De rol van zelfkopiërende plasmiden testen in de ontwikkeling van resistentie tegen antibiotica
May 2nd, 2018
Hier presenteren we een experimentele methode om te testen van de rol van zelfkopiërende plasmiden in de ontwikkeling van resistentie tegen antibiotica.
Het algemene doel van deze experimentele methode is om de rol van multicopy plasmiden in de evolutie van antibioticaresistentie te testen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van microbiologie te beantwoorden, zoals de rol van multicopy plasmiden in de evolutie van bacteriële innovaties. Het grote voordeel van deze techniek is dat het alleen eenvoudige moleculaire biologiemethoden en een eenvoudig experimenteel ontwerp vereist.
Het is echt cool. Eerst wordt de e coli MG1655-stam geconstrueerd die het antilichaamresistentiegen in het chromosoom in de lambda-faag aan de ATTB-zijde van de vergelijking zal dragen. Om dit te doen, versterkt u de 500 base paralong-regio's aan beide zijden van de ATTB-site met PCR.
Versterk vervolgens het antibioticaresistentiegen met PCR. Gebruik vervolgens isotherme assemblage bij 50 graden Celsius gedurende 30 minuten om de homologiegebieden aan het PCR-product te fuseren. Na isotherme assemblage, brengt u één microliter van het product over naar 40 microliters elektrocompetente MG1655-cellen in een twee millimeter cuvet.
Elektroporeren vervolgens de cellen bij 4 graden Celsius en 2,5 kilovolt. Na elektroporatie, brengt u de cellen in één milliliter LB-bouillon met 0,2% arabinos over. Pipetteer vervolgens de LB-bouillon met cellen naar een microfugebuisje.
Schud de buis intensief gedurende twee uur bij 30 graden Celsius. Na twee uur, plateert u 100 microliter van de cultuur op de LB-agarplaat, aangevuld met antibiotica. Spin vervolgens de resterende cellen naar beneden.
En suspendeer de pellet in 100 microliter verse LB-bouillon. Plateer deze cellen opnieuw op een andere LB-agarplaat. Bewaar vervolgens de platen een nacht bij 42 graden Celsius.
De volgende dag versterkt u de klonen met PCR om de constructie te verifiëren met behulp van externe primers ybhC extern en ybhB extern. Bevestig vervolgens de amplicongrootte via agaroseschelelektroforese. Parallel voert u DNA-sequencing uit om de sequentie van het ingebrachte gen te verifiëren.
Om de stam te construeren om het antilichaamresistentiegen in het multicopy plasmide te dragen, versterkt u eerst het antibioticaresistentiegen blaTEM-1 met PCR. Nadat de PCR is voltooid, fosforyleert u het versterkte product met behulp van T4-polynucleotidekinase. Gebruik vervolgens hoge-fideliteitspolymerase en oligonucleotiden PBAD FINV en PBAD RINV, om de PBAD-plasmidebackbone met PCR te versterken.
Vervolgens ligeerd u de twee PCR-fragmenten met behulp van T4-ligase. Elektroporeer vervolgens 40 microliters DH5 alfa-cellen met 1 microliter van het ligatieproduct. Selecteer vervolgens het juiste antibioticum voor het antibioticaresistentiegen en de plasmidebackbone op agarplaten.
Voer vervolgens plasmide-extractie uit met behulp van een DNA-extractiekit, volgens de instructies van de fabrikant. Voer vervolgens Sanger-sequencing van het resistentiegen van belang uit om de afwezigheid van eventuele mogelijke mutaties te bevestigen vóór de evolutie-experimenten. Na verificatie van de sequentie, elektroporeert u het plasmide in de e coli-stam MG1655 om uiteindelijk de plasmidedragende MG1655-stam te verkrijgen.
De meest kritische stappen in dit protocol zijn de constructie van de modelsystemenstammen en de reconstructie van de mutaties die tijdens experimentele evolutie werden waargenomen. Steek eerst de MG1655-stammen van belang op de LB-agarplaten. Voeg vervolgens 200 microliter LB-medium toe in elk putje van een 96-wellsplaat.
Vervolgens inoculeert u 48 geïsoleerde kolonies van elke stam in individuele putjes van de plaat. Na inoculatie, bewaart u de plaat een nacht bij 37 graden Celsius op een shaker bij 200 omwentelingen per minuut. Inoculeert u vervolgens twee microliters van de cultuur uit elk putje met de stichterpopulatie naar een nieuwe 96-wellsplaat met 198 microliters LB-medium in individuele putjes.
Dit start het evolutionaire reddingsexperiment. Bewaart u de plaat bij 37 graden Celsius op een shaker bij 200 omwentelingen per minuut gedurende 20 uur. Verdubbelt u elke dag de antibioticakoncentratie van die van de vorige dag.
De volgende dag, brengt u 2 microliters van de respectieve cultuur over naar een verse 96-wellsplaat en herhaalt u dit elke dag. Noteert u de optische dichtheidswaarde bij 600 nanometer van de individuele putjes op een platelezer. Een cruciale stap van het protocol is de experimentele evolutie en de toenemende concentraties antibiotica.
De veranderingssnelheid van antibioticakoncentraties is een van de parameters die kan worden aangepast om de evolutie van antibioticaresistentie te bevorderen. Bewaart u vervolgens de plaat bij 37 graden Celsius op een shaker bij 200 omwentelingen per minuut gedurende 20 uur. Meet vervolgens de optische dichtheidswaarde bij 600 nanometer voor elke overlevende populatie elke dag op de platelezer.
Bewaart u de populaties periodiek, elke drie tot vijf dagen, ingevroren. Extraheert u het totale DNA uit de geëvolueerde populaties en de klonen van verschillende stammen en behandelingen. Meet vervolgens de absorptieratio's bij 260:280 en 260:230 nanometer op de spectrofotometer om de kwaliteit van het DNA te bepalen.
Gebruik vervolgens een fluorescerend DNA-bindende kleurstof en bevestig de concentratie van het DNA door de fluorescentie op de platelezer te meten. Onderwerpt u het DNA bovendien aan agarose-gelelektroforese om te bevestigen dat er geen DNA-degradatie of RNA-verontreiniging is. Voer vervolgens diep DNA-sequencing uit met monsters verkregen van hele populaties en individuele klonen om de genetische basis van antibioticaresistentie te bestuderen.
Deze studie is een voorbeeld van de mogelijke resultaten van het experimentele systeem met behulp van drie e coli-stammen. Deze stammen zijn e coli MG1655, MG1655 die het resistentiegen in het chromosoom MG1655 resA draagt en MG1655 die het resistentiegen in het multicopy plasmide draagt, MG1655 pRESA. De gebruikte antibiotica zijn ceftazidime en meropenem.
Dit linkerpaneel toont de overlevingscurves onder toenemende concentraties ceftazidime. Uit de plot is duidelijk dat de subset van
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een experimentele methode om de rol van multicopy plasmiden in de evolutie van antibioticaresistentie te onderzoeken. De methode is ontworpen om belangrijke vragen in de microbiologie met betrekking tot bacteriële innovaties te beantwoorden.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Antibioticaresistentie
- Plasmidbiologie
Achtergrond
- Multicopy plasmiden kunnen de bacteriële evolutie beïnvloeden.
- Het begrijpen van hun rol is cruciaal voor het aanpakken van antibioticaresistentie.
- Dit onderzoek maakt gebruik van elementaire moleculaire biologietechnieken.
- Het experimentele ontwerp is eenvoudig en toegankelijk.
Doel van het onderzoek
- Om de rol van multicopy plasmiden in de evolutie van antibioticaresistentie te testen.
- Om te onderzoeken hoe plasmiden bijdragen aan bacteriële innovaties.
- Om inzichten te bieden in de mechanismen van antibioticaresistentie.
Gebruikte methoden
- Constructie van E. coli MG1655 stam met antibioticumresistentiegen.
- PCR-amplificatie van regio's die de ATTB-site flankeren.
- Gebruik van lambda-fagen voor genintegratie.
- Eenvoudig experimenteel ontwerp dat basis-moleculaire biologiemethoden vereist.
Belangrijkste resultaten
- Demonstreerden de haalbaarheid van het gebruik van multicopy plasmiden in experimenten.
- Bieden een methode om de impact van plasmiden op antibioticaresistentie te analyseren.
- Benadrukken het potentieel voor verder onderzoek in bacteriële evolutie.
- Tonen aan dat eenvoudige technieken belangrijke inzichten kunnen opleveren.
Conclusies
- Multicopy plasmiden spelen een belangrijke rol in de evolutie van antibioticaresistentie.
- Deze methode kan verdere studies in de microbiologie faciliteren.
- Het begrijpen van plasmidedynamiek is essentieel voor het bestrijden van antibioticaresistentie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding how multicopy plasmids accelerate the evolution of antibiotic resistance genes is critical for de-risking early anti-infective discovery and portfolio triage. This experimental system enables direct interrogation of gene copy number effects on resistance acquisition, informing predictive models of bacterial adaptation. The approach supports strategic decision-making at the intersection of target validation and resistance mechanism assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic de-risking of resistance gene evolution in bacterial systems.
- Clarifies the impact of gene dosage on functional target validation for resistance pathways.
- Supports predictive confidence in selecting anti-infective targets less prone to rapid resistance.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated E. coli strains for resistance evolution assays.
- Standardizes experimental evolution protocols for reproducible resistance acquisition studies.
- Generates quantitative survival and growth data under defined antibiotic pressures.
Translational & Preclinical Research
- Aligns experimental outputs with translational biomarker discovery for resistance mechanisms.
- Provides continuity from molecular evolution studies to preclinical resistance validation.
- Informs risk-adjusted advancement of anti-infective candidates based on resistance potential.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven testing of resistance gene evolution and supporting downstream screening and analytics.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing on the role of gene copy number in resistance acquisition.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative survival data for comparative analysis of strain constructs.
- Analytics: Provides deep sequencing outputs to identify and confirm resistance-conferring mutations.
- Translational Research: Bridges molecular evolution findings to preclinical resistance risk assessment.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, scalable system for repeated resistance evolution studies across targets and antibiotics.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in resistance mechanism identification and target validation.
- Operational Value: Standardizes resistance evolution workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions by quantifying resistance acquisition risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of anti-infective assets based on resistance evolution data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, bacterial genetics, and experimental evolution.
- Needs access to PCR, electroporation, plate readers, and deep sequencing infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of strain construction and evolution protocols.
- Adaptable to different resistance genes and antibiotics with protocol modifications.
- Dependent on accurate phenotypic and genotypic validation of evolved strains.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:33
Construction of the Experimental System Encoding the Antibiotic Resistance Gene
4:19
Evolutionary Rescue Approach to Experimentally Evolve Antibiotic Resistance
6:14
Molecular Basis of the Evolution of Antibiotic Resistance
7:05
Results: Study of Evolutionary Rescue and Molecular Basis Underlying the Plasmid Mediated Evolution using DNA Sequencing
8:35
Conclusion
