cunningham mouse spinal adaptor</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-4811</td><td></td></tr><tr><td>PHD Ultra syringe pump with nanomite</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-3601</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 701 RN 10 &mu;l glass microliter syringe</td><td>Hamilton</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Removable needle (RN) compression fitting 1 mm</td><td>Hamilton</td><td>55750-01</td><td></td></tr><tr><td>fine dentistry drilling apparatus: Osada success 40</td><td>Osada</td><td>OS-40</td><td></td></tr><tr><td>spherical cutter, 0.5mm</td><td>Busch</td><td>12001005B</td><td></td></tr><tr><td>electronic von Frey anesthesiometer</td><td>IITC</td><td>23905</td><td></td></tr><tr><td>flexible von Frey hairs</td><td>IITC</td><td>#7</td><td></td></tr><tr><td>LSM710 Pascal confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>0.8 NA &times; 20 Plan-apochromat objective</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>1.3 NA &times; 40 EC Plan-Neofluar oil-immersion objective</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Surgical Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Handle #4, 13cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Adson forceps, 1 x 2 teeth, 12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson rongeurs, curved, 0.7 mm cup</td><td>Fine Science Tools</td><td>16121-14</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #2 laminectomy forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Olsen-Hegar needle holders, serrated, 8.5 mm clamp length</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Consumables and Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thin-wall glass capillary, 1mm outside diameter</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW 100-3</td><td></td></tr><tr><td>Syringes (1, 5 and 20 ml)</td><td>B. Braun</td><td>(9166917V, 4606051V, 4606205V)</td><td></td></tr><tr><td>26G beveled needle</td><td>B. Braun</td><td>4665457</td><td></td></tr><tr><td>Sterile scalpel blades</td><td>B. Braun</td><td>BB523</td><td></td></tr><tr><td>Surgical sutures Safil Quick+ 4/0, absorbable</td><td>B. Braun</td><td>C1046220</td><td></td></tr><tr><td>Surgical sutures Premilene 5/0, non-absorbable</td><td>B. Braun</td><td>C0932191</td><td></td></tr><tr><td>Sterile PBS or saline (0.9%)</td><td></td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 70% (disinfectant)</td><td></td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Iodine solution (e.g. Braunol)</td><td>B. Braun</td><td>18380</td><td></td></tr><tr><td>Anaesthetics (e.g. Attane isoflurane)</td><td>Provet</td><td>2222</td><td></td></tr><tr><td>Aldasorber</td><td>Provet</td><td>333526</td><td></td></tr><tr><td>analgesics (e.g. buprenorphine: temgesic)</td><td>Indivior</td><td>GTIN: 7680419310018</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic ointment (e.g. vita-pos)</td><td>Pharma medica</td><td>GTIN: 4031626710635</td><td></td></tr><tr><td>Cotton swabs (e.g. from)</td><td>IVF Hartmann</td><td>1628100</td><td></td></tr><tr><td>Facial tissues (e.g. from)</td><td>Uehlinger AG</td><td>2015.10018</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus microscope slides</td><td>ThermoScientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Mice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J mice (wildtype)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>RRID:IMSR_JAX:000664</td><td></td></tr><tr><td>Rorbtm1.1(cre)Hze/J mice (ROR&beta;Cre)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>RRID:IMSR_JAX:023526</td><td></td></tr><tr><td>Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mice (R26Tom)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>RRID: IMSR_JAX:007914</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Viral vectors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV1.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1.CAG.eGFP)</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-1-PV1963</td><td></td></tr><tr><td>AAV1.CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.eGFP)</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-1-ALL854</td><td></td></tr><tr><td>AAV1.CAG.flex.tdTomato.WPRE .bGH (AAV1.CAG.flex.tdTomato)</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-1-ALL864</td><td></td></tr><tr><td>AAV1.EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1.EF1a.flex.DTA)</td><td>Penn Vector Core</td><td>Custom production</td><td></td></tr><tr><td>AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi))</td><td>Penn Vector Core</td><td>Custom production</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAAV.hSyn.flex.hM3D(G

adeno-associated virus-gemedieerde transgenic expressie in genetisch gedefinieerde neuronen van het ruggenmerg

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Selectieve manipulatie van spinale neuronale subpopulaties is hoofdzakelijk bereikt door twee verschillende methoden: 1) Intersectional genetica, waarbij dubbele of driedubbele transgene muizen worden gegenereerd met het oog op een selectieve uitdrukking van een verslaggever of effector gen (bijvoorbeelduit de Rosa26 locus) in de gewenste spinale bevolking. 2) intraspinal injectie van Cre-afhankelijke recombinante adeno-associated virus (rAAV); Hier worden Cre-afhankelijke AAV vectoren codering voor de verslaggever of effector gen keuze ingespoten in het ruggenmerg van muizen uiting van Cre recombinase in de gewenste neuronale subpopulatie. Dit protocol beschrijft hoe te genereren van Cre-afhankelijke rAAV vectoren en hoe transduce van neuronen in de dorsale Hoorn van het lumbale ruggenmerg segmenten L3-L5 met rAAVs. Als de lumbale spinale segmenten L3-L5 zijn geïnnerveerd door die perifere sensoriële neuronen die sensorische informatie van de hindlimbs zenden, kunnen spontane gedrag en reacties op zintuiglijke tests toegepast naar de stuk ipsilaterale aan de zijkant van de injectie worden geanalyseerd om de functie van de gemanipuleerde neuronen in de sensorische verwerking ondervragen. We bieden voorbeelden van hoe deze techniek kan worden gebruikt voor het analyseren van genetisch gedefinieerd deelverzamelingen van ruggenmerg neuronen. De belangrijkste voordelen van virus-gemedieerde transgenic expressie in transgene muizen Cre in vergelijking met klassieke verslaggever transgenic muis-geïnduceerde expressie zijn de volgende: 1) verschillende Cre-afhankelijke rAAVs codering van verschillende verslaggever of effector eiwitten kunnen in een enkele Cre transgene lijn, dus het overwinnen van de noodzaak te creëren verschillende meerdere transgene muis lijnen geïnjecteerd. 2) intraspinal injectie beperkt manipulatie van Cre-uiten cellen op de injectieplaats en de tijd na de injectie. De belangrijkste nadelen zijn: 1) de genexpressie verslaggever van rAAVs is meer variabele. 2) chirurgie is vereist voor de transduce van het ruggenmerg neuronen van belang. Welke van de twee methoden meer geschikt is, hangt af van het neuron bevolking en onderzoek vraag worden aangepakt.

Om te illustreren de niveaus van de expressie die kunnen worden verkregen door het intraspinal injectie van rAAV codering van een marker-eiwit, we eerst geïnjecteerd AAV1. CAG.eGFP in de lumbale ruggemerg van wild-type muizen. Drie injecties verdeeld ongeveer 1 mm uit elkaar geproduceerd een bijna continue infectie van lumbale spinale segmenten L3 L5 (figuur 1A-C). Injectie van het virus op een diepte van 300 µm van het spinale oppervlak leid...

Intraspinal injectie van recombinase afhankelijk recombinante adeno-associated virus (rAAV) kan worden gebruikt om te manipuleren alle genetisch gelabelde celtype in het ruggenmerg. Hier beschrijven we hoe transduce van neuronen in de dorsale Hoorn van het lumbale ruggenmerg. Deze techniek maakt functionele ondervraging van het subtype gemanipuleerde neuron.

Adeno-associated Virus-gemedieerde transgenic expressie in genetisch gedefinieerde neuronen van het ruggenmerg

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Het algemene doel van intraspinale toediening van recombinante adeno-geassocieerde virussen is om histologische labeling en functionele manipulatie van genetisch gedefinieerde neuronen in het dorsale ruggenmerg mogelijk te maken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van pijn, zoals welke neuronale circuits vereist zijn voor de perceptie van verschillende pijnmodaliteiten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat genetisch gelabelde neuronen op een specifiek beperkte en temporeel gecontroleerde wijze gemanipuleerd kunnen worden.Lokaliseer het meest caudale ribpaar door te palperen langs de wervelkolom van de geanestheseerde muis. Maak vervolgens een longitudinale incisie van 1,5 tot 2,5 centimeter in de huid, beginnend net rostraal van het meest caudale ribpaar. Til de huid op met een pincet en scheid deze met een schaar van de onderliggende spier. Houd de blootliggende weefsels gedurende de gehele operatie vochtig met steriele 0,9% natriumchloride. Maak met een fijn pincet en een kleine schaar een incisie in de dunne membraanlaag direct naast de middellijn en snijd deze los van de doornuitsteeksels.Verschillende anatomische ori

adeno-associated-virus-mediated-transgene-expression-genetically

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Source: Smit, R. D., et al. Targeting the Corticospinal Tract in Neonatal Rats with a Double-Viral Vector using Combined Brain and Spine Surgery. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the targeted delivery of viral vectors to corticospinal neurons in a neonatal rat. The protocol enables precise gene expression using anterograde and retrograde viral injections, facilitating research on neural regeneration and plasticity following spinal cord injury.

Targeted Viral Delivery to Corticospinal Neurons in a Neonatal Rat to Study Spinal Cord Injury

In this video, we demonstrate recombinant adeno associated virus-based gene delivery in the mouse pup. This method helps in studying gene expression in the targeted cells.

Recombinant Adeno Associated Virus Based Gene Delivery: A Technique for Transgene Delivery and Cardiac-Specific Expression in Rodent Model

Source: Tadokoro, T., et al. Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates a subpial injection technique for gene delivery to the spinal cord in mice. The procedure involves exposing the dura mater, puncturing the pia mater, and injecting a recombinant adeno-associated virus (rAAV) carrying a fluorescent protein-expressing gene into the subpial space. Following injection and recovery, the virus facilitates gene expression in...

Subpial Gene Delivery in the Mouse Spinal Cord to Evaluate Gene Expression

Source:Pourshafie, N., et al. Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents. J. Vis. Exp. (2018).In this video, a spinal and bulbar muscular atrophy or SBMA-affected mouse undergoes tail vein injection of recombinant AAV (Adeno-associated vectors) vectors carrying a plasmid encoding therapeutic microRNA. The vector produces microRNA that binds to mutant AR (Androgen receptor)-mRNA (messenger ribonucleic acid),...

Injecting Recombinant Adeno-Associated Vectors in a Spinal and Bulbar Muscular Atrophy Mouse Model

Virale vectoren kunnen gerichte genetische manipulatie. We tonen een werkwijze voor voorwaardelijke genexpressie of ablatie in de muis ruggenmerg, met stereotactische injectie van een virale vector in de dorsale hoorn, een prominente plaats van synaptische contacten tussen primaire somatosensorische afferenten en neuronen van het centrale zenuwstelsel.

Stereotactische injectie van een virale vector voor voorwaardelijke Gene Manipulation in de muis Spinal Cord

Dit protocol presenteert het gebruik van een dorsale wortelganglion (DRG) injectie met een virale vector en een gelijktijdige dorsale wortelbeschadiging bij een volwassen rat als een model om sensorische axonregeneratie te bestuderen. Dit model is geschikt voor het onderzoeken van het gebruik van gentherapie om sensorische axonregeneratie te bevorderen.

Ganglion Injection en dorsale Root crush als een model voor Sensory Axon Regeneration

Het doel van de huidige studie was het ontwikkelen en valideren van de kracht en de veiligheid van de lever-adeno-geassocieerde virus 9 (AAV9) -gemedieerde genafgifte door gebruik te maken van een nieuwe subpiale genafgifte techniek bij volwassen muizen.

Subpiaal Adeno-geassocieerde Virus 9 (AAV9) Vector Levering in Volwassene Muizen

Methoden voor een grootschalige centrale zenuwstelsel gene levering in de rat vallen. In dit voorbeeld is het doel om na te bootsen van een ziekte die het hele ruggenmerg aantast. De wijdverbreide transductie kan worden gebruikt voor een therapeutische eiwitten naar het CNS van een eenmalige, perifere administratie.

Methoden en Tips voor intraveneuze toediening van Adeno-associated Virus voor ratten en evaluatie van het centrale zenuwstelsel transductie

Dit protocol toont injectie van een retrogradely vervoerbare virale vector in rat ruggenmerg weefsel. De vector is overgenomen in de synaps en vervoerd naar de cel lichaam van doel neuronen. Dit model is geschikt voor retrograde tracering van belangrijke spinale trajecten of targeting cellen voor gen-therapie-toepassingen.

Directe inspuiting van een lentivirale Vector hoogtepunten meerdere Motor trajecten in het ruggenmerg Rat

Dit protocol demonstreert een nieuwe methode voor het toepassen van gentherapieën op subpopulaties van cellen bij neonatale ratten in de postnatale leeftijd van 5-10 dagen door een anterograde chemogenetische modifier in de somatomotorische cortex en een retrograde transporteerbaar Cre-recombinase in het cervicale ruggenmerg te injecteren.

Gericht op het corticospinale kanaal bij neonatale ratten met een dubbel-virale vector met behulp van gecombineerde hersen- en wervelkolomchirurgie

Er wordt een nieuwe techniek beschreven voor wijdverbreide toediening van adeno-geassocieerd virus waarbij gebruik wordt gemaakt van infusie van subarachnoïdaal virus. Deze methode zorgt niet alleen voor wijdverspreide transductie van neocorticale neuronen van muizen in oppervlakkige lagen, maar resulteert ook in selectieve expressie van het transgen in laag vijf piramidale neuronen, zelfs bij gebruik van een niet-selectieve promotor.

Wijdverbreide transductie van neocorticale neuronen van muizen door subarachnoïdale injectie van AAV2

Leer intraspinale injectie van rAAV voor functionele manipulatie van genetisch gelabelde neuronen in de dorsale hoorn van het ruggenmerg bij muizen. Deze methode maakt gerichte bestudering van pijncircuits mogelijk.

Adeno-associated Virus-gemedieerde transgenic expressie in genetisch gedefinieerde neuronen van het ruggenmerg

Meer video's verkennen