Synthese van Meerwandige koolstof nanobuisjes bewerkt met zilveren nanodeeltjes en evaluatie van hun antibacteriële activiteiten en cytotoxische eigenschappen
10 mei 2018
In deze studie werden antimicrobiële nanomaterialen gesynthetiseerd door zure oxidatie van multiwalled koolstof nanotubes en de daaropvolgende reductieve afzetting van zilveren nanodeeltjes. Antimicrobiële activiteit en cytotoxiciteit tests werden uitgevoerd met de als-bereid nanomaterialen.
Het algemene doel van deze procedure is om antibacteriële nanocomplexen te produceren die bestaan uit koolstofnanobuizen met zilveren nanodeeltjes die gesynthetiseerd zijn op de oppervlakken van de nanobuizen. Deze methode kan worden gebruikt bij de ontwikkeling van nieuwe bacteriële nanomaterialen die een lage toxiciteit voor mensen hebben, maar sterke septische eigenschappen voor verschillende soorten bacteriën en biofilms. Het protocol beschrijft de evaluatie van nanocomplexen bij het uitroeien van bacteriën terwijl hun biocompatibiliteit met mensen wordt gehandhaafd.
Om de procedure te beginnen, plaats 30 tot 50 milligram MWCNT's in een 50 milliliter flesje. Gebruik een micropipet voorzien van een milliliter pipettentip om langzaam acht milliliter van een drie-op-één oplossing van zwavelzuur en salpeterzuur toe te voegen aan de MWCNT's. Wacht 30 minuten tot de exotherme reactie is voltooid, en soniseer vervolgens de oplossing bij 60 tot 80 graden Celsius en 160 watt totdat de MWCNT's zich aan de bodem van het flesje nestelen, wat meestal ongeveer een uur duurt.
Breng het mengsel over in een centrifugeerbuis. Gebruik een micropipet om voorzichtig 30 milliliter gedestilleerd water druppelsgewijs toe te voegen aan de carboxylaatgefunctionaliseerde MWCNT's, en pauzeer om de mixtuur te laten afkoelen indien nodig. Centrifugeer vervolgens het mengsel gedurende 15 minuten bij 12.000 G.
Verwijder het supernatant met een pipet voorzien van een milliliter pipettentip. Voeg vijf milliliter ethanol toe aan het vaste materiaal en spoel de wanden van het flesje met extra ethanol. Centrifugeer het mengsel opnieuw met dezelfde instellingen en controleer de pH van het supernatant met pH-papier.
Was de vaste stoffen door centrifugeren in ethanol tot de pH van het supernatant neutraal is, verwijder vervolgens het supernatant en voeg een milliliter gedestilleerd water toe aan het precipitaat. Verspreid de carboxylaatgefunctionaliseerde MWCNT's in het water en vries het mengsel droog bij min 60 graden Celsius onder vacuüm. Plaats 10 milligram gevriesdroogde carboxylaatgefunctionaliseerde MWCNT's in een 50 milliliter conische centrifugeerbuis.
Voeg 30 milliliter gedestilleerd water toe aan de buis. Combineer zes milliliter 0,1 normaal zilvernitraat en 18 milliliter gedestilleerd water in een andere 50 milliliter conische buis. Soniseer beide mengsels gedurende één uur bij 60 graden Celsius en 160 watt.
Voeg vervolgens, terwijl je de MWCNT-dispersie nog steeds soniseert bij 60 graden Celsius en 160 watt, de zilvernitraatoplossing druppelsgewijs toe aan de MWCNT-dispersie met behulp van een pipet voorzien van een milliliter pipettentip. Zodra de toevoeging voltooid is, blijf je de mixtuur gedurende één uur soniseren, centrifugeer vervolgens de mixtuur gedurende 15 minuten bij 12.000 G bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant. Verspreid de zilveren MWCNT's opnieuw in 30 milliliter gedestilleerd water door sonisatie bij 24 graden Celsius gedurende 30 minuten.
Herhaal het centrifugeren in 30 milliliter gedestilleerd water en het verwijderen van het supernatant twee keer. Verspreid vervolgens de gewassen zilveren MWCNT's in een milliliter gedestilleerd water door sonisatie gedurende vijf minuten. Voeg vijf milliliter ethanol toe aan de dispersie en roer de mixtuur gedurende één uur bij kamertemperatuur.
Centrifugeer vervolgens de mixtuur gedurende 15 minuten bij 12.000 G bij kamertemperatuur en controleer de pH van het supernatant. Verwijder het supernatant en verspreid de mixtuur opnieuw in vijf milliliter ethanol door middel van vortexing. Blijf het precipitaat in ethanol wassen door centrifugeren tot de pH van het supernatant neutraal is.
Dispergeer tenslotte de gewassen zilveren MWCNT's in een milliliter gedestilleerd water. Vries het mengsel droog bij min 70 graden Celsius onder vacuüm gedurende 24 uur en bewaar het mengsel in een afgesloten container. Om te beginnen met het voorbereiden van de test, meng en autoclaveer 18,12 gram R2A-agar en een liter gedestilleerd water.
Laat de gel afkoelen bij kamertemperatuur. Wanneer de gel klaar is om te gieten, plaats 10 milliliter gel in 90 millimeter Petri-schalen en laat de agar uitharden. Gebruik in een afzuigkap een lus en naald gesteriliseerd in alcoholvlam om 100 microliter van een methylobacterium-soort mengsel op het oppervlak van het kweekmedium te strekken.
Incubeer de schalen gedurende 48 uur bij 30 graden Celsius, meng vervolgens 3,12 gram R2A-bouillon met een liter gedestilleerd water en autoclaveer het medium gedurende 15 minuten bij 121 graden Celsius. Gebruik een gesteriliseerde lus en naald om de kolonies over te brengen naar het R2A-groeimedium. Incubeer het monster in een schuddende incubator bij 30 graden Celsius en 180 RPM.
Meet de optische dichtheid bij 600 nanometer per uur totdat de optische dichtheid groter is dan 0,7. Bereid vervolgens een andere Petri-schaal met 10 milliliter R2A-agar voor. Meng vervolgens 3,12 gram R2A-bouillon en acht gram agar met een liter gedestilleerd water.
Autoclaveer het mengsel gedurende 15 minuten bij 121 graden Celsius. Meng 100 microliter van de methylobacterium-cultuur in het agarmengsel. Giet 10 milliliter van het methylobacterium-bevattende gel over de onderste laag R2A-agar in de Petri-schaal en bereid vervolgens een dispersie van de gewenste concentratie gevriesdroogde zilveren MWCNT's in gedestilleerd water.
Gebruik een micropipet om 50 microliter van deze dispersie op een zes-op-één millimeter steriele papieren schijf te laden. Breng gedestilleerd water aan op een andere steriele papieren schijf als controle. Droog en steriliseer beide schijven gedurende 30 minuten in een vacuümkamer onder UV-licht.
Plaats vervolgens het zilveren MWCNT-monster en de controle op de agar en incubeer de agarplaat gedurende 48 uur bij 30 graden Celsius. Meet de remmingszone rond het zilveren MWCNT-monster wanneer het klaar is. Autoclaveer voorafgaand aan de test dri
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie richt zich op de synthese van antibacteriële nanocomplexen met behulp van meerwandige koolstofnanobuisjes (MWCNTs) en zilvernanodeeltjes. Het doel is om materialen te ontwikkelen die sterke antibacteriële eigenschappen vertonen, terwijl de toxiciteit voor mensen laag blijft.
Belangrijke Onderdelen van de Studie
Wetenschapsgebied
- Nanomaterialen
- Antimicrobiële middelen
- Biocompatibiliteit
Achtergrond
- Antimicrobiële nanomaterialen zijn essentieel bij de bestrijding van bacteriële infecties.
- Koolstofnanobuisjes hebben unieke eigenschappen die de effectiviteit van zilvernanodeeltjes verhogen.
- Het begrijpen van de balans tussen antimicrobiële activiteit en cytotoxiciteit is cruciaal voor veilige toepassingen.
- Deze studie onderzoekt een methode om deze nanocomplexen effectief te synthetiseren.
Doel van de studie
- Het synthetiseren van antibacteriële nanocomplexen met behulp van MWCNTs en zilvernanodeeltjes.
- Het evalueren van de antimicrobiële effectiviteit van de gesynthetiseerde materialen.
- Het beoordelen van de cytotoxiciteit van deze nanocomplexen op menselijke cellen.
Gebruikte methoden
- Zure oxidatie van MWCNTs met behulp van een zwavel- en salpeterzuuroplossing.
- Reductieve depositie van zilvernanodeeltjes op de geoxideerde MWCNTs.
- Sonicatie van het mengsel om een goede dispersie en reactie te waarborgen.
- Testen van de antimicrobiële activiteit en cytotoxiciteit van het eindproduct.
Belangrijkste resultaten
- De gesynthetiseerde nanocomplexen vertoonden significante antibacteriële activiteit.
- In tests met menselijke cellen werden lage niveaus van cytotoxiciteit waargenomen.
- De methode bleek effectief voor de productie van stabiele en functionele nanomaterialen.
- De resultaten wijzen op potentieel voor verdere ontwikkeling in medische toepassingen.
Conclusies
- De studie heeft met succes antibacteriële nanocomplexen gesynthetiseerd met MWCNTs en zilvernanodeeltjes.
- Deze materialen zijn veelbelovend voor gebruik in medische toepassingen vanwege hun lage toxiciteit en hoge effectiviteit.
- Verder onderzoek is nodig om hun volledige potentieel in klinische settings te verkennen.
Veelgestelde Vragen
Industriële relevantie voor directie
Dit protocol maakt de synthese mogelijk van met zilvernanodeeltjes gefunctionaliseerde meerwandige koolstofnanobuisjes (Ag-MWCNTs) voor antibacteriële toepassingen, om te voorzien in de behoefte aan antimicrobiële materialen met een verminderde cytotoxiciteit bij vroege fasen van therapeutische ontwikkeling. De methode ondersteunt doelwitvalidatie bij antimicrobiële ontdekking door een instelbaar nanocomplexplatform te bieden dat dosisafhankelijke bacteriële inhibitie demonstreert, terwijl biocompatibiliteitsdrempels behouden blijven. Dergelijke nanocomplexen bieden waarde bij het mechanistisch verminderen van risico's in preklinische screeningspipelines door de aflevering van nanomaterialen te combineren met metallische antimicrobiële activiteit, wat hypothesetests faciliteert met betrekking tot pathogeen-specifieke werkzaamheid en gastheertolerantie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar zilvergebaseerde antimicrobiële mechanismen mogelijk via gecontroleerde depositie van nanodeeltjes op koolstofnanobuisskeletten.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare syntheseroute voor het genereren van gestandaardiseerde Ag-MWCNT-dispersies bij gedefinieerde concentraties (bijv. 10–50 µg/mL) voor consistente screening van de bioactiviteit.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de beoordeling van structuur-activiteitsrelaties door de zilverbelading (deeltjesgrootte ca. 3,83 nm) te correleren met bacteriostatische en bactericide resultaten tegen modelorganismen zoals Methylobacterium.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Maakt gebruik van metingen van de remmingszone en de minimale bactericide concentratie (MBC) om de antibacteriële potentie te kwantificeren zonder spectrale interferentie door de kleur van het nanomateriaal.
- Kwantitatieve resultaten: Maakt gebruik van Live/Dead- en Trypan Blue-assays om cytotoxiciteits- en viabiliteitsgegevens te genereren die compatibel zijn met high-throughput screening-formaten.
- Overweging voor schaalbaarheid: Bevat herhaalde centrifugatie- en wasstappen om pH-neutrale supernatanten te verkrijgen, wat de consistentie tussen batches waarborgt voor de reproduceerbaarheid van de assay.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Toont een duidelijke progressie aan van synthese naar functionele evaluatie, wat go/no-go-beslissingen ondersteunt op basis van de waargenomen MBC bij 30–40 µg/mL en de afwezigheid van significante cytotoxiciteit bij 30 µg/mL.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Maakt de identificatie mogelijk van een therapeutisch venster waarin antibacteriële effectiviteit (bijv. een 100.000-voudige reductie bij 30 µg/mL) te onderscheiden is van cytotoxische effecten die bij hogere concentraties worden waargenomen.
- Mechanische risicoreductie: Faciliteert de evaluatie van het gedrag van nanocomplexen onder biologisch relevante omstandigheden, inclusief het behoud van steriliteit via autoclaveren en UV-vacuümdrogen, wat cruciaal is voor preklinische translatie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het continuüm van antimicrobiële ontdekkingen en verbindt de synthese van nanomaterialen met functionele validatie bij vroege identificatie van lead-verbindingen, met name voor topische of oppervlaktegerichte antibacteriële strategieën waarbij lokale toediening de systemische blootstelling minimaliseert.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing met betrekking tot nanodeeltjes-gemedieerde antimicrobiële werking door nauwkeurige dosering en controles mogelijk te maken (bijv. methanol-referentie, blanco schijfjes) in agar-gebaseerde assays.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, dispergeerbare nanocomplexen die geschikt zijn voor remmingszone- en MBC-assays, cruciale resultaten voor het vergelijken van lead-kandidaten.
- Analytica: Genereert kwantitatieve eindpunten, waaronder monitoring van de optische dichtheid, kolenietelling en viabiliteitskleuring, wat datagestuurde prioritering mogelijk maakt.
- Translationeel onderzoek: Verbindt synthese met preklinische relevantie via biocompatibiliteitsbeoordeling met behulp van Trypan Blue-exclusie, een proxy voor membraanintegriteit in zoogdiercellen.
- Bedrijfsbrede hergebruik: Vestigt een modulair platform waarbij MWCNT-functionalisering en metaaldepositie kunnen worden aangepast aan andere metalen of target-liganden voor een bredere toepassing in antimicrobiële of antibiofilm-programma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt mechanistisch inzicht in de door nanocomplexen gemedieerde antibacteriële activiteit, terwijl vals-positieven door assay-interferentie worden geminimaliseerd.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde zuivering (zuurwassing, ethanolspoeling, pH-monitoring) en stabilisatie (vriesdrogen onder vacuüm).
- Strategische waarde: Informeert risico-batenprofilering door antimicrobiële potentie los te koppelen van cytotoxiciteit, wat bijdraagt aan een veiligere selectie van kandidaten.
- Impact op portfolio: Maakt datagestuurde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk op basis van concentratie-afhankelijke effectiviteit en veiligheidsdrempels waargenomen in parallelle assays.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de omgang met nanomaterialen, sonicatieprotocollen en steriele microbiologische technieken.
- Is afhankelijk van toegang tot centrifugatieapparatuur (12,000 G), sonicatoren (60–80°C, 160W) en vriesdrogers (-60 tot -70°C onder vacuüm).
- Vereist standaardisatie tussen teams voor dispersieprotocollen, met name om een consistente depositie van nanodeeltjes te bereiken en aggregatie te voorkomen.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij de overstap van Methylobacterium naar andere bacteriële stammen of biofilmmodellen, waarvoor heroptimalisatie van inoculatie- en incubatieparameters noodzakelijk is.
- Praktische beperking: De donkere kleur van koolstofnanobuisjes maakt alternatieve assays noodzakelijk (remmingszone, Live/Dead, Trypan Blue) in plaats van colorimetrische methoden zoals MTT, wat de complexiteit van de assay verhoogt.
Veelgestelde vragen over biopharma
Chapters in this video
0:04
Title
0:39
Multi-walled Carbon Nanotube (MWCNT) Oxidation
2:34
Silver Nanoparticle Deposition on MWCNTs
4:59
Zone of Inhibition Test
7:35
Antibacterial Test
9:20
Results: Characterization and Evaluation of Antibacterial Activity and Cytotoxicity of Ag-MWCNTs
10:50
Conclusion
