Name: Optimaliseren van het gebruik van een Liquid Handling Robot uit te voeren van een hoge doorvoersnelheid vooruit chemische genetica scherm van Arabidopsis thaliana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Leer een high-throughput forward chemical genetics screen uit te voeren voor plantenfysiologie met behulp van een liquid handling robot en Arabidopsis thaliana. Deze methode versnelt de ontdekking van nieuwe kleine moleculen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Jozsef Stork, Mitchel Richmond, Jarrad Gollihue en Andrea Sanchez voor constructieve en kritische discussie. Dr. Sharyn Perry voor de fenotypische foto's. Dit materiaal is gebaseerd op werk gesteund door de National Science Foundation onder coöperatie overeenkomst nr. 1355438.

1. het creëren van een verdunning bibliotheek
<ol><li>Label 625 verdunning bibliotheek platen met de hand, ervoor te zorgen dat ze overeenkomen met hun bijbehorende plaat uit de chemische bibliotheek. Bovendien verbinden in de stroom- en stroom slangen aan de Multichannel Tip Wash geautomatiseerd Labware Positioner (ALP) door hen door het Console-station op de 5 Gallon Reservoir (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Toegang tot de computer en de waspomp via de verbinding van de apparaatbesturing aan de Multichannel Tip Wash ALP inschakelen om het water circuleren. Dit zal automatisch uitgeschakeld aan het einde van het protocol.</li>
	<li>Laden, met de hand, de Stacker 10 gekoppeld aan de Stacker carrousel, in de volgende volgorde in de Hotels A - D (Figuur 4, Stacker); een vak van AP96 P20 Pipetteer Tips in kamer 1, vier 96-Wells-V-bodem platen in kamers 2-5 met de twee bovenste platen met voorraad concentraties uit de bestelde bibliotheek en de twee lagere platen leeg (Figuur 5, Stacker). Daarnaast laadt één vak van AP96 P20 Pipetteer Tips in kamer 6 en vier 96-Wells-V-bodem platen in kamers 7-9 met de twee bovenste platen met voorraad concentraties van de bestelde bibliotheek en de twee lagere platen leeg (Figuur 5, Stacker).</li>
	<li>Instellen up, met de hand, het dek met een waterreservoir van 300 mL op P3, een 300 mL 70% EtOH bad op P7, Tip Loader ALP (TL1) en Multichannel Tip Wash ALP (TW1) (Figuur 4, dek en Figuur 5, dek).</li>
	<li>Met behulp van de besturingssysteemsoftware, presenteren AP96 P20 Pipetteer Tips uit de Stacker 10 en verplaats ze naar de ALP Loader Tip. Opmerking: 1.5 via 1.12 alle klaar bent met de vloeistof behandeling van robot operationele software; Zie Tabel van materialen.</li>
	<li>Kamer 2 van Hotel A presenteren en scheiden van alle vier 96-Wells-V-bodem platen op het dek, plaatsen onder twee op P4 en P8 en de bovenste twee op P5 en P9 (Figuur 4).</li>
	<li>Laden AP96 P20 Pipetteer Tips met de Tip Loader ALP aan de 96-kanaal 200 µL hoofd. Gecombineerd 90 µL van het waterreservoir van 300 mL en afzien in de 96-Wells-V-verdunning bodemplaat op P4. Herhaal deze stap voor de plaat op P8.</li>
	<li>Meng de chemische bibliotheek plaat op P5 door herhaaldelijk zuigen en verstrekking van 15 µL driemaal. Daarnaast gecombineerd 10 µL van de chemische bibliotheek plaat op P5 en 10 µL afzien in de verdunning plaat op P4.</li>
	<li>Meng de oplossingen van de plaat op P4 door herhaaldelijk zuigen en verstrekking van 50 µL totaal drie keer. Eenmaal gemengd, schoon de uiteinden van de Pipet van het P20 AP96 door zuigen en verstrekking van 70 µL van 70% EtOH vanaf P7, hen daarna te wassen in de Multichannel Tip Wash ALP door zuigen en verstrekking van een 110% volume water vier keer.</li>
	<li>Herhaal stap 1.8-1.9 voor het tweede paar platen op P8 en P9. Bij het maken van de tweede 96-Wells-V-verdunning bodemplaat, stapel de platen in de volgende volgorde van beneden naar boven: P9, P5, P8 en P4. Dan de stack te plaatsen op een lege statische ALP; P1, P2, P6, P10, P11, P12 of P13.</li>
	<li>Herhaal de stappen 1.6-1.10 om kamer 5 in Hotel A leeg is. Herhaal stap 1.5 op kamer 6 te bereiken, nieuwe AP96 P20 Pipetteer Tips verhuizen naar de ALP Loader Tip en plaatsen van de gebruikte AP96 P20 Pipetteer Tips op een lege statische ALP.</li>
	<li>Herhaal de stappen 1.6-1.10 om kamer 9 van Hotel A leeg is. Echter, om door te gaan naar Hotel B, de platen en tips op het dek moeten worden herladen in Hotel A.</li>
	<li>Opnieuw vullen, met de hand, het waterreservoir van 300 mL. Deze stap is cruciaal, en het computerprogramma kan nemen een pauze waarin dit bericht, vereisen dat de gebruiker te raken 'verder', voordat u de volgende stap uitvoert.</li>
	<li>Herhaal stap 1.5-1.13 voor de resterende hotels, zorgen voor een volledige 300 mL waterreservoir telkens voordat u verdergaat naar het volgende hotel.</li>
</ol>2. het toevoegen van Media-zaad mengsel aan Screening van platen
<ol><li>½ Murashige en Skoog (MS) Media maken met 0,1% Agar door toevoeging van 4.3 g MS Salts, 0,50 g MES, 1,0 g Agar à 1 L DI H2O. Breng de pH op 5,7 hoewel de toevoeging van 5 M kaliumhydroxide terwijl controle met een pH-sonde.</li>
	<li>Steriliseren zaden door schudden ze in 1% bleekwater en SDS tussen 15 en 30 min en spoel na 4 keer met een gelijke hoeveelheid water door middel van centrifugeren. Nadat de zaden zijn steriel, plaats ze bij 4 ° C vanaf 24 uur tot 7 dagen voor de vernilization. Arabidopsis biologische resources extra worden methoden beschreven voor sterilisatie, vernilization en groei22.</li>
	<li>Zaden op toevoegen aan media met de hand een dichtheid van 0.1 g/100 mL. Deze dichtheid leidt tot een gemiddelde van 3-10 zaden per putje van een 96-wells-plaat.</li>
	<li>Plaats, met de hand, vier Flat van de 96-wells-platen van de bodem in kamers 1 en 2 van Hotel A (Figuur 6, Hotel A). Plaatsen van een doos van AP96 P250 Pipetteer Tips op de ALP Loader Tip, een 300 mL reservoir gevuld met het media-zaad mengsel gemaakt in stap 2.1-2.3 op P3 en een 300 mL reservoir gevuld met 70% EtOH op P7 (Figuur 4, dek en Figuur 6 Dek). Opmerking: 2.5 via 2.8 klaar bent met de besturingssysteemsoftware.</li>
	<li>Kamers 1 en 2 in Hotel A presenteren en scheiden de stapels van vier platen. Plaats een plaat op elk van de lege statische Alpen (P4, P5, P6, P8, P9, P10, P11 en P12). Laden AP96 P250 Pipetteer Tips op het 96-kanaal 200 µL hoofd.</li>
	<li>Gecombineerd 90 µL van het reservoir van de media-zaad 300 mL op P3 en afzien in de eerste Flat van de 96-Wells-bodemplaat. Herhaal dit proces totdat alle acht platen bestaan uit de media-seed-mix.</li>
	<li>Reinig de AP96 P250 Pipetteer Tips door zuigen en verstrekking van 70 µL van het reservoir van de 300 mL gevuld met 70% EtOH op P7. De tips in de Multichannel Tip wassen ALP door zuigen en verstrekking van een 110% volume water viermaal wassen, lossen de tips op TL1 en verzamelen de platen met de hand.</li>
</ol>3. het toevoegen van kleine moleculen aan Screening van platen
<ol><li>Laden, met de hand, een doos van AP96 P250 Pipetteer Tips in kamer 1 van Hotel A, twee 96-Wells-V-bodem verdunning bibliotheek platen in kamers 2, 4, 6 en 8, en twee 96 goed Flat-Bottom Screening platen in kamers van 3, 5, 7 en 9 (Figuur 4 STAPELAARS en Figuur 7, Hotel A). Bovendien sluit slangen en naar de Multichannel Tip Wash ALP op de 5 Gallon Reservoir. Opmerking: 3.2 via 3.10 klaar bent met de besturingssysteemsoftware.</li>
	<li>Configureren van het dek om te bevatten een 300 mL 70% EtOH wassen reservoir op P7; het reservoir van de media-zaad kan worden verlaten op het dek bij P3 (Figuur 4, dek en Figuur 7, dek). Daarnaast zet de Console rit door de aansluiting van de apparaatbesturing circuleren van water via de Multichannel Tip Wash ALP. Dit zal automatisch uitgeschakeld aan het einde van het protocol.</li>
	<li>Het AP96 P250 Pipetteer Tip vak van Hotel A presenteren en verplaats het naar de ALP Loader Tip.</li>
	<li>Presenteren van de 96-Wells-V-bodem verdunning bibliotheek platen van kamer 2 van Hotel A op het dek en een op statische ALP P4 en één op P8. Presenteren van de 96-Wells-Flat-onderkant Screening platen van kamer 3 van Hotel A aan het dek en plaats één op statische ALP P5 en één op P9.</li>
	<li>Laden AP96 P250 Pipetteer Tips met de Tip Loader ALP aan de 96-kanaal 200 µL hoofd.</li>
	<li>Meng de 96-Wells-V-verdunning bodemplaat op P4 door zuigen en verstrekking van 50 µL driemaal. Na dat gecombineerd 10 µL van deze plaat en afzien in het appartement van 96-Wells-Screening bodemplaat op P5.</li>
	<li>Vermeng de oplossingen in de plaat duikt met P5 door zuigen en verstrekking van 50 µL driemaal. Reinig de AP96 P250 Pipetteer Tips met ethanol door zuigen en verstrekking van 70 µL van 70% EtOH uit het reservoir op P7 en daarna wassen met de tips in de Multichannel Tip Wash ALP door zuigen en verstrekking van een 110% volume van water vier keer.</li>
	<li>Herhaal stap 3.5 en 3.6 voor het tweede 96-Wells-V-verdunning bibliotheek bodemplaat (P8) en 96-Wells Flat-Screening bodemplaat (P9).</li>
	<li>Stapel de twee 96-Wells V-bodem verdunning bibliotheek platen samen en de twee 96-Wells vlakke onderkant Screening platen samen. Verplaats de platen naar statische Alpen P1, P2, P6, P10, P11, P12 of P13.</li>
	<li>Herhaal stap 3.4-3.9 driemaal, een totaal van acht keer verdunde chemicaliën toe te voegen aan screening platen. Tot slot, het aantal zaden in elk putje van de platen van de screening via visuele conformatie controleren en aan te vullen die putjes met minder dan drie zaden door extra gesteriliseerd en vernalized zaad.</li>
</ol>4. incubatie en visualisatie van het screenen van platen
<ol><li>Incubeer de 96-wells-platen voor het screenen van Flat-Bottom gedurende vier dagen in een milieu zaal bij 22 ° C op een 16/8 licht/donker cyclus in een uitdroging bewijs container. Visualiseer de 96-Wells Flat-Bottom Screening platen onder een Microscoop ontleden. Het opnemen van alle afwijkende fenotypen voor verder onderzoek.</li>
</ol>

<ol><li>Blackwell, H. E., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genetic+approaches+to+plant+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Chemical genetic approaches to plant biology.</a> Plant Physiol. 133 (2), 448-455 (2003).</li>
<li>Dejonghe, W., Russinova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+chemical+genetics%3A+From+phenotype-based+screens+to+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Plant chemical genetics: From phenotype-based screens to synthetic biology.</a> Plant Physiol. 174 (1), 5-20 (2017).</li>
<li>McCourt, P., Desveaux, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+chemical+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Plant chemical genetics.</a> New Phytol. 185 (1), 15-26 (2010).</li>
<li>Lumba, S., Cutler, S., McCourt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+nuclear+hormone+receptors%3A+A+role+for+small+molecules+in+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Plant nuclear hormone receptors: A role for small molecules in protein-protein interactions.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 445-469 (2010).</li>
<li>Hicks, G. R., Raikhel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+in+plant+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges in plant chemical biology.</a> Nat Chem Biol. 5 (5), 268-272 (2009).</li>
<li>De Rybel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+root+cap+in+root+branching+revealed+by+the+non-auxin+probe+naxillin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A role for the root cap in root branching revealed by the non-auxin probe naxillin.</a> Nat Chem Biol. 8 (9), 798-805 (2012).</li>
<li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).</li>
<li>Serrano, M., Kombrink, E., Meesters, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+designing+chemical+screening+strategies+in+plant+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Considerations for designing chemical screening strategies in plant biology.</a> Front Plant Sci. 6, 131(2015).</li>
<li>Yoshitani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structure-based+strategy+for+discovery+of+small+ligands+binding+to+functionally+unknown+proteins%3A+Combination+of+in+silico+screening+and+surface+plasmon+resonance+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A structure-based strategy for discovery of small ligands binding to functionally unknown proteins: Combination of in silico screening and surface plasmon resonance measurements.</a> Proteomics. 5 (6), 1472-1480 (2005).</li>
<li>Macarron, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+high-throughput+screening+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Impact of high-throughput screening in biomedical research.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).</li>
<li>DeBolt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morlin%2C+an+inhibitor+of+cortical+microtubule+dynamics+and+cellulose+synthase+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Morlin, an inhibitor of cortical microtubule dynamics and cellulose synthase movement.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (14), 5854-5859 (2007).</li>
<li>Christian, M., Hannah, W. B., Luthen, H., Jones, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+auxins+by+a+chemical+genomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Identification of auxins by a chemical genomics approach.</a> J Exp Bot. 59 (10), 2757-2767 (2008).</li>
<li>Drakakaki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clusters+of+bioactive+compounds+target+dynamic+endomembrane+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Clusters of bioactive compounds target dynamic endomembrane networks in vivo.</a> PNAS. 108 (43), 17850-17855 (2011).</li>
<li>Armstrong, J. I., Yuan, S., Dale, J. M., Tanner, V. N., Theologis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+inhibitors+of+auxin+transcriptional+activation+by+means+of+chemical+genetics+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of inhibitors of auxin transcriptional activation by means of chemical genetics in Arabidopsis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14978-14983 (2004).</li>
<li>Brown, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+molecule+with+differential+effects+on+the+PTS1+and+PTS2+peroxisome+matrix+import+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A small molecule with differential effects on the PTS1 and PTS2 peroxisome matrix import pathways.</a> Plant J. 65 (6), 980-990 (2011).</li>
<li>De Rybel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+inhibition+of+a+subset+of+Arabidopsis+thaliana+GSK3-like+kinases+activates+brassinosteroid+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical inhibition of a subset of Arabidopsis thaliana GSK3-like kinases activates brassinosteroid signaling.</a> Chem Biol. 16 (6), 594-604 (2009).</li>
<li>Arkin, M. R., Tang, Y., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+protein-protein+interactions%3A+progressing+toward+the+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing toward the reality.</a> Chem Biol. 21 (9), 1102-1114 (2014).</li>
<li>St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+chemical+genetics+in+yeast+for+discovery+of+chemical+probes+targeting+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism.</a> Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).</li>
<li>Vassilev, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+activation+of+the+p53+pathway+by+small-molecule+antagonists+of+MDM2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2.</a> Science. 303 (5659), 844-848 (2004).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genetic+interrogation+of+natural+variation+uncovers+a+molecule+that+is+glycoactivated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated.</a> Nat Chem Biol. 3 (11), 716-721 (2007).</li>
<li>Walsh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+field+of+chemical+genetics%3A+Potential+applications+for+pesticide+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag+Sci%22%5BJournal%5D)">The emerging field of chemical genetics: Potential applications for pesticide discovery.</a> Pest Manag Sci. 63 (12), 1165-1171 (2007).</li>
<li>Center, A. B. R. Seed Handling. , The Ohio State University. Available from:
 <a target="_blank" href="https://abrc.osu.edu/seed-handling">https://abrc.osu.edu/seed-handling</a> (2013).</li>
<li>Knoth, C., Salus, M. S., Girke, T., Eulgem, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synthetic+elicitor+3%2C5-dichloroanthranilic+acid+induces+NPR1-dependent+and+NPR1-independent+mechanisms+of+disease+resistance+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The synthetic elicitor 3,5-dichloroanthranilic acid induces NPR1-dependent and NPR1-independent mechanisms of disease resistance in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 150 (1), 333-347 (2009).</li>
<li>Conway, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+96-well+Plate+based+iPSC+culture+and+production+using+a+robotic+liquid+handling+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Scalable 96-well Plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system.</a> J Vis Exp. , (2015).</li>
<li>Daniszewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+cell+culture+systems+and+their+applications+to+human+pluripotent+stem+cell+studies%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Technol%22%5BJournal%5D)">Automated cell culture systems and their applications to human pluripotent stem cell studies.</a> SLAS Technol. , (2017).</li>
<li>Popa-Burke, I., Russell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compound+precipitation+in+high-concentration+DMSO+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Compound precipitation in high-concentration DMSO solutions.</a> J Biomol Screen. 19 (9), 1302-1308 (2014).</li>
<li>Partridge, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+high-throughput+system+for+phenotypic+screening+of+chemical+libraries+on+C.+elegans+and+parasitic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">An automated high-throughput system for phenotypic screening of chemical libraries on C. elegans and parasitic nematodes.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2017).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dit protocol is ontworpen om steun van onderzoekers in het volbrengen van een voorwaartse chemische genetica scherm op Arabidopsis. Wij bieden representatieve resultaten van een scherm van 50.000 verbindingen (Figuur 2 en Figuur 3), een van de grootste voorwaartse chemische genetica schermen op Arabidopsis tot op heden9,13,23uitgevoerd. Het gebruik van een liquid handli...

In de afgelopen 20 jaar hebben onderzoekers op het gebied van plantenbiologie grote vooruitgang met behulp van chemische genetica benaderingen, zowel voorwaartse als terugwaartse, geboekt verbetering van ons begrip van de celwand biosynthese, het cytoskelet, een hormoon biosynthese en signalering, Geotropie, pathogenese purine biosynthese en mensenhandel1,2,,3,,4,5endomembrane. Voorwaartse chemische genetica technieken maakt de identificatie van de fenotypen van belang en onderzoekers te begrijpen van de genotypische onderbouwing van bepaalde processen toestaat. Omgekeerde chemische genetica is daarentegen opzoekt van chemische stoffen die interactief met een vooraf bepaald eiwit doelstelling6 werken. Arabidopsis is in de voorhoede van deze ontdekkingen in plantenbiologie omdat haar genoom klein, is toegewezen en van aantekeningen voorzien. Het heeft een korte generatietijd, en er zijn meerdere mutant/verslaggever lijnen beschikbaar om de identificatie van afwijkende subcellular machines7te vergemakkelijken.
Er zijn twee belangrijke knelpunten die vertragen de voortgang van voorwaartse chemische genetische schermen eerste screening proces en het bepalen van het doel van de samengestelde rente8. Een belangrijke hulp bij het vergroten van de snelheid van klein molecuul selectie is het gebruik van automatisering en geautomatiseerde apparatuur9. Liquid handling-robots zijn een uitstekend hulpmiddel voor het afhandelen van grote bibliotheken van kleine moleculen en instrumenteel in het rijden van vooruitgang in de biologische wetenschappen10geweest. Het hier gepresenteerde protocol is ontworpen om te verzachten de bottleneck verbonden aan het screeningsproces, waardoor de identificatie van bioactieve kleine moleculen in een snel tempo. Deze techniek vermindert de belasting van arbeid en tijd namens de exploitant terwijl ook het verminderen van de economische kosten voor de onderzoeker principe.
Tot nu toe de meeste chemische bibliotheken geanalyseerd hebben gehouden tussen 10.000 en 20.000 verbindingen, sommigen met maar liefst 150.000 en sommige met zo weinig als 709,11,12,13,14, 15 , 16. het protocol hierin geïntroduceerd werd uitgevoerd op een klein molecuul bibliotheek van 50.000 verbindingen (Zie Tabel of Materials), een van de grotere voorwaartse chemische genetica schermen uitgevoerd op Arabidopsis tot nu toe. Dit protocol past bij de huidige trend naar meer efficiëntie en snelheid met betrekking tot de voorwaartse chemische genetica, met name als het gaat om herbicide ontdekking, ontdekking van de insecticide, fungicide ontdekken, drug discovery and Kankerbiologie17 ,18,19,20,21. Hoewel ze hier zijn geïmplementeerd met Arabidopsis, kan dit protocol, gemakkelijk worden aangepast aan celculturen, sporen, en mogelijk zelfs insecten in vloeistof binnen 96-, 384 of 1536-Wells-platen. Vanwege zijn kleine omvang is Arabidopsis vatbaar voor screening in 96 goed platen. Echter is het verspreiden van zaden gelijkmatig onder wells een uitdaging. Hand loting klopt maar arbeidsintensief, en hoewel er inrichtingen die zijn ontworpen zijn om het uitdelen van zaden in 96-wells-platen, ze zijn duur om te kopen. Hier, laten we zien hoe deze stap kan worden omzeild met slechts een klein verlies in nauwkeurigheid.
Het algemene doel van deze methode is dat een grote chemische bibliotheek tegen Arabidopsis handelbaarder, zonder afbreuk te doen aan de nauwkeurigheid, via het gebruik van een liquid handling robot screening. Het gebruik van deze methode verbetert de efficiency van de onderzoeker door het verminderen van de tijd genomen om het volledige beheer van de reeks van de eerste verdunning en daaropvolgende fenotypische schermen, waardoor snelle visualisatie van monsters onder een Microscoop ontleden, en snelle identificatie van nieuwe bioactieve kleine moleculen. Figuur 1 toont de belangrijkste resultaten van dit protocol in 4 stappen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57393/57393fig1.jpg"> Figuur 1: totale workflow van het scherm naar voren chemische genetica. Een overzicht van het protocol bij met één of ander detail voor elk van de 4 belangrijkste stappen worden beschreven. 1: ontvangst van de chemische bibliotheek, 2: maken de verdunning bibliotheek, 3: maken de Screening platen, en 4: broeden en visualiseren van de Screening platen. <a href="/files/ftp_upload/57393/57393fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

<table><tbody><tr><td>Keyboard</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Wordt gebruikt voor het ontwerp van protocollen en het bedienen van de Biomek FX</td></tr><tr><td>Muis</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Wordt gebruikt voor het ontwerp van protocollen en het bedienen van de Biomek FX</td></tr><tr><td>Computerscherm</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Wordt gebruikt voor het ontwerp van protocollen en het bedienen van de Biomek FX</td></tr><tr><td>Computer</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Wordt gebruikt voor het ontwerp van protocollen en het bedienen van de Biomek FX</td></tr><tr><td>DIVERSet Diverse Screening Library</td><td>ChemBridge</td><td>N/A</td><td>Chemische bibliotheek</td></tr><tr><td>Biomek Software</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A</td><td>Voert de Biomek FX uit en ontwerpt deze</td></tr><tr><td>Apparaatcontroller</td><td>Beckman Coulter</td><td>719366</td><td>Stuurt de waterpomp/tipwasstation aan</td></tr><tr><td>Stacker Carousel Pendent</td><td>Beckman Coulter</td><td>148240</td><td>Handmatige bediening van de Biomek Stacker Carousel</td></tr><tr><td>Biomek Stacker Carousel</td><td>Beckman Coulter</td><td>148520</td><td>Roterende eenheid die alle FX Stacker 10's herbergt</td></tr><tr><td>FX Stacker 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>Lifteenheid die componenten voor scherm herbergt</td></tr><tr><td>FX Stacker 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>Lifteenheid die componenten voor scherm herbergt</td></tr><tr><td>FX Stacker 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>Lifteenheid die componenten voor scherm herbergt</td></tr><tr><td>FX Stacker 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>Lifteenheid die componenten voor scherm herbergt</td></tr><tr><td>Biomek FX</td><td>Beckman Coulter</td><td>https://www.beckman.com/liquid-handlers</td><td>Robot die de gewenste bewerkingen uitvoert</td></tr><tr><td>Accuframe</td><td>Artisan Technology Group</td><td>76853-4</td><td>Bevestigt de arm om componenten correct te plaatsen</td></tr><tr><td>Framing Fixture</td><td>Beckman Coulter</td><td>719415</td><td>Centreert de arm in de Accuframe</td></tr><tr><td>Multichannel Tip Wash ALP</td><td>Beckman Coulter</td><td>719662</td><td>Wast de tips na het ethanolbad</td></tr><tr><td>Tip Loader ALP</td><td>Beckman Coulter</td><td>719356</td><td>Laadt tips pneumatisch op de arm</td></tr><tr><td>Luchtcompressor</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Verstrekt lucht voor pneumatisch tip laden</td></tr><tr><td>MasterFlex Console Drive</td><td>Cole-Parmer</td><td>77200-65</td><td>Pomp gebruikt om water door de Multichannel Tip Washer te circuleren</td></tr><tr><td>Luchtslang</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Verstrekt lucht van luchtcompressor naar Tip Loader</td></tr><tr><td>Waterslang</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Verstrekt water van 5 Gallon Reservoir naar Tip Washer</td></tr><tr><td>Static ALP's</td><td>Beckman Coulter</td><td>Komt met Biomek FX</td><td>Ondersteunt apparatuur voor het scherm</td></tr><tr><td>5 Gallon Reservoir</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Circuleert het vuile water van het schoonmaken van de tips</td></tr><tr><td>Grippers</td><td>Beckman Coulter</td><td>Komt met Biomek FX</td><td>Grijpt en verplaatst de apparatuur naar de juiste plaatsen</td></tr><tr><td>96-kanaals 200 &micro;L-kop</td><td>Beckman Coulter</td><td>Komt met Biomek FX</td><td>Houdt de 96 tips die binnen het scherm worden gebruikt</td></tr><tr><td>AP96 P200 Pipette Tips</td><td>Beckman Coulter</td><td>717251</td><td>Wordt gebruikt om de screeningsbibliotheek te maken</td></tr><tr><td>96-wells vlakke bodemplaat</td><td>Costar</td><td>9018</td><td>Helpt bij de visualisatie van het scherm</td></tr><tr><td>96-wells V-bodemplaat</td><td>Costar</td><td>3897</td><td>Helpt bij het opslaan van de verdunningsbibliotheek</td></tr><tr><td>AlumaSeal 96 Sealing Film</td><td>MedSci</td><td>F-96-100</td><td>Versluit voor opslag van zowel de chemische bibliotheek als de verdunningsbibliotheek</td></tr><tr><td>Kunststof sandwichzakjes met rits</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Wordt gebruikt om een vochtig milieu voor het scherm te garanderen</td></tr><tr><td>AP96 P20 Pipette Tips</td><td>Beckman Coulter</td><td>717254</td><td>Wordt gebruikt bij het creëren van de verdunningsbibliotheek</td></tr><tr><td>Kweekkamer</td><td>Percival</td><td>AR36L3</td><td>Laat zaden ontkiemen voor fenotypoptische visualisatie</td></tr><tr><td>Spatelketting</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Houdt zaden vast om toe te voegen in putjes waar vloeibare zaaien niet goed genoeg zijn</td></tr><tr><td>Toothpick</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Duwt zaden van de spatelketting naar de putjes</td></tr><tr><td>Murashige and Skoog Basal Salt Mixture</td><td>PhytoTechnology Laboratories</td><td>M524</td><td>Toegevoegd aan MS-mediamengsel</td></tr><tr><td>MES Free Acid Monohydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN19483580</td><td>Toegevoegd aan MS-media om de pH te verlagen</td></tr><tr><td>Agar Powder</td><td>Alfa Aesar</td><td>9002-18-0</td><td>Verhoogt de dikte van het media om zaadophanging te ondersteunen</td></tr><tr><td>5M KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484016</td><td>Verhoogt de pH tot adequate niveaus</td></tr><tr><td>1L Media Storage Bottle</td><td>Corning</td><td>1395-1L</td><td>Bevat genoeg media voor een scherm</td></tr><tr><td>Polypropyleen centrifugebuizen</td><td>Corning</td><td>431470</td><td>Steriseert zaden voorafgaand aan vernilization</td></tr><tr><td>pH-sonde</td><td>Davis Instruments</td><td>YX-58825-26</td><td>Wordt gebruikt voor het maken van media</td></tr><tr><td>ALPs (Automated Labware Positioners) Gebruikershandleiding</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN 987836</td><td>Helpt bij het instellen van de bijbehorende apparatuur voor de Biomek FX</td></tr><tr><td>Biomek 2000 Stacker Carousel Gebruikershandleiding</td><td>Beckman Coulter</td><td>609862-AA</td><td>Helpt bij het instellen van de Stacker Carousel</td></tr><tr><td>Biomek FX en FXP Laboratoriumautomatiseringswerkstations Gebruikershandleiding</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN 987834</td><td>Wordt gebruikt om de Multichannel Pod te omlijsten</td></tr><tr><td>Biomek FXP Laboratoriumautomatiseringswerkstation Klantstartgids</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN B32335AB</td><td>Wordt gebruikt om te helpen bij het instellen van de Biomek FX</td></tr><tr><td>Biomek Software Gebruikershandleiding</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN 987835</td><td>Wordt gebruikt om de software in te stellen en te begrijpen</td></tr></tbody></table>

optimaliseren van het gebruik van een liquid handling robot uit te voeren van een hoge doorvoersnelheid vooruit chemische genetica scherm van arabidopsis thaliana

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

Chemische genetica wordt steeds ingezet om te decoderen van eigenschappen in planten die recalcitrante tot de traditionele genetica als gevolg van gen redundantie of letaliteit worden kunnen. Echter, de waarschijnlijkheid van een synthetische klein molecuul wordt bioactieve is laag; Daarom moeten duizenden moleculen worden getest om te vinden die van belang. Vloeistof behandeling robotics systemen zijn ontworpen om het verwerken van grote aantallen monsters, verhoging van de snelheid waarmee een chemische bibliotheek naast het minimaliseren/standaardiseren fout kan worden vertoond. Om een scherm high-throughput voorwaartse chemische genetica van een bibliotheek van 50.000 kleine molecules op Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protocollen met behulp van een bank-top meerkanaals vloeistof waarvoor minimale handling robot werden ontwikkeld de betrokkenheid van de technicus. Met deze protocollen, werden de 3,271 kleine moleculen ontdekt dat zichtbaar fenotypische veranderingen veroorzaakt. 1,563 verbindingen geïnduceerde korte wortels, 1,148 verbindingen gewijzigd kleuring, 383 verbindingen veroorzaakt root haren en andere, niet-gecategoriseerd, verbouwingen en 177 verbindingen geremd kiemkracht.

De mogelijkheid om nauwkeurig en efficiënt karakteriseren fenotypen gebaseerd op de toevoeging van de kleine moleculen bij screening concentraties onder een Microscoop ontleden is het uiteindelijke doel van deze methode van voorwaartse chemische genetica op Arabidopsis. De fenotypen waargenomen wanneer alle 50.000 verbindingen had onderzocht is divers en kan worden onderverdeeld in meerdere verschillende klassen (Figuur 2). Figuu...

Een scherm met hoge doorvoersnelheid van synthetische kleine moleculen vond plaats op de model plantensoorten, Arabidopsis thaliana. Dit protocol, ontwikkeld voor een liquid handling robot, verhoogt de snelheid van voorwaartse chemische genetica schermen, versnellen van de ontdekking van nieuwe kleine moleculen beïnvloeden de plantenfysiologie.

Optimaliseren van het gebruik van een Liquid Handling Robot uit te voeren van een hoge doorvoersnelheid vooruit chemische genetica scherm van Arabidopsis thaliana

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or ...

Het algemene doel van dit protocol is om een hoogdoorvoerige voorwaartse chemische geneticascreen uit te voeren op Arabidopsis-zaailingen. Met deze methode kunnen we efficiënt en effectief nieuwe kleine moleculen ontdekken die de plantenfysiologie beïnvloeden. Deze ontdekkingen zullen de basis vormen voor verdere studies naar fysiologische processen, zoals celwandsynthese.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat tienduizenden kleine moleculen in een korte periode kunnen worden gescreend. Hoewel dit protocol is ontworpen voor de modelplantensoort Arabidopsis, kan het gemakkelijk worden aangepast aan andere organismen, zoals insecten, micro-organismen of celcultuur. We hadden het idee voor dit protocol toen we hoorden dat het genomisch centrum van de universiteit een thuis moest vinden voor een overtollige robot voor vloeistofverwerking.We meldden ons meteen aan om het van hun handen af te nemen. Bereid de verdunningsbibliotheek en de Multichannel Tip Wash Automated Labware Positioner of ALP voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Laad handmatig de Stacker 10s die aan de stackercarrousel zijn bevestigd.In hotels A tot en met D, laad eerst een doos met AP96 P20 pipette

optimizing-use-liquid-handling-robot-to-conduct-high-throughput

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We brengen verslag uit een methode voor de introductie, tracking en kwantitatieve analyse van de GFP expressie in plantencellen. Deze methode maakt gebruik van een speciaal ontworpen robotica systeem voor semi-continue foto collectie van grote aantallen monsters, in de tijd. We tonen ook aan het gebruik van ImageJ en ImageReady voor de analyse van foto-serie.

Robotica en Dynamic Image Analysis voor Studies van genexpressie in plantenweefsels

Een procedure voor vloeibare-based kweken en verstrekking...

High-throughput screening &#39;en biosensing met fluorescerende C. elegans Stammen

Een protocol voor de kwantitatieve, high throughput screening expressie en analytische zuivering van fusie-eiwitten uit kleinschalige Escherichia coli culturen wordt beschreven en toegepast om de expressie van disulfide-rijke dierlijke gif eiwit targets.

High Throughput Screening Kwantitatieve Expressie en zuivering Toegepast op Recombinant Disulfide-rijke Venom eiwitten die in<em&gt; E. coli</em

Hier beschrijven we een celgebaseerde reportergen-test als waardevol hulpmiddel om chemische bibliotheken te screenen op verbindingen die post-transcriptionele controlemechanismen moduleren die worden uitgeoefend via 3’ UTR.

High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen

Een high-throughput, geautomatiseerde, tabak protoplast productie en transformatie methode is beschreven. Het robotsysteem maakt massively parallel genexpressie en ontdekking in het model BY-2 systeem dat vertaalbaar naar niet-model gewassen zou moeten zijn.

Een Robotic Platform voor High-throughput protoplastisola- en Transformatie

Hier, wordt een geautomatiseerde workflow voor het uitvoeren van modulaire DNA "apparaat" vergadering met behulp van een modulaire klonen DNA vergadering methode op vloeistof aangestuurde robots gepresenteerd. Het protocol maakt gebruik van een intuïtieve softwaretool voor het genereren van vloeibare handler selectielijsten voor combinatorische DNA apparaat bibliotheek generatie, waaruit we met behulp van twee vloeibare behandeling platforms.

Geautomatiseerde robot Liquid Handling samenstel van modulaire DNA voorzieningen

Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor het snel produceren van honderden nematode groei media agar, 96-Wells cultuur platen met een consistent aantal Caenorhhabditis elegans per putje. Deze culturen zijn nuttig voor de fenotypische screening van hele organismen. Hier richten we ons op met behulp van deze culturen op scherm chemicaliën voor Pro-levensduur effecten.

Een eenvoudige methode voor High Throughput chemische Screening in Caenorhabditis Elegans

Een high-throughput protocol voor de oppervlaktesterilisatie van Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) zaden wordt geleverd, waarbij de vloeistofbehandelingsstappen worden geoptimaliseerd met een eenvoudig zuigapparaat dat is gebouwd met een vacuümpomp. Honderden zaadmonsters kunnen op één dag aan de oppervlakte worden gesteriliseerd.

High-throughput, robuuste en zeer tijdflexibele methode voor oppervlaktesterilisatie van Arabidopsis-zaden

Dit protocol biedt een methode voor de systematische wereldwijde optimalisatie van genetisch gecodeerde biosensoren door middel van geautomatiseerde generatie en beoordeling van genetische bibliotheken. Dit gaat gepaard met ontwerp-van-experimentmethodologieën om experimenten te stroomlijnen en de selectie van genetische componenten mogelijk te maken om biosensoren af te stemmen op specifieke ontwerpresultaten.

Efficiënte bemonstering van genetisch gecodeerde biosensorontwerpruimte mogelijk gemaakt met een ontwerp- en automatiseringsworkflow

Dit protocol biedt een standaard high-throughput screeningworkflow voor industriële micro-organismen. Het omvat het construeren van een mutantenbibliotheek via ARTP-mutagenese, het uitvoeren van positieve druppelscreening met geautomatiseerde microfluidica en vervolgens het verifiëren van de resultaten. De betrouwbaarheid van de workflow werd gevalideerd door het screenen van krachtige B. coagulans-stammen .

Hoogdoorvoerscreening van L-melkzuur-hyperproducerende bacilluscoagulansmutanten met behulp van een geautomatiseerd druppel-microflufluïdisch platform

Leer een high-throughput forward chemical genetics screen uit te voeren voor plantenfysiologie met behulp van een liquid handling robot en Arabidopsis thaliana. Deze methode versnelt de ontdekking van nieuwe kleine moleculen.

Optimaliseren van het gebruik van een Liquid Handling Robot uit te voeren van een hoge doorvoersnelheid vooruit chemische genetica scherm van Arabidopsis thaliana (Video) | JoVE Journal

Optimaliseren van het gebruik van een Liquid Handling Robot uit te voeren van een hoge doorvoersnelheid vooruit chemische genetica scherm van Arabidopsis thaliana

Meer video's verkennen