Optimaliseren van het gebruik van een Liquid Handling Robot uit te voeren van een hoge doorvoersnelheid vooruit chemische genetica scherm van Arabidopsis thaliana
30 april 2018
Een scherm met hoge doorvoersnelheid van synthetische kleine moleculen vond plaats op de model plantensoorten, Arabidopsis thaliana. Dit protocol, ontwikkeld voor een liquid handling robot, verhoogt de snelheid van voorwaartse chemische genetica schermen, versnellen van de ontdekking van nieuwe kleine moleculen beïnvloeden de plantenfysiologie.
Het algemene doel van dit protocol is om een hoogdoorvoerige voorwaartse chemische geneticascreen uit te voeren op Arabidopsis-zaailingen. Met deze methode kunnen we efficiënt en effectief nieuwe kleine moleculen ontdekken die de plantenfysiologie beïnvloeden. Deze ontdekkingen zullen de basis vormen voor verdere studies naar fysiologische processen, zoals celwandsynthese.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat tienduizenden kleine moleculen in een korte periode kunnen worden gescreend. Hoewel dit protocol is ontworpen voor de modelplantensoort Arabidopsis, kan het gemakkelijk worden aangepast aan andere organismen, zoals insecten, micro-organismen of celcultuur. We hadden het idee voor dit protocol toen we hoorden dat het genomisch centrum van de universiteit een thuis moest vinden voor een overtollige robot voor vloeistofverwerking.
We meldden ons meteen aan om het van hun handen af te nemen. Bereid de verdunningsbibliotheek en de Multichannel Tip Wash Automated Labware Positioner of ALP voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Laad handmatig de Stacker 10s die aan de stackercarrousel zijn bevestigd.
In hotels A tot en met D, laad eerst een doos met AP96 P20 pipette tips in Kamer Een. Laad vervolgens vier 96-well V-bottom platen in Kameren Twee tot en met Vijf met twee bovenste platen met stamconcentraties uit de bestelde bibliotheek en de andere twee onderste platen leeg. Laad bovendien een doos met AP96 P20 pipette tips in Kamer Zes.
Laad vier 96-well V-bottom platen in Kameren Zeven tot en met Negen met de twee bovenste platen met stamconcentraties van de bestelde bibliotheek en de twee onderste platen leeg. Zet het dek op met 300 milliliter water in het reservoir op P3, een 300-milliliter 70%ethanolbad op P7, de Tip Loader ALP en de Multichannel Tip Wash ALP. Gebruik de besturingssoftware van de robot voor vloeistofverwerking om AP96 P20 pipette tips van de Stacker 10 te presenteren en deze naar de Tip Loader ALP te verplaatsen.
Presenteer Kamer Twee uit Hotel A en scheid alle vier 96-well V-bottom platen op het dek, waarbij de onderste twee op P4 en P8 en de bovenste twee op P5 en P9 worden geplaatst. Laad AP96 P20 pipette tips met de Tip Loader ALP op de 96-kanaals 200-microliterkop. Zuig 90 microliter op uit het 300-milliliter waterreservoir en giet het in de 96-well V-bottom verdunningsplaat op P4. Herhaal de stap voor de plaat op P8. Meng de chemische bibliotheekplaat op P5 door driemaal 15 microliter opnieuw aan te zuigen en uit te geven. Zuig bovendien 10 microliter op uit de chemische bibliotheekplaat op P5 en giet 10 microliter in de verdunningsplaat op P4. Meng de oplossingen van de plaat op P4 door driemaal 50 microliter opnieuw aan te zuigen en uit te geven.
Na het mengen, reinig de AP96 P20 pipette tips door 70 microliter 70%ethanol op te zuigen en uit te geven van P7, en was ze vervolgens in de Multichannel Tip Wash ALP door driemaal 110%volume water op te zuigen en uit te geven. Herhaal deze stappen voor het tweede paar platen op P8 en P9.Na het maken van de tweede 96-well V-bottom verdunningsplaat, stapelt u de P9, P5, P8 en P4 platen in die volgorde van onder naar boven. Plaats vervolgens de stapel op een lege statische ALP.
Gebruik P1, P2, P6, P10, P11, P12 of P13. Herhaal deze stappen tot Kamer Vijf in Hotel A leeg is, en start het proces opnieuw wanneer u Kamer Zes bereikt, waarbij u nieuwe AP96 P20 pipette tips naar de Tip Loader ALP verplaatst en de gebruikte AP96 P20 pipette tips op een lege statische ALP plaatst. Herhaal de procedure tot Kamer 9 van Hotel A leeg is.
Om door te gaan naar Hotel B, moeten de platen en tips op het dek worden herladen in Hotel A. Hoewel de robot onbeheerd kan werken, is het noodzakelijk om het waterreservoir na elke verdunningscyclus bij te vullen. Als de cyclus opnieuw start met onvoldoende water, zal de robot lucht aanzuigen en zullen de chemicaliën niet worden verdund. Vul handmatig het 300-milliliter waterreservoir bij.
Het computerprogramma kan een pauze bevatten die dit bericht beschrijft, waardoor de gebruiker op Doorgaan moet drukken voordat de volgende stap wordt uitgevoerd. Herhaal de verdunningsstappen voor de resterende drie hotels. Voeg handmatig zaden toe aan het medium met een dichtheid van 0,1 gram per 100 milliliter.
Deze dichtheid resulteert in een gemiddelde van 3-10 zaden per putje van een 96-well plaat. Plaats handmatig vier 96-well vlakbodemplaten in Kameren Een en Twee van Hotel A. Plaats een doos met AP96 P250 pipette tips op de Tip Loader ALP, een 300-milliliter reservoir gevuld met het medium-zaadmengsel op P3 en een 300-milliliter reservoir gevuld met 70%ethanol op P7. Gebruik de besturingssoftware om Kameren Een en Twee in Hotel A te presenteren en de stapels van vier platen te scheiden. Plaats één plaat op elk van de lege statische ALP's en laad vervolgens AP96 P250 pipette tips op de 96-kanaals 200-microliterkop.
Zuig 90 microliter op uit het 300-milliliter medium-zaadreservoir op P3 en giet het in de eerste 96-well vlakbodemplaat. Herhaal dit proces totdat alle acht platen het medium-zaadmengsel bevatten. Reinig de AP96 P250 pipette tips door 70 microliter op te zuigen en uit te geven uit het 300-milliliter reservoir gevuld met 70%ethanol op P7. Was de tips in de Multichannel Tip Wash ALP door driemaal 110%volume water op te zuigen en uit te geven, en ontlaad vervolgens de tips op TL1.
Verzamel tenslotte de platen met de hand. Laad handmatig een doos met AP96 P250 pipette tips in Kamer Een van Hotel A. Laad ook twee 96-well V-bottom verdunningsbibliotheekplaten in Kameren Twee, Vier, Zes en Acht. Laad twee 96-well vlakbodemscreeningplaten in Kameren Drie, Vijf, Zeven en Negen.
Configureer met behulp van de besturingssoftware het dek om een
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een high-throughput forward chemical genetics screen ontworpen voor Arabidopsis-zaailingen. Het maakt de snelle ontdekking van nieuwe kleine moleculen mogelijk die de plantenfysiologie beïnvloeden.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Plantenfysiologie
- Chemische Genetica
- High Throughput Screening
Achtergrond
- Arabidopsis thaliana is een modelorganisme in plantonderzoek.
- High-throughput screening versnelt de identificatie van biologisch actieve verbindingen.
- Dit protocol maakt gebruik van een vloeistofhandelingsrobot voor een hogere efficiëntie.
- Ontdekkingen kunnen leiden tot inzichten in fysiologische processen zoals de synthese van de celwand.
Doel van de studie
- Het uitvoeren van een high-throughput screening naar kleine moleculen die de plantfysiologie beïnvloeden.
- Het leggen van een basis voor verdere fysiologische studies.
- Het aanpassen van het protocol voor gebruik in andere organismen.
Gebruikte methoden
- High-throughputscreening van synthetische kleine moleculen.
- Gebruik van een vloeistofhandelingsrobot voor automatisering.
- Screening van tienduizenden verbindingen binnen een kort tijdsbestek.
- Toepassing van de bevindingen op diverse biologische systemen.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van nieuwe kleine moleculen die invloed hebben op de plantenfysiologie.
- Aantoonde efficiëntie van het protocol bij het screenen van grote verbindingenbibliotheken.
- Potentieel voor aanpassing aan andere biologische contexten.
- Basis gelegd voor toekomstig onderzoek naar specifieke fysiologische processen.
Conclusies
- Het protocol versnelt de ontdekking van biologisch actieve verbindingen aanzienlijk.
- Het biedt een veelzijdige aanpak die toepasbaar is op diverse organismen.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op de bevindingen om de plantenfysiologie verder te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
High-throughput forward chemische genetische screening maakt een snelle exploratie van de fenotypische ruimte in modelorganismen mogelijk, wat vroege targetvalidatie en mechanistische risicoreductie in discovery-pipelines ondersteunt. Het automatiseren van de toediening van verbindingen via liquid handling-robotica verhoogt de doorvoersnelheid, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid, terwijl handmatige fouten worden verminderd, waarmee direct wordt ingespeeld op de uitdaging van de lage hit-rate bij screening van synthetische bibliotheken. Deze aanpak versnelt de identificatie van lead-verbindingen door kwantitatieve, reproduceerbare fenotypische readouts te genereren die go/no-go-beslissingen en portfoliotriage in preklinisch onderzoek informeren.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt systematische analyse van biologische pathways mogelijk via fenotype-gestuurde ontdekking van kleine moleculen, ter ondersteuning van het testen van doelhypotheses en functionele validatie.
- Operationele waarde: Verlaagt het aantal fout-negatieven door grote compound-bibliotheken efficiënt te screenen, waardoor het vertrouwen in target engagement en het werkingsmechanisme toeneemt.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, dosis-responsieve fenotypische gegevens die geschikt zijn voor assay-standaardisatie en hit-bevestiging in secundaire screens.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbare verdunning en overdracht van verbindingen over 96-well formats, waardoor variabiliteit tussen wells wordt geminimaliseerd en de betrouwbaarheid van de gegevens wordt vergroot.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een ziekterelevant systeem voor het evalueren van de effecten van verbindingen op geconserveerde fysiologische processen, wat de afstemming van translationele biomarkers ondersteunt.
- Operationele waarde: Faciliteert een naadloze overgang van primaire screening naar mechanistische follow-up assays door gestandaardiseerde plaatformaten en opslagcompatibele outputs.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in vroege discovery-workflows door high-content fenotypische screening mogelijk te maken, wat leididentificatie en beslissingen over preklinische voortgang ondersteunt via reproduceerbare, schaalbare evaluatie van verbindingen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesevrije screening om nieuwe bioactieve verbindingen te ontdekken die de plantenfysiologie beïnvloeden, wat een basis biedt voor het ontrafelen van signaalpaden en het verminderen van risico's bij target-identificatie.
- Screening: Levert assay-klare platen met consistente verbindingconcentraties en zaailingdichtheden, wat een betrouwbare evaluatie van verbindingen over grote bibliotheken mogelijk maakt.
- Analytics: Produceert kwantificeerbare fenotypische outputs (bijv. wortellengte, kleurering, kiemingspercentages) die statistische analyse en de prioritering van hits ondersteunen.
- Translationeel onderzoek: Creëert continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie door fenotypische hits te koppelen aan fysiologische processen zoals de synthese van de celwand.
- Enterprise-hergebruik: Configureerbaar voor meerdere organismesystemen, waardoor de workflow voor vloeistofbehandeling kan dienen als een herbruikbaar platform voor diverse ontdekkingscampagnes.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit te verminderen via grootschalige fenotypische screening.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid via geautomatiseerde vloeistofbehandeling, waardoor technicusafhankelijke variabiliteit wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door snelle screening van tienduizenden verbindingen mogelijk te maken, wat de time-to-hit en uitval in de vroege fasen vermindert.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door hoogvolume, reproduceerbare fenotypische data te genereren voor geïnformeerde beslissingen over verdere ontwikkeling.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in het programmeren van robots voor vloeistofbehandeling, plaatstapeling en tipbeheer om een juiste verdunning en nauwkeurigheid bij overdracht te waarborgen.
- Is afhankelijk van toegang tot een bench-top multichannel robot voor vloeistofbehandeling met compatibele software en geautomatiseerde laboratoriummateriaal-positioners (ALPs) voor het wassen en laden van tips.
- Vereist standaardisatie tussen teams wat betreft zaadvoorbereiding, mediaformulering en incubatiecondities om de consistentie van de assay over verschillende runs te behouden.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het overdragen van het protocol naar niet-Arabidopsis-systemen, inclusief zaaddichtheid, mediasamenstelling en optimalisatie van de fenotypische readout.
- Bevat praktische beperkingen, zoals de noodzaak voor handmatige bijvulling van reservoirs tijdens verdunningscycli en visuele bevestiging van het fenotype onder de microscoop, wat volledige automatisering kan beperken.
