Praktisch gebruik van RNA-interferentie: mondelinge levering van Double-stranded RNA in liposomen dragers voor kakkerlakken

Het algemene doel van dit protocol is om de genexpressie in de darm van kakkerlakken te verminderen door middel van RNA-interferentie via orale inname van dubbelstrengs RNA ingekapseld in liposoomdragers. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen bij de ontwikkeling van nieuwe ongediertebestrijdingsmethoden, zoals kan het uit schakelen van essentiële genen in het open veld ongedierte doden? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het liposoom het gen-specifieke dubbelstrengs RNA beschermt om de levering aan de doelcel te garanderen.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Jia-Hsin Huang, een postdoc, en Yun Liu, een technicus uit mijn laboratorium. Om te beginnen, verdoof de kakkerlakken op ijs tot ze drie minuten lang niet bewegen. Neem vervolgens een insect op met de duim en wijsvinger om toegang te krijgen tot de ventrale zijde.

Gebruik vervolgens een dissectieschaart om het uiteinde van een coxa van een achterpoot af te snijden tussen de coxa en de trochanter. Elders op de coxa snijden is minder efficiënt voor de hemolymphverzamelingen. Plaats nu een micropipet van 10 microliter op de incisie en knijp zachtjes in de buik terwijl u het bloedende hemolymph opzuigt.

Herhaal dit proces totdat het hemolymph van vijf kakkerlakken is verzameld in één microcentrifugebuisje. Draai vervolgens het gepoolde hemolymph kort gedurende 10 seconden. Combineer vervolgens 10 microliter hemolymph met 50 microliter 1x insectenzoutoplossing.

Centrifugeer nu het verdunde hemolymph gedurende 10 minuten om de hemocyten uit de oplossing te trekken. Breng vervolgens de supernatant over naar een nieuw buisje. Kwantificeer ten slotte de totale eiwitconcentratie met behulp van een microvolume UV-Vis-spectrofotometer en pas de concentratie van elk monster aan op zes milligram eiwit per microliter.

Om darsavloeistof te verzamelen, verdoof eerst de kakkerlakken op ijs. Breng vervolgens een naar een dissectieschaal geladen met koude 1x insectenzoutoplossing en gebruik insectenspelden om het op buikzijde omhoog vast te zetten. Disseceer nu de buik met behulp van fijne pincetten.

Verwijder vervolgens het gehele darmkanaal en breng het over naar een nieuw schaaltje met 1x insectenzoutoplossing. Isoleer vervolgens de middelste darm, dat is het gebied tussen de slokdarm en de Malpighische buisjes. Om dit te doen, verwijder het voorste deel van het dier en verwijder het rectum.

Breng vervolgens de middelste darm snel over naar een microcentrifugebuisje met 100 microliter insectenzoutoplossing. Verzamel de middelste darmen van zes kakkerlakken in hetzelfde buisje. Vorm vervolgens het buisje gedurende 10 seconden.

Centrifugeer vervolgens het mengsel gedurende 10 minuten om de hemocyten en darmweefsels te scheiden. Breng vervolgens de supernatant over naar een schone microcentrifugebuis en pas de concentratie aan op zes milligram eiwit per microliter. Dubbelstrengs RNA-lipoplexen moeten binnen een uur na bereiding worden gebruikt.

Zorg er tijdens de bereiding voor dat alle verdunde reagentia met het verdunde dubbelstrengs RNA tegelijkertijd worden gecombineerd. Vorm vervolgens het mengsel snel en incubeer het. Eenmaal klaar, meng vier microliter van de dubbelstrengs RNA-oplossing met 10 microliter insectenzoutoplossing als controle, of meng het met 10 microliter geëxtraheerde enzymen uit hemolymph of darsavloeistof.

Maak vervolgens een enzym-geïnhibeerde controle door twee microliter EGTA toe te voegen. Voeg anders twee microliter RNase-vrij water toe. Incubeer vervolgens de monsters gedurende een uur of langer bij 25 graden Celsius.

Na de incubatie, voeg 200 microliter extractiereagens en 40 microliter chloroform toe en vorm. Centrifugeer vervolgens de monsters gedurende 10 minuten. Breng vervolgens 150 microliter van elke supernatant over naar een nieuw buisje en precipiteer het dubbelstrengs RNA uit elk monster door 150 microliter isopropanol toe te voegen en de monsters gedurende 15 minuten op ijs te incuberen.

Na de incubatie, centrifugeer de monsters opnieuw en gooi de supernatant weg. Was vervolgens de RNA-pellets twee keer door 200 microliter van de 70%ethanol aan elke pellet toe te voegen en het buisje te centrifugeren. Na de tweede wassing, droog de dubbelstrengs RNA-pellets gedurende drie minuten met behulp van een centrifugale vacuümconcentrator.

Breng vervolgens de pellets op in 10 microliter RNase-vrij water. Controleer ten slotte de integriteit van het behandelde dubbelstrengs RNA met behulp van een 1,5% agarosegel. Voer de kakkerlakken tweemaal per dag, een uur na het aanzetten van het licht en een uur voor het uitzetten van het licht.

Doe dit gedurende acht of zestien dagen zonder pauzes. Tijdens deze tijd moeten de kakkerlakken verder waterloos zijn. Zorg ervoor dat er vers bereide dubbelstrengs RNA-lipoplexen en naakt dubbelstrengs RNA beschikbaar zijn voor het voeren.

Voor de bolus, gebruik vier microliter dubbelstrengs RNA-lipoplexen of 250 nanogram naakt dubbelstrengs RNA. Om een kakkerlak te voeren, pak hem eerst bij de vleugels met flexibele pincetten. Pak de lichaamsdelen van een kakkerlak niet vast.

Pipetteer vervolgens langzaam de druppel oplossing dicht bij de monddelen en kijk hoe de kakkerlak de druppel inneemt. Bied na de laatste voeding waterflessen aan de kakkerlakken. Beoordeel gedurende de hele voedingsperiode de insecten dagelijks om mortaliteit te controleren en verwijder eventuele kakkerlakken die niet meer bewegen uit het experiment.

Continue orale toediening van dubbelstrengs tub lipoplexen kon de tubuline-expressie in de middelste darm verlagen van 40% op dag negen tot 60% op dag 17. Ter vergelijking, naakt dubbelstrengs RNA had geen effect. Dit is hoogstwaarschijnlijk te wijten aan het feit dat blootstelling van het naakte dubbelstrengs RNA aan darsavloeistof binnen een uur tot afbraak leidde, terwijl het liposoom-geconjugeerde dubbelstrengs