Name: Praktisch gebruik van RNA-interferentie: mondelinge levering van Double-stranded RNA in liposomen dragers voor kakkerlakken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Leer RNA-interferentie via orale toediening van dubbelstrengig RNA in liposomen voor genexpressie-vermindering in de darm van de Duitse kakkerlak. Deze methode biedt nieuwe mogelijkheden voor biologische plaagbestrijding.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door subsidies uit Taiwan (Ministerie van wetenschap en technologie, de meest 100-2923-B-002-002-MY3 en 106-2313-B-002-011-MY3 naar H.J.L.), Tsjechië (verlenen Agentschap van Zuid-Bohemen Universiteit, GAJU verlenen 065/2017/P Y.H.L), en Spanje ( Spaanse ministerie van economische zaken en concurrentievermogen, verleent CGL2012-36251 en CGL2015-64727-P X.B., en de Catalaanse regering, toekennen 2014 SGR 619 X.B.); het kreeg ook financiële steun uit het Europees Fonds voor de economische en regionaleontwikkeling (EFRO fondsen te X.B.).

1. synthese en voorbereiding van dsRNA
<ol><li>Het identificeren van de sites target dsRNA in de 3' niet-vertaalde regio van de doelgenen. De dsTub wordt gebruikt voor het richten van het α-tubuline (bad) gen (GenBank toetreding nummer: KX228233), en dsEGFP zoals een negatieve dsRNA-besturingselement wordt ontworpen van de opeenvolging van versterkte groene fluorescentie eiwit (EGFP; GenBank toetreding nummer: LC311024).</li>
	<li>Standaard PCR versterking om te synthetiseren de dsRNA sjablonen met gen-specifieke primers met de T7 promotor volgorde uitvoeren (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'). De PCR versterking voorwaarden en primer informatie gebruikt zijn die gemeld door Lin et al.. (2017) 12 (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Doorgaan met dsRNA voorbereiding met behulp van een Transcriptie T7 Kit (Zie Tabel of Materials), volgens de instructies van de fabrikant. Opmerking: Opbrengst van de hoge hoeveelheid dsRNA, Meng twee reacties in één buis (in totaal 40 µL) en Incubeer bij 37 ° C's nachts.</li>
	<li>Voeg 2 µL van DNase (Zie Tabel van materialen) in dsRNA monsters gedurende 15 minuten bij 37 ° C te verteren DNA sjablonen.</li>
	<li>Voeg 200 µL extractie reagens toe (Zie Tabel van materialen) en 40 µL chloroform en vortex.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 10 min bij 13.000 x g bij 4 ° C, dan verzamelen supernatant (150 µL) in een nieuwe microcentrifuge buis.</li>
	<li>Neerslag dsRNA door toevoeging van 150 µL isopropanol en incubatie gedurende 15 minuten op het ijs.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 15 min bij 13.000 x g bij 4 ° C, dan verwijderen van de bovendrijvende substantie.</li>
	<li>Voeg 200 µL van de 70%-ethanol te wassen dsRNA pellets. Centrifugeer gedurende 10 min bij 13.000 x g bij 4 ° C.</li>
	<li>Verwijder de ethanol en herhaalt u de stappen van ethanol wassen.</li>
	<li>Verwijder de ethanol en droog dsRNA pellet door centrifugaal vacuüm concentrators voor 3 min en resuspendeer dsRNA met RNase-gratis water.</li>
	<li>Bepalen van de hoeveelheid van de gezuiverde dsRNA met behulp van een micro-volume UV-Vis spectrofotometer (Zie Tabel van materialen) volgens instructies van de fabrikant en aan te passen aan de gewenste concentratie (bijv., 0,25 µg/µL voor bereiding van dsRNA lipoplexes).</li>
	<li>Bewaar de dsRNA monsters bij-20 ° C voor maximaal 3 maanden.</li>
</ol>2. voorbereiding van dsRNA Lipoplexes
<ol><li>Verdun 4 µL van het transfectiereagens (Zie Tabel van materialen) door toevoeging van 4 µL van 5% glucose-oplossing. Verdun 4 µL van de dsRNA (1 µg) door toevoeging van 4 µL van 5% glucose-oplossing.</li>
	<li>Voeg de verdunde liposoom reagens oplossing onmiddellijk in de oplossing van verdunde dsRNA allemaal tegelijk. Vortex kort naar meng ze en incubeer gedurende 15 min bij 25 ° C. Opmerking: Meng geen de oplossingen in de omgekeerde volgorde.</li>
	<li>De dsRNA lipoplexes zijn klaar voor gebruik. Gebruik binnen 1 uur voor de voorbereiding en negeren na 1 uur. Opmerking: Volgens de aanwijzingen van de fabrikant moeten de lipoplexes zo spoedig mogelijk worden gebruikt.</li>
</ol>3. collectie van extracellulaire enzymen uit Hemolymfe en middendarm SAP
<ol><li>
Insect zoute buffer (10 x voorraad)
	<ol>
<li>Meng 900 mL dubbel gedestilleerd water met 109.3 g NaCl, 15.7 g KCl, 6.3 g CaCl2en 8.3 g MgCl2·6H2O.</li>
		<li>Breng pH op 6,8, en vul aan tot 1000 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hemolymfe collectie
	<ol>
<li>Anesthetize de kakkerlakken op ijs totdat zij niet worden verplaatst gedurende 3 minuten.</li>
		<li>Houd de kakkerlak met twee vingers (duim en wijsvinger), en de ventrale zijde van de kakkerlak opdagen.</li>
		<li>Gebruik de ontleden schaar af te snijden uit het topje van een coxa van een achterpoot. Opmerking: Snijd de aangesloten kruising tussen coxa en trochanter. De besnijdenis van het andere deel van de coxa was minder efficiënt verzamelen Hemolymfe.</li>
		<li>Knijp de buik zachtjes met de middelste vinger, en verzamelen de Hemolymfe bloeden uit de incisie met een 10 µL micropipet.</li>
		<li>Zwembad de Hemolymfe uit verschillende kakkerlakken (5 personen) in een microcentrifuge buis. Opmerking: Houd de microcentrifuge buizen op ijs ter voorkoming van melanization. De gemiddelde omvang van Hemolymfe verkregen van een mannelijke kakkerlak is 2-3 µL.</li>
		<li>Spin down de Hemolymfe kort met een benchtop centrifuge voor 10 s.</li>
		<li>Breng gewenste hoeveelheid Hemolymfe (dat wil zeggen, 10 µL), en meng het met 50 µL van 1 x insect zoute buffer.</li>
		<li>Centrifugeer gedurende 10 min bij 1.000 x g bij 4 ° C te draaien naar beneden hemocytes. Het supernatant overbrengen in een schone microcentrifuge buis.</li>
		<li>De totale eiwitconcentratie met behulp van een micro-volume UV-Vis spectrofotometer door het meten van de A28015te kwantificeren.</li>
		<li>Aanpassen elk monster om dezelfde eiwitconcentratie (6 mg/µL van totale proteïne).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Middendarm SAP collectie
	<ol>
<li>Anesthetize de kakkerlakken op ijs. Herstellen van de kakkerlakken ventrale zijde omhoog op de dissectie-plaat met koude 1 x insect zoute buffer met behulp van insect pins.</li>
		<li>Ontleden de buik met een fijne pincet. Verwijder de hele darm (met inbegrip van de voorste, mid, en hind darm) te een verse schotel met 1 x insect zoute buffer.</li>
		<li>De voorste en achterste darm te verwijderen en de middendarm snel overbrengen in een microcentrifuge-buis die 100 µL insect zoute buffer bevat.</li>
		<li>Zwembad de midguts van zes kakkerlakken in de dezelfde buis, en vortex voor 10 s.</li>
		<li>Centrifugeer gedurende 10 min bij 1.000 x g bij 4 ° C te draaien naar beneden de hemocytes en darmen weefsels. Het supernatant overbrengen in een schone microcentrifuge buis.</li>
		<li>De totale eiwitconcentratie met behulp van een micro-volume UV-Vis spectrofotometer door het meten van de A28015te kwantificeren.</li>
		<li>Aanpassen elk monster om dezelfde eiwitconcentratie (6 mg/µL van totale proteïne).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. dsRNA afbraak Assay
<ol><li>Vers bereiden 4 µL van de naakte dsRNA of dsRNA lipoplexes (1 µg).</li>
	<li>Meng dsRNA oplossingen met 10 µL van insecten zoute buffer (control), geëxtraheerd enzymen uit Hemolymfe of middendarm SAP.</li>
	<li>Voeg 2 µL EGTA (20 mM) of RNase-gratis water te scheiden van monsters als besturingselementen voor remming van het enzym activiteiten.</li>
	<li>Incubeer gedurende 1 uur of langer (6, 12 of 24 uur) bij 25 ° C.</li>
	<li>Voeg 200 µL extractie reagens en 40 µL chloroform, vervolgens vortex.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 10 min bij 13.000 x g bij 4 ° C, dan verzamelen supernatant (150 µL) in een nieuwe microcentrifuge buis.</li>
	<li>Neerslag dsRNA door toevoeging van 150 µL isopropanol en incubatie gedurende 15 minuten op het ijs.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 15 min bij 13.000 x g bij 4 ° C, dan verwijderen van de bovendrijvende substantie.</li>
	<li>Voeg 200 µL van de 70%-ethanol te wassen dsRNA pellets. Centrifugeer gedurende 10 min bij 13.000 x g bij 4 ° C.</li>
	<li>Verwijder de ethanol en herhaalt u de stappen van ethanol wassen.</li>
	<li>Verwijder de ethanol en droog dsRNA pellet door centrifugaal vacuüm concentrators voor 3 min. resuspendeer dsRNA met 10 µL RNase-gratis water.</li>
	<li>Controleer de integriteit van behandelde dsRNA via Elektroforese van het gel op een 1,5% agarose gel.</li>
</ol>5. orale toediening van dsRNA
<ol><li>Handhaven van kakkerlakken op een ad-libitum -dieet van droog voedsel (dog chow). Ontnemen watervoorziening vanuit de kakkerlakken één dag vóór dsRNA inslikken experimenten.</li>
	<li>Houd een kakkerlak door grijpen zijn vleugels met de flexibele Tang (Figuur 1, stap 5). Opmerking: Pak niet de lichaamsdelen van kakkerlakken.</li>
	<li>Voorbereiden op de dsRNA lipoplexes, evenals de naakte dsRNA, voeding, zoals beschreven in sectie 2. Opmerking: De lipoplexes dsRNA moet vers worden bereid vóór de voedering.</li>
	<li>4 µL van dsRNA lipoplexes of naakte dsRNA feed (250 ng) met een micropipet.</li>
	<li>Langzaam Pipetteer de druppel van de dsRNA oplossing dicht bij de monddelen van kakkerlakken, en laat de kakkerlakken inslikken de druppel volledig.</li>
	<li>De inname experimenten twee keer per dag (1 h na lichten op en 1 uur voordat de lichten uit) voor 8 dagen of 16 dagen continu uitvoeren. Opmerking: Alle kakkerlakken verworven water alleen via handmatige invoer met dsRNA oplossing of besturingselement reagentia (bijvoorbeeld, nuclease gratis water, glucose oplossing en liposoom reagens) tijdens de inname experimenten.</li>
	<li>Flessen water geven met de kakkerlakken na 16 dagen van inname van dsRNA experimenten.</li>
</ol>6. Knockdown beoordelen
<ol><li>Gekozen tijde punten (2, 9 en 17 dagen na dsRNA inslikken assay), het verzamelen van de dsEGFP - en dsTub-testgroep insecten en ontleden de gekozen weefsels (bijvoorbeeld, middendarm).</li>
	<li>Het uitvoeren van kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR). De qRT-PCR versterking voorwaarden en primer informatie zoals gerapporteerd door Lin et al.. (2017) 12.</li>
	<li>Beoordelen van de controle en de insecten dsRNA-behandelde dagelijks controleren van sterfte en verwijderen van de kakkerlakken die niet meer bewegen.</li>
</ol>

<ol><li>Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicing+and+slicing%3A+The+core+machinery+of+the+RNA+interference+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Dicing and slicing: The core machinery of the RNA interference pathway.</a> FEBS Lett. 579, 5822-5829 (2005).</li>
<li>Bellés, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+drosophila%3A+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Beyond drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annu. Rev. Entomol. 55, 111-128 (2010).</li>
<li>Wynant, N., Santos, D., Vanden Broeck, J. Chapter Five - Biological Mechanisms Determining the Success of RNA Interference in Insects. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/journal/19376448/312">International Review of Cell and Molecular Biology</a>. Jeon, K. W. 312, Academic Press. 139-167 (2014).</li>
<li>San Miguel, K., Scott, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+next+generation+of+insecticides%3A+dsRNA+is+stable+as+a+foliar-applied+insecticide%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag.+Sci%22%5BJournal%5D)">The next generation of insecticides: dsRNA is stable as a foliar-applied insecticide.</a> Pest Manag. Sci. 72, 801-809 (2016).</li>
<li>Scott, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+elements+of+successful+insect+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Towards the elements of successful insect RNAi.</a> J. Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).</li>
<li>Joga, M. R., Zotti, M. J., Smagghe, G., Christiaens, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+efficiency%2C+systemic+properties%2C+and+novel+delivery+methods+for+pest+insect+control%3A+What+we+know+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Physiol%22%5BJournal%5D)">RNAi efficiency, systemic properties, and novel delivery methods for pest insect control: What we know so far.</a> Front. Physiol. 7, (2016).</li>
<li>Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+double-stranded+RNA+in+insect+hemolymph+as+a+potential+determiner+of+RNA+interference+success%3A+Evidence+from+Manduca+sexta+and+Blattella+germanica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica.</a> J. Insect Physiol. 59, 171-178 (2013).</li>
<li>Arimatsu, Y., Kotani, E., Sugimura, Y., Furusawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+a+cDNA+encoding+extracellular+dsRNase+and+its+expression+in+the+silkworm%2C+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of a cDNA encoding extracellular dsRNase and its expression in the silkworm, Bombyx mori.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 37, 176-183 (2007).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+RNAi+efficacy+among+insect+species+is+attributable+to+dsRNA+degradation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 1-9 (2016).</li>
<li>Wynant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+functional+characterization+and+phylogenetic+analysis+of+double+stranded+RNA+degrading+enzymes+present+in+the+gut+of+the+desert+locust%2C+Schistocerca+gregaria%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification, functional characterization and phylogenetic analysis of double stranded RNA degrading enzymes present in the gut of the desert locust, Schistocerca gregaria.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 46, 1-8 (2014).</li>
<li>Huang, J. -H., Belles, X., Lee, H. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+hypertrehalosemic+hormone+receptor+in+relation+to+hemolymph+trehalose+and+to+oxidative+stress+in+the+cockroach+Blattella+germanica%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of hypertrehalosemic hormone receptor in relation to hemolymph trehalose and to oxidative stress in the cockroach Blattella germanica.</a> Exp. Endocrinol. 2, 114(2012).</li>
<li>Lin, Y. -H., Lee, C. -M., Huang, J. -H., Lee, H. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+regulation+of+permethrin+susceptibility+by+glutathione+S-transferase+%28BgGSTD1%29+in+the+German+cockroach+%28Blattella+germanica%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Circadian regulation of permethrin susceptibility by glutathione S-transferase (BgGSTD1) in the German cockroach (Blattella germanica).</a> J. Insect Physiol. 65, 45-50 (2014).</li>
<li>Lozano, J., Kayukawa, T., Shinoda, T., Belles, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+taiman+in+insect+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genet%22%5BJournal%5D)">A role for taiman in insect metamorphosis.</a> PLOS Genet. 10, 1004769(2014).</li>
<li>Lozano, J., Montañez, R., Belles, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-2+family+regulates+insect+metamorphosis+by+controlling+the+juvenile+hormone+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">MiR-2 family regulates insect metamorphosis by controlling the juvenile hormone signaling pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 3740-3745 (2015).</li>
<li>Lin, Y. -H., Huang, J. -H., Liu, Y., Belles, X., Lee, H. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+delivery+of+dsRNA+lipoplexes+to+German+cockroach+protects+dsRNA+from+degradation+and+induces+RNAi+response%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag.+Sci%22%5BJournal%5D)">Oral delivery of dsRNA lipoplexes to German cockroach protects dsRNA from degradation and induces RNAi response.</a> Pest Manag. Sci. 73, 960-966 (2017).</li>
<li>Gharavi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chiral+cationic+polyamines+for+chiral+microcapsules+and+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">Chiral cationic polyamines for chiral microcapsules and siRNA delivery.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5919-5922 (2013).</li>
<li>Whyard, S., Singh, A. D., Wong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ingested+double-stranded+RNAs+can+act+as+species-specific+insecticides%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ingested double-stranded RNAs can act as species-specific insecticides.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 39, 824-832 (2009).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+responses+of+migratory+locusts+to+systemic+RNA+interference+via+double-stranded+RNA+injection+and+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential responses of migratory locusts to systemic RNA interference via double-stranded RNA injection and feeding.</a> Insect Mol. Biol. 22, 574-583 (2013).</li>
<li>Liu, J., Smagghe, G., Swevers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+response+of+BmToll9-1+and+RNAi+machinery+genes+to+exogenous+dsRNA+in+the+midgut+of+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional response of BmToll9-1 and RNAi machinery genes to exogenous dsRNA in the midgut of Bombyx mori.</a> J. Insect Physiol. 59, 646-654 (2013).</li>
<li>Airs, P. M., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+for+mosquito+and+mosquito-borne+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">RNA interference for mosquito and mosquito-borne disease control.</a> Insects. 8, 4(2017).</li>
<li>Taning, C. N. T., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10340-016-0736-9">Oral RNAi to control Drosophila suzukii: Laboratory testing against larval and adult stages.</a> J. Pest Sci. 89, 803-814 (2016).</li>
<li>Wu, S. Y., McMillan, N. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+systems+for+in+vivo+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Lipidic systems for in vivo siRNA delivery.</a> AAPS J. 11, 639-652 (2009).</li>
<li>Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+lipid+nanoparticles+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery.</a> Pharmaceutics. 5, 498-507 (2013).</li>
<li>Xia, Y., Tian, J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+surface+properties+on+liposomal+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effect of surface properties on liposomal siRNA delivery.</a> Biomaterials. 79, 56-68 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol biedt een methode voor doeltreffend RNAi via mondelinge levering van dsRNA lipoplexes, waarbij bescherming tegen ribonuclease vertering in de middendarm sap van de Duitse kakkerlak. Zoals blijkt uit andere onderzoeken bij verschillende insecten diersoorten, is het slechte RNAi effect via mondelinge levering van dsRNA meestal verantwoord door de afbraak van dsRNA8,9,10. Dit protocol produceert liposomen die als besch...

RNAi is aangetoond als een effectieve methode om vechtpartij genexpressie via een mechanisme van een post-transcriptional silencing pathway geactiveerd door dsRNA moleculen in vele eukaryoten1. De afgelopen tien jaar van studie, RNAi uitgegroeid tot een nuttig instrument om te bestuderen van de functies van genen van ontwikkeling tot gedrag door uitputting van de expressie van specifieke genen via injectie en/of voeding van dsRNA in verschillende taxa van insecten2,3. Wegens de specificiteit en de robuustheid van de afbrekende werking, wordt de toepassing van RNAi momenteel beschouwd als een mogelijke strategie voor pest control beheer4,5. Echter, de efficiëntie van RNAi varieert sterk tussen insecten soorten, afhankelijk van de verschillende genen worden gericht en de leveringsmethoden. Een groeiende hoeveelheid bewijs suggereert dat de instabiliteit van dsRNA, die is afgebroken door ribonucleasen, een cruciale factor in de beperkte effectiviteit van RNAi5,6 is. Bijvoorbeeld, is de lage RNAi gevoeligheid in de Manduca sexta uiteengezet door het feit dat de dsRNA gemengd met Hemolymfe snel aangetaste binnen 1 uur7was. Ook is de aanwezigheid van alkalische nucleasen in de middendarm, die efficiënt geconsumeerde dsRNA degraderen, sterk gecorreleerd met lage RNAi efficiëntie in verschillende insecten orders8,9,10.
De mondelinge levering van dsRNA is bijzonder interessant voor de toepassing van RNAi in een strategie voor het toegangsbeheer van pest, maar een methode om de afbraak van dsRNA door de nucleasen in de middendarm retard heeft nog niet zijn ontwikkeld, die zou hebben het potentieel om effectieve RNAi via voeding. Echter, de apathie van RNAi mondelinge levering van dsRNA is gemeld door de grote hoeveelheid dsRNA, bijvoorbeeld 50 µg in Bombyx mori, voeding of continu voeding voor 8 dagen (in totaal 8 µg dsRNA) bij de locust-soorten. De Duitse kakkerlak, Blattella germinica, is zeer gevoelig voor RNAi door de injectie van dsRNA11,12,13,14, maar is niet ontvankelijk voor dsRNA via voeding. Onlangs, Lin et al. (2017) hebben aangetoond dat de dsRNA ingekapseld met liposoom luchtvaartmaatschappijen resulteert in succesvolle RNAi aan knockdown de α-tubuline genexpressie in de middendarm en trigger aanzienlijke sterfte van de Duitse kakkerlak15. Zoals de afbraak van dsRNA in de middendarm de beperkende factor voor mondelinge RNAi is, dienen de liposomen vervoerders als een voertuig te dsRNA behoeden voor degradatie, dat gemakkelijk toepassing op andere insecten met sterke nuclease activiteiten in de darm is. Van de nota, de reden voor de keuze van de specifieke transfectiereagens (Zie Tabel van materialen) gebruikten we zoals liposoom vervoerder in het huidige protocol is dat het voor insect cel lijn transfectie is getest met minder toxiciteit, volgens de instructies van de fabrikant. Volgens de vergelijking van verschillende liposoom transfectie systemen in Gharavi et al. (2013) 16, de efficiëntie van transfecting Klein Mengend RNA (siRNA) is ongeveer hetzelfde tussen dit en andere commercieel beschikbare systemen die zijn gebruikt voor dsRNA levering systemen in andere insecten17,18 . Bovendien is onze voeding methode voorzichtig genoeg om de juiste hoeveelheid dsRNA wordt ingenomen door elke kakkerlak, en dat de resultaten zijn robuust en bevestigd. Kortom aantonen het huidige protocol en de resultaten dat met behulp van dsRNA lipoplexes dsRNA stabiliteit verbetert en de deur naar het ontwerp van de mondelinge uitspraak van de strategie van RNAi opent, die is een veelbelovende aanpak voor de bestrijding van plagen in de toekomst.

<table><tbody><tr><td>GenJe Plus DNA in vitro Transfection reagent</td><td>SignaGen</td><td>SL100499</td><td>voor lipoplexes voorbereiding</td></tr><tr><td>Blend Taq plus</td><td>TOYOBO&nbsp;</td><td>BTQ-201</td><td>voor PCR</td></tr><tr><td>Fast SYBR Green Master Mix</td><td>ABI&nbsp;</td><td>4385612</td><td>voor qPCR</td></tr><tr><td>FirstChoice RLM-RACE Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1700</td><td>voor 3' UTR identificatie&nbsp;</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>voor dsRNA synthese</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2239</td><td>verwijder DNA template van dsRNA</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>voor dsRNA of totale RNA extractie</td></tr><tr><td>RQ1 RNase-Free Dnase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>verwijder DNA template van totale RNA&nbsp;</td></tr><tr><td>chloorvorm&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>voor dsRNA of totale RNA extractie</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td>voor dsRNA of totale RNA extractie</td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24102</td><td>voor dsRNA of totale RNA extractie</td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonaat, DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>voor RNase vrije water voorbereiding</td></tr><tr><td>glucose oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3285</td><td>voor lipoplexes voorbereiding</td></tr><tr><td>Natriumchloride, NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>insect saline buffer formule</td></tr><tr><td>Kaliumchloride, KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>insect saline buffer formule</td></tr><tr><td>Calciumchloride, CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>insect saline buffer formule</td></tr><tr><td>Magnesiumchloride hexahydraat, MgCl2.6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>insect saline buffer formule</td></tr><tr><td>EGTA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td>enzymremmer&nbsp;</td></tr><tr><td>dissectie schaar</td><td>F.S.T.</td><td></td><td>kakkerlak dissectie</td></tr><tr><td>fijne pincet</td><td>F.S.T.</td><td></td><td>kakkerlak dissectie</td></tr><tr><td>flexibele pincet</td><td>F.S.T.</td><td></td><td>kakkerlak vasthouden&nbsp;</td></tr><tr><td>pipetman</td><td>RAININ</td><td>P10</td><td>monstervoorbereiding</td></tr><tr><td>microcentrifuge buisje</td><td>Axygen</td><td>MCT175C, PCR02C</td><td>monstervoorbereiding</td></tr><tr><td>pipettip&nbsp;</td><td>Axygen</td><td></td><td>monstervoorbereiding</td></tr><tr><td>vortexter</td><td>Digisystem</td><td>vm1000</td><td>monstervoorbereiding</td></tr><tr><td>Minispin centrifuge</td><td>The Gruffin Group</td><td>GMC 206</td><td>voor vloeibare spin down&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>ALC</td><td>PK121R</td><td>monstervoorbereiding</td></tr><tr><td>pH meter&nbsp;</td><td>JENCO</td><td>6071</td><td>voor pH aanpassing</td></tr><tr><td>micro-volume spectrofotometer</td><td>Quawell</td><td>Q3000</td><td>nucleïnezuur kwantitatief</td></tr><tr><td>PCR Thermische cycler</td><td>ABI&nbsp;</td><td>2720</td><td>voor sjabloon PCR of&nbsp; dsRNA synthese incubatie&nbsp;</td></tr><tr><td>kwantitatieve real-time PCR</td><td>ABI&nbsp;</td><td>StepOne plus</td><td>genexpressie kwantitatief</td></tr><tr><td>Centrifugale vacuüm concentrators</td><td>eppendorf</td><td>5301</td><td>voor dsRNA of totale RNA extractie</td></tr><tr><td>Multipette&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>xstream</td><td>voor real-time PCR monster laden&nbsp;</td></tr><tr><td>Agarose I</td><td>amresco</td><td>0710</td><td>voor nucleïnezuur elektroforese</td></tr><tr><td>tub gen specifiek voorwaartse preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA</td></tr><tr><td>tub gen specifiek omgekeerde preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA</td></tr><tr><td>dsTub template voorwaartse primer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG&nbsp;</td></tr><tr><td>dsTub template omgekeerde primer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG&nbsp;</td></tr><tr><td>dsEGFP template voorwaartse preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG</td></tr><tr><td>dsEGFP template omgekeerde preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC</td></tr><tr><td>tub qPCR voorwaartse primer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC</td></tr><tr><td>tub qPCR omgekeerde preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC</td></tr><tr><td>ef1 qPCR voorwaartse primer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A</td></tr><tr><td>ef1 qPCR omgekeerde preimer</td><td>tri-I biotech</td><td></td><td>CCT GCA GAG GAA GAC GAA G</td></tr></tbody></table>

praktisch gebruik van rna-interferentie: mondelinge levering van double-stranded rna in liposomen dragers voor kakkerlakken

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

RNA-interferentie (RNAi) is algemeen toegepast voor het blootleggen van de biologische functies van talrijke genen, en als een pest control tool operationele door verstoring van essentiële genexpressie is overwogen. Hoewel verschillende methoden, zoals injectie, voeding en inweken, hebben gemeld voor de succesvolle levering van double-stranded RNA (dsRNA), is de efficiëntie van RNAi via mondelinge levering van dsRNA zeer variabel tussen verschillende groepen van insecten. De Duitse kakkerlak, Blattella germanica, is zeer gevoelig voor de injectie van dsRNA, zoals blijkt uit de vele studies die eerder zijn gepubliceerd. De huidige studie beschrijft een methode om aan te tonen dat de dsRNA ingekapseld met liposoom dragers voldoende is om de afbraak van dsRNA retard door middendarm SAP. Met name de doorlopende invoer van dsRNA ingekapseld door liposomen aanzienlijk vermindert de tubuline expressie in de middendarm, en leidde tot de dood van kakkerlakken. Kortom, zou de formulering en het gebruik van dsRNA lipoplexes, die tegen nucleasen dsRNA beschermen, een praktisch gebruik van RNAi voor insecten bestrijding van plagen in de toekomst.

Een vereenvoudigde regeling van het protocol voor de mondelinge levering van dsRNA wordt gepresenteerd in Figuur 1, waar de belangrijkste stappen voor de voorbereiding van dsRNA lipoplexes worden getoond.
Om te onderzoeken van de bescherming van liposoom vervoerders op dsRNA afbraak in de middendarm sap van B. germanica, een ex vivo bepaling, waar dsTub lipoplexes werden geïncubeer...

Dit manuscript toont de uitputting van de genexpressie in de middendarm van de Duitse kakkerlak via orale inname van double-stranded RNA ingekapseld in liposomen.

Praktisch gebruik van RNA-interferentie: mondelinge levering van Double-stranded RNA in liposomen dragers voor kakkerlakken

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

Het algemene doel van dit protocol is om de genexpressie in de darm van kakkerlakken te verminderen door middel van RNA-interferentie via orale inname van dubbelstrengs RNA ingekapseld in liposoomdragers. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen bij de ontwikkeling van nieuwe ongediertebestrijdingsmethoden, zoals kan het uit schakelen van essentiële genen in het open veld ongedierte doden? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het liposoom het gen-specifieke dubbelstrengs RNA beschermt om de levering aan de doelcel te garanderen.De procedure zal worden gedemonstreerd door Jia-Hsin Huang, een postdoc, en Yun Liu, een technicus uit mijn laboratorium. Om te beginnen, verdoof de kakkerlakken op ijs tot ze drie minuten lang niet bewegen. Neem vervolgens een insect op met de duim en wijsvinger om toegang te krijgen tot de ventrale zijde.Gebruik vervolgens een dissectieschaart om het uiteinde van een coxa van een achterpoot af te snijden tussen de coxa en de trochanter. Elders op de coxa snijden is minder efficiënt voor de hemolymphverzamelingen. Plaats nu een micropipet van 10 microliter op de incisie en knijp zachtjes in de buik terwijl u het bloedende hemolymph opzuigt.Herhaal dit proces totdat het hemolymph van vijf kakkerlakken is verzameld in één microcentrifugebuisje. Draai vervolgens het gepoolde hemolymph kort gedurende 10 seconden. Combineer vervolgens 10 microliter hemolymph met 50 microliter 1x insectenzoutoplossing.Centrifugeer nu het verdunde hemolymph gedurende 10 minuten om de hemocyten uit de oplossing te trekken. Breng vervolgens de supernatant over naar een nieuw buisje. Kwantificeer ten slotte de totale eiwitconcentratie met behulp van een microvolume UV-Vis-spectrofotometer en pas de concentratie van elk monster aan op zes milligram eiwit per microliter.Om darsavloeistof te verzamelen, verdoof eerst de kakkerlakken op ijs. Breng vervolgens een naar een dissectieschaal geladen met koude 1x insectenzoutoplossing en gebruik insectenspelden om het op buikzijde omhoog vast te zetten. Disseceer nu de buik met behulp van fijne pincetten.Verwijder vervolgens het gehele darmkanaal en breng het over naar een nieuw schaaltje met 1x insectenzoutoplossing. Isoleer vervolgens de middelste darm, dat is het gebied tussen de slokdarm en de Malpighische buisjes. Om dit te doen, verwijder het voorste deel van het dier en verwijder het rectum.Breng vervolgens de middelste darm snel over naar een microcentrifugebuisje met 100 microliter insectenzoutoplossing. Verzamel de middelste darmen van zes kakkerlakken in hetzelfde buisje. Vorm vervolgens het buisje gedurende 10 seconden.Centrifugeer vervolgens het mengsel gedurende 10 minuten om de hemocyten en darmweefsels te scheiden. Breng vervolgens de supernatant over naar een schone microcentrifugebuis en pas de concentratie aan op zes milligram eiwit per microliter. Dubbelstrengs RNA-lipoplexen moeten binnen een uur na bereiding worden gebruikt.Zorg er tijdens de bereiding voor dat alle verdunde reagentia met het verdunde dubbelstrengs RNA tegelijkertijd worden gecombineerd. Vorm vervolgens het mengsel snel en incubeer het. Eenmaal klaar, meng vier microliter van de dubbelstrengs RNA-oplossing met 10 microliter insectenzoutoplossing als controle, of meng het met 10 microliter geëxtraheerde enzymen uit hemolymph of darsavloeistof.Maak vervolgens een enzym-geïnhibeerde controle door twee microliter EGTA toe te voegen. Voeg anders twee microliter RNase-vrij water toe. Incubeer vervolgens de monsters gedurende een uur of langer bij 25 graden Celsius.Na de incubatie, voeg 200 microliter extractiereagens en 40 microliter chloroform toe en vorm. Centrifugeer vervolgens de monsters gedurende 10 minuten. Breng vervolgens 150 microliter van elke supernatant over naar een nieuw buisje en precipiteer het dubbelstrengs RNA uit elk monster door 150 microliter isopropanol toe te voegen en de monsters gedurende 15 minuten op ijs te incuberen.Na de incubatie, centrifugeer de monsters opnieuw en gooi de supernatant weg. Was vervolgens de RNA-pellets twee keer door 200 microliter van de 70%ethanol aan elke pellet toe te voegen en het buisje te centrifugeren. Na de tweede wassing, droog de dubbelstrengs RNA-pellets gedurende drie minuten met behulp van een centrifugale vacuümconcentrator.Breng vervolgens de pellets op in 10 microliter RNase-vrij water. Controleer ten slotte de integriteit van het behandelde dubbelstrengs RNA met behulp van een 1,5% agarosegel. Voer de kakkerlakken tweemaal per dag, een uur na het aanzetten van het licht en een uur voor het uitzetten van het licht.Doe dit gedurende acht of zestien dagen zonder pauzes. Tijdens deze tijd moeten de kakkerlakken verder waterloos zijn. Zorg ervoor dat er vers bereide dubbelstrengs RNA-lipoplexen en naakt dubbelstrengs RNA beschikbaar zijn voor het voeren.Voor de bolus, gebruik vier microliter dubbelstrengs RNA-lipoplexen of 250 nanogram naakt dubbelstrengs RNA. Om een kakkerlak te voeren, pak hem eerst bij de vleugels met flexibele pincetten. Pak de lichaamsdelen van een kakkerlak niet vast.Pipetteer vervolgens langzaam de druppel oplossing dicht bij de monddelen en kijk hoe de kakkerlak de druppel inneemt. Bied na de laatste voeding waterflessen aan de kakkerlakken. Beoordeel gedurende de hele voedingsperiode de insecten dagelijks om mortaliteit te controleren en verwijder eventuele kakkerlakken die niet meer bewegen uit het experiment.Continue orale toediening van dubbelstrengs tub lipoplexen kon de tubuline-expressie in de middelste darm verlagen van 40% op dag negen tot 60% op dag 17. Ter vergelijking, naakt dubbelstrengs RNA had geen effect. Dit is hoogstwaarschijnlijk te wijten aan het feit dat blootstelling van het naakte dubbelstrengs RNA aan darsavloeistof binnen een uur tot afbraak leidde, terwijl het liposoom-geconjugeerde dubbelstrengs

practical-use-rna-interference-oral-delivery-double-stranded-rna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

RNA-interferentie is bewezen zeer effectief te genfunctie te analyseren...

RNAi Interferentie door dsRNA Injectie in Drosophila Embryo&#39;s

Hier beschrijven we een werkwijze voor het remmen van genfunctie in ziektedragers muggen door het gebruik van chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes die worden opgenomen door larven.

Chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes gemedieerde gen silencing in Disease Vector muggenlarven

Hier presenteren we protocollen voor het kweken van een intermediair-kiem kever, Dermestes maculatus (D. maculatus) in het lab. We hebben ook protocollen voor de embryonale en ouderlijke RNAi en methodes te delen voor het analyseren van embryonale fenotypes voor bestudering van genfunctie in deze soort.

Grootbrengen en Double-stranded RNA-gemedieerde gen knock-down in het verbergen Kever, Dermestes maculatus

Dit artikel demonstreert nieuwe technieken ontwikkeld voor mondelinge levering van double-stranded RNA (dsRNA) via de vaatbundels weefsels van planten voor RNA-interferentie (RNAi) in het floëem sap voederen van insecten.

Double-stranded RNA orale afleveringsmethoden voor het opwekken van RNA-interferentie in het floëem en Hemipteran insecten Plant-sap-voeding

Dit protocol beschrijft een microinjection methodologie die we hebben gestandaardiseerd en gebruikt jarenlang voor bepaalde hoeveelheden van nucleïnezuren rechtstreeks naar de Hemolymfe van muggen en huis vliegt. Dit protocol resulteert in minimale injectie sterfte en laat dosis gecorreleerd metingen van vruchtbaarheid.

Reproduceerbaar dsRNA Microinjection en Oviposition Bioassay in muggen en huis vliegt

RNA interferentie is een breed toepasbare, krachtige techniek voor het manipuleren van genexpressie in specifieke ontwikkelingsstadia. Hier beschrijven we de noodzakelijke stappen voor de implementatie van deze techniek in de aquatische duikkever Thermonectus marmoratus, van de verwerving van gensequenties tot het knockdownen van genen die de structuur of het gedrag beïnvloeden.

RNA Interferentie in aquatische kevers als een krachtig instrument voor het manipuleren van genexpressie op specifieke ontwikkelingstijdpunten

De orale toediening van dsRNA geproduceerd door bacteriën, een toedieningsmethode voor RNA-interferentie (RNAi) die routinematig wordt gebruikt bij Caenorhabditis elegans, werd hier met succes toegepast op volwassen muggen. Onze methode maakt robuuste omgekeerde geneticastudies en transmissieblokkerende vectorstudies mogelijk zonder het gebruik van injectie.

Effectieve orale RNA-interferentie (RNAi) toediening aan volwassen Anopheles gambiae muggen

Het huidige protocol beschrijft stapsgewijze richtlijnen voor de RNAi-operatietechnieken in P. americana.

Toepassingen van RNA-interferentie in Amerikaanse kakkerlak

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de afgifte van chitosan/dsRNA-nanodeeltjes in larven van zijderups Bombyx mori om genuitschakeling te induceren door inslikken.

Larvale RNA-interferentie in zijderups Bombyx mori door Chitosan/dsRNA-afgifte van nanodeeltjes

Deze methode beschrijft de hoge opbrengst in vitro synthese van zowel gecapte als ongecapte mRNA vanuit een gelineariseerd plasmide dat het Gaussia luciferase (GLuc) gen bevat. Het RNA wordt gezuiverd en een fractie van het ongecapte RNA wordt enzymatisch gecapt met behulp van het capping-enzym van het Vaccinia virus. In de laatste stap wordt het mRNA getransfecteerd in HeLa-cellen en worden de supernatanten van de celcultuur geanalyseerd op luciferase-activiteit.

In vitro transcriptie en aftopping van Gaussia Luciferase mRNA Gevolgd door HeLa celtransfectie

Leer RNA-interferentie via orale toediening van dubbelstrengig RNA in liposomen voor genexpressie-vermindering in de darm van de Duitse kakkerlak. Deze methode biedt nieuwe mogelijkheden voor biologische plaagbestrijding.

Praktisch gebruik van RNA-interferentie: mondelinge levering van Double-stranded RNA in liposomen dragers voor kakkerlakken

Meer video's verkennen