Aanpassing van micro-elektrode Array technologie voor de studie van anesthesie-geïnduceerde neurotoxiciteit in de hersenen Intact Knorretje
12 mei 2018
Deze studie verkent het nieuwe gebruik van enzym gebaseerde micro-elektrode matrix (MEA) technologie om te controleren in vivo neurotransmitter activiteit bij biggen. De hypothese was dat glutamaat disregulatie draagt bij aan het mechanisme van verdoving neurotoxiciteit. Hier presenteren we een protocol aan te passen van MEA technologie om te bestuderen van het mechanisme van anesthesie-geïnduceerde neurotoxiciteit.
Het algemene doel van deze experimentele procedure is om een nieuwe toepassing van enzym-gebaseerde micro-elektrodenarraytechnologie te gebruiken om neurotransmitters te meten in neonatale biggen. In dit voorbeeld wordt in vivo glutamaatactiviteit onderzocht om anesthesie-geïnduceerde neurotoxiciteit te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het in vivo neurotransmitteractiviteit kan meten met uitzonderlijke ruimtelijke en temporele resolutie in een klinisch relevant diermodel van anesthesie-geïnduceerde neurotoxiciteit.
Hoewel deze methode inzicht kan bieden in mechanismen van anesthesie-geïnduceerde neurotoxiciteit, kan het ook worden toegepast op andere pathologische toestanden, zoals pediatrisch hersenletsel, epilepsie en beroerte. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen, omdat het gebruik van het biggenmodel ervaring en oefening in implementatie vereist. Bovendien vereist het gebruik van micro-elektrodenarrays een gespecialiseerde vaardighedenset.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de chirurgische en micro-elektrodenplaatsingsstappen moeilijk te leren zijn vanwege hun delicate aard. Voor dit experiment gebruikt u biggen tijdens hun piektijd van hersengroei, wanneer ze drie tot vijf dagen oud zijn. Laat ze minimaal 24 uur acclimatiseren voor het experiment.
Getraind personeel moet voor de biggen zorgen. Ze moeten ad lib toegang hebben tot voeding, dekens en wat speelgoed voor stimuli. Verwijder ten minste drie uur voorafgaand aan anesthesie de melkvervanger uit de kooi om ervoor te zorgen dat de maag van het big is leeggemaakt.
Volg de ARRIVE-richtlijnen om eventuele potentiële geslachtsgebonden confounders te elimineren. Later, bij een anesthesiewerkstation uitgerust met een pediatrische ventilator en geschikte bewakingsapparaten, intubeer en beadeem het big met mechanische ventilatie. Geef vervolgens sevofluraan-anesthesie met 1 MAC gedurende 3,5 uur anesthesie.
Gebruik nu een teenprikt om een adequate diepte van anesthesie te bevestigen en zet vervolgens het big vast in een specifiek stereotactisch frame voor biggen met voldoende padding. Plaats de tanden van de maxilla over de tandbalk. Fixeer en draai vervolgens de twee penetrerende oorbars vast met het big gecentreerd op de middellijn.
Plaats de oorbars stevig genoeg om de trommelvliezen te horen ploppen. Start een rocuronium laaddosis en een infusie om bewegingen te voorkomen terwijl het big in het frame is bevestigd. Het is van vitaal belang dat het big warm blijft en dat zijn vitale functies worden gecontroleerd.
Gebruik een verwarmingslamp en/of een deken om een normale thermische temperatuur te behouden. Zorg ervoor dat de verwarmingslamp niet zo dichtbij is dat hij brandt. Als overleving van het big gewenst is, neem aanvullende voorbereidingen om het operatieveld steriel te houden.
Ga nu verder met de implantatie van de micro-elektrodenarray. Om te beginnen, maakt u een vier- tot zes-centimeter middenlijn incisie langs de schedel, met de nodige voorzichtigheid om de schedel niet te scoren met het scalpel. Zodra de incisie is gemaakt, gebruikt u zachte retractie en blunte dissectie om de hoofdhuid van de schedel te scheiden.
Schrob vervolgens voorzichtig de schedel met een gaaspad om eventueel bindweefsel te verwijderen en de naadlijnen bloot te leggen. Bepaal vervolgens de beoogde locatie voor de craniotomie. Als het gebied van interesse nog steeds verhuld is, reflecteer de hoofdhuid verder.
Gebruik nu een chirurgische boor om een craniotomie-venster te maken van ongeveer 0,25 vierkante centimeter boven de structuur van interesse. Wees voorzichtig om de dura of de onderliggende hersenen niet te verwonden. Gebruik zo nodig fijne chirurgische gereedschappen om de dura boven de hersenweefsels te verwijderen.
Gebruik uiterste voorzichtigheid om schade aan de hersenen te voorkomen. Dit experiment maakt gebruik van een eerder beschreven enzym-gebaseerde micro-elektrodenarray voorgecoat met glutamaatoxidase en elektroplated met mPD. De micro-elektrodenarrays hebben een stijve schacht van 40 millimeter, aangepast voor gebruik bij biggen.
Bevestig de metalen arm aan de micro-manipulator en plaats vervolgens de micro-elektrodenarray zo verticaal mogelijk boven bregma. Laat de array vervolgens voorzichtig zo laag mogelijk zakken zonder het oppervlak van de schedel aan te raken, en noteer de coördinaten van bregma. Gebruik nu een big-hersenatlas om de exacte stereotactische coördinaten van de structuur van interesse te bepalen en plaats vervolgens de micro-elektrode dienovereenkomstig.
Plaats vervolgens de pseudo-referentie-elektrode onder de hoofdhuid en zorg voor contact met het dier. Laat nu langzaam de micro-elektrodenarray in de hersenen zakken tot bijna de juiste diepte. Voor de laatste twee millimeter van het reizen, gebruik een hydraulische micro-aandrijving om de array voorzichtig in de structuur van interesse te laten zakken met minimale weefselschade.
Nadat de micro-elektrodenarray is gepositioneerd, wacht u 30 minuten om de elektrodes toe te laten komen tot de basislijn. Neem vervolgens ongeveer drie uur metingen. Als het big het experiment moet overleven, sluit u de incisie na het verzamelen van gegevens.
Real-time in vivo glutamaatmetingen werden genomen in de hippocampi van drie- tot vierdaagse biggen onder sevofluraan-anesthesie, zoals beschreven. De opname sessies duurden meer dan drie uur. Amperometrie-metingen werden opgenomen bij 4 hertz en omgezet in concentratie met behulp van een lineaire regressie op basis van kalibratieparameters.
Voor elk tijdstip werden de signalen van de twee glutamaatgevoelige sites gemiddeld voordat de gemiddelde sentinel-signaal werd afgetrokken, om een gecorrigeerd glutamaat-signaal op te leveren. De gemiddelde basale glutamaatconcentratie was ongeveer 4,6 micromol en bleef relatief stabiel tijdens de anesthesie-blootstelling. Transiente glutamaterge activiteit werd geïdentificeerd door pieken in het signaal te analyseren die niet gecorreleerd waren met het sentinel-signaal en een signaal-ruisverhouding groter dan drie hadden.
In totaal werden 116 transiente pieken gedetecteerd tijdens de experimentele periode. De amplitude van de resulterende transiente pieken
Overzicht
Deze studie onderzoekt de toepassing van enzym-gebaseerde microelektrode array (MEA) technologie om in vivo neurotransmitteractiviteit bij neonatale biggen te monitoren, met name met focus op glutamaat-dysregulatie als een bijdragende factor tot anesthesie-geïnduceerde neurotoxiciteit. Het doel is om het mechanisme achter anesthesie-geïnduceerde neurotoxiciteit te verduidelijken met behulp van een klinisch relevant diermodel.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Elektrofysiologie
- Anesthesiologie
Achtergrond
- Onderzoeken de rol van glutamaatactiviteit in anesthesie-geïnduceerde neurotoxiciteit.
- Gebruik van biggen als model vanwege hun ontwikkelingsrelevantie.
- Beschaving voor verbeterde technieken voor het meten van neurotransmitterdynamiek in vivo.
Doel van het onderzoek
- Een methode ontwikkelen voor het monitoren van glutamaatniveaus tijdens anesthesie.
- Inzichten verschaffen in de mechanismen van neurotoxiciteit in de context van anesthesie.
- Bevorderen van het begrip van neurotransmitterdynamiek in gerelateerde pathologieën.
Gebruikte methoden
- Gebruik van enzym-gebaseerde microelektrode arrays voor real-time monitoring.
- Gebruik van neonatale biggen van drie tot vijf dagen oud onder sevofluraanenesthesie.
- Kritische chirurgische stappen omvatten craniotomie en microelektrode-implantatie.
- Metingen gedurende drie uur na de operatie.
Belangrijkste resultaten
- De gemeten basale glutamaatconcentratie was ongeveer 4,6 micromolen.
- 116 tijdelijke glutamaatpieken geïdentificeerd tijdens de experimenten.
- Tijdelijke pieken hadden een amplitude over het algemeen binnen het bereik van 1 micromolen.
Conclusies
- De studie toont de bruikbaarheid van MEA-technologie voor in vivo neurotransmittermeting.
- De bevindingen verhogen het begrip van anesthesie-geïnduceerde neurotoxiciteit.
- Implicaties voor onderzoek naar andere aandoeningen zoals pediatrisch hersentrauma en epilepsie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables real-time monitoring of glutamate dynamics in a clinically relevant neonatal piglet model, offering a mechanistic approach to de-risk anesthetic neurotoxicity hypotheses. By providing quantitative, high-resolution neurotransmitter data, it supports target validation and predictive confidence in early discovery programs. The method addresses a critical gap in understanding developmental neurotoxicity mechanisms relevant to pediatric drug safety assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of glutamate dysregulation as a mechanistic hypothesis in anesthesia-induced neurotoxicity.
- Operational Value: Provides real-time, spatially resolved neurotransmitter measurements to functionally validate target engagement.
- Predictive Value: Supports biomarker-like readouts for pathway modulation and mechanistic de-risking in CNS-active compound screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative glutamate concentration data with 4 Hz temporal resolution for assay standardization.
- Operational Value: Establishes a reproducible platform for monitoring neurotransmitter flux in intact brain tissue.
- Scalability: Enables longitudinal monitoring over extended anesthetic exposures to capture transient signaling events.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Uses neonatal piglets as a disease-relevant system with developmental similarity to the human brain.
- Mechanistic Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo pathophysiology through direct neurotransmitter monitoring.
- Risk Mitigation: Identifies transient glutamatergic peaks as potential biomarkers for neurotoxic insult severity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation by delivering functional neurotransmitter readouts that inform lead optimization and safety profiling.
- Discovery Biology: Tests mechanistic hypotheses about anesthetic-induced glutamate dysregulation through direct in vivo measurement.
- Screening: Delivers assay-ready neurotransmitter data with defined signal-to-noise thresholds for peak detection.
- Analytics: Provides concentration-time profiles and transient peak quantification (amplitude, duration) for comparative condition analysis.
- Translational Research: Supports continuity to preclinical models by validating glutamate dynamics in a developmentally relevant species.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other neuropathologies such as epilepsy, stroke, and trauma via analyte-specific enzyme coating.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in neurotoxicity pathways through direct neurotransmitter monitoring.
- Operational Value: Standardizes neurotransmitter measurement with exceptional spatial and temporal resolution.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by quantifying target pathway modulation in vivo.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS compounds based on neurochemical safety signals.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neonatal piglet care, stereotaxic surgery, and microelectrode handling.
- Dependent on specialized instrumentation including hydraulic micro-drives and enzyme-based microelectrode arrays.
- Necessitates aseptic surgical technique and physiological monitoring for animal welfare and data integrity.
- Adaptation to other brain regions or analytes requires atlas-guided repositioning and enzyme-specific electrode calibration.
- Limited by the technical skill barrier in microelectrode implantation and signal stabilization periods.
