Punctie-geïnduceerde Iris Neovascularization als een muismodel van Rubeosis Iridis
8 maart 2018
Iris neovascularization, een gemeenschappelijke complicatie van ischemische retinale ziekte, kan leiden tot zicht-bedreigende neovascular glaucoom. Hier beschrijven we een lymfkliertest protocol voor experimentele iris neovascularization die kan worden gebruikt voor noninvasive evaluatie van angiogenese-modulerende stoffen induceren.
Het algemene doel van deze procedure is het induceren van irisvasculatuur, wat directe in-vivo visualisatie van angiogeneseprocessen mogelijk maakt. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in de oogheelkunde te beantwoorden, met name bij neovasculaire ziekten. Het grote voordeel van deze techniek is dat albinomuizen worden gebruikt om directe in-vivo visualisatie van de bloedvaten mogelijk te maken.
Deze methode kan inzicht geven in oculair neovasculair oedeem. Het kan ook worden toegepast als een algemeen model van angiogenese, zoals het testen van nieuwe angiogenesetherapieën. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de irisdissectie uitdagend is vanwege de kleine omvang van het muizenoog.
Met oefening kan het echter worden beheerst. Nadat een P12.5 muis is verdoofd en voorbereid op de procedure, plaats hem in de laterale buikligging onder een stereoscoop en controleer of de masker goed is gepositioneerd. Het oog moet het gezichtsveld vullen.
Duidelijk scherpstellen van het oog is onmisbaar. Gebruik vervolgens kleine snoertangen in de niet-dominante hand om het oog voorzichtig uit te steken door neerwaartse druk op de oogleden uit te oefenen, dorsaaal en ventraal ten opzichte van het oog. Houd een stevige greep op het ooglid vast om te helpen.
Voordat u doorgaat, documenteert u de vasculaire structuur met een foto bij 40X. Gebruik vervolgens de stereoscoop om de hoornvlieslimbus te lokaliseren. De limbus van albino BALB/c muizen kan gemakkelijk worden geïdentificeerd als het circulaire vasculaire plexus achter het hoornvlies.
Nu, in de dominante hand, houd een 30 gauge afgeschuinde naald vast en gebruik deze om een kleine uveale punctie uit te voeren nabij de achterste limbale grens van de uvea tussen het ciliair lichaam en de ora serrata. Maak de punctie met alleen de punt van de naald en niet meer dan de helft van de afschuining. Voorkom ruptuur van de lens.
De punctie moet zelf sluitend zijn, maar nog steeds toelaten voor intraoculaire injectie van studiesubstanties door de wond. Voer vervolgens een tweede uveale punctie uit aan de andere kant van het oog. Optimaliseer de puncties om op de meest dorsale en meest ventrale posities te zijn.
Herhaal de uveale puncties op dezelfde twee posities elke vier dagen tot P24.5. En controleer voordat u de punctie herhaalt altijd op traumatische cataract. Na het enucleëren van het oog en het fixeren zoals beschreven in het tekstprotocol, verwijder de fixeervloeistof en spoel het oog drie keer met vers PBS.
Plaats vervolgens het oog op een glad, droog oppervlak met de voorste kamer omhoog. Voer vervolgens een afgeschuinde 30 gauge naald in de posterior ten opzichte van de limbus in om een ingangspunt te maken. Bevestig vervolgens het voorste segment met kleine snoertangen en gebruik Clayman-Vannas rechte schaar om rond de limbus te snijden terwijl het oog wordt geroteerd.
Het gebruik van gedeeltelijke sneden kan het proces gemakkelijker maken. Wanneer voltooid, zou het achterste segment van het oog los moeten laten. Positioneer vervolgens het voorste segment naar beneden om de lens bloot te leggen.
Verwijder de lens voorzichtig door hem met kleine pincetten vast te grijpen en omhoog te trekken. Positioneer nu het voorste segment met de hoornvlies naar beneden en met de snede loodrecht op het gezichtsveld. Grijp vervolgens voorzichtig het weefsel achter het ciliair lichaam met kleine snoertangen in de niet-dominante hand.
Gebruik Clayman-Vannas rechte schaar om net voor het ciliair lichaam te knippen met als doel het trabeculair netwerk te verwijderen en de iris te isoleren. De iris zou dan binnen het hoornvlies moeten bewegen. Gebruik vervolgens kleine snoertangen om het hoornvlies vast te grijpen en breng voorzichtig de voorste oogcup naar een 96-wellplaat met 200 microliter PBS.
Houd de greep op het hoornvlies vast en blijf de iris dissecteren door het weefsel met PBS te spoelen. Indien nodig kan een 30 gauge naald worden gebruikt om de iris te helpen verplaatsen. Verwijder nu het hoornvlies met de kleine snoertangen.
De geïsoleerde iris kan tijdelijk in PBS bij vier graden Celsius worden bewaard totdat er experimenten mee worden uitgevoerd. Albino BALB/c muizen op P12.5 werden onderworpen aan uveale puncties die om de vierde dag werden herhaald tot P24.5, zoals beschreven. Vanwege de transparantie van het hoornvlies en de melaninedeficiëntie van BALB/c muizen, is irisvasculatuur gemakkelijk zichtbaar in P16.5 pups en intensiveert gedurende de duur van het protocol.
Op P27.5 werden muizen geëuthanaseerd en hun irissen werden zorgvuldig gedisseceerd. De puncties induceerden een vasculaire respons van de iris door het wondgenezingssysteem te activeren. Immunohistochemie werd uitgevoerd tegen PECAM1.
De resulterende kleuring toonde een toename in de totale vasculaire structuur in irissen van gepuncteerde ogen in vergelijking met controles. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u irisangiogenese kunt induceren en de muisiris met succes kunt isoleren. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals QBCR worden uitgevoerd om aanvullende moleculaire en cellulaire vragen te beantwoorden, zoals het testen van de werkzaamheid van pro-angiogene of anti-angiogene stoffen.
Na de ontwikkeling van deze techniek heeft het de weg geëffend voor onderzoekers om neovasculaire ziekten te onderzoeken door in-vivo, niet-invasieve methoden met kleine knaagdieren als model.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een muizenprotocol voor het induceren van irisneovascularisatie, een aandoening die gekoppeld is aan ischemische retinaziekten en neovasculair glaucoom. De methode maakt een niet-invasieve evaluatie van angiogene-modulerende stoffen mogelijk door middel van directe in-vivo visualisatie van de irisvascularisatie.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Oftalmologie
- Angiogenese
- Neovasculaire aandoeningen
Achtergrond
- Neovascularisatie van de iris kan het gezichtsvermogen bedreigen.
- Inzicht in angiogenese is essentieel voor de ontwikkeling van therapieën.
- Het gebruik van albino muizen vergemakkelijkt de visualisatie van bloedvaten.
- Er zijn uitdagingen bij de dissectie van de iris vanwege de geringe omvang van het muisojo.
Doel van de studie
- Om irisvascularisatie te induceren voor in-vivo studies.
- Om inzicht te verschaffen in oculaire neovasculaire aandoeningen.
- Om nieuwe angiogene therapieën te testen.
Gebruikte methoden
- Inductie van irisneovascularisatie bij albino muizen.
- In-vivo visualisatietechnieken.
- Experimentele evaluatie van angiogenese-modulerende stoffen.
- Demonstratie van technieken voor irisdissectie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle inductie van neovascularisatie van de iris.
- Effectieve visualisatie van angiogene processen.
- Verworven inzichten in de mechanismen van neovasculaire aandoeningen.
- Potentiële toepassingen voor het testen van nieuwe therapieën.
Conclusies
- De methode biedt een waardevol instrument voor het bestuderen van irisneovascularisatie.
- Het vergroot het begrip van oculaire neovasculaire aandoeningen.
- Toekomstig onderzoek kan dit model gebruiken voor therapeutische tests.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Dit model maakt een niet-invasieve, longitudinale beoordeling van angiogene processen in de iris mogelijk, wat vroege target-validatie voor neovasculaire therapieën ondersteunt. Door gebruik te maken van de transparantie van de ogen van albino muizen, biedt het een schaalbaar platform voor het evalueren van angiogene modulatoren in een ziekte-relevante oculaire context. Deze aanpak vermindert de afhankelijkheid van eindpunt-histologie en verhoogt het voorspellend vertrouwen bij preklinische screening op angiogenese.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar angiogene pathways mogelijk via induceerbare iris-neovascularisatie, aangestuurd door inflammatoire systemen en plasminogenactiveringssystemen.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie via reproduceerbare, zelfsluitende uveale puncties die een meetbare vasculaire respons uitlokken.
- Voorspellende waarde: Faciliteert mechanistische risicoreductie door directe in-vivo visualisatie van de modulatie van angiogenese over een bepaalde tijd.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een kwantificeerbare angiogene readout via PECAM1-immunohistochemie en niet-invasieve in-vivo imaging door het transparante hoornvlies.
- Operationele waarde: Maakt gestandaardiseerde, reproduceerbare vasculaire inductie elke vier dagen mogelijk van P12.5 tot P24.5, wat de reproduceerbaarheid van de assay ondersteunt.
- Schaalbaarheidswaarde: Compatibel met flatmount-preparatie van semitransparante BALB/c-irissen voor immunohistochemische analyse met een hoge resolutie en lage achtergrond.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Modelleert de pathogenese van neovasculair glaucoom, een complicatie van diabetische retinopathie die het gezichtsvermogen bedreigt, waardoor de relevantie voor de ziekte wordt vergroot.
- Preklinische continuïteit: Maakt het mogelijk om pro- of anti-angiogene stoffen in vivo te testen, waarmee de brug wordt geslagen tussen ontdekking en therapeutische evaluatie.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Maakt longitudinale monitoring van de vasculaire respons mogelijk, wat go/no-go-beslissingen op basis van angiogene effectiviteit ondersteunt.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De methode past binnen het continuüm voor de ontdekking van angiogenese, van het testen van hypotheses over targets tot de preklinische validatie van de werkzaamheid van modulatoren, in het bijzonder bij programma's voor occulaire neovasculaire aandoeningen.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden door angiogenese te induceren via wondgenezing en inflammatoire triggers in de iris.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve vasculaire resultaten die geschikt zijn voor het screenen van angiogene stoffen in een levend weefselcontext.
- Analytics: Maakt analyse van vatdichtheid en morfologie mogelijk via PECAM1-kleuring en in-vivo imaging, wat een vergelijkende beoordeling van condities faciliteert.
- Translationeel onderzoek: Modelleert mechanismen van menselijk neovasculair glaucoom, ter ondersteuning van preklinische validatie op basis van biomarkers.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor vasculaire inductie dat toepasbaar is op meerdere projecten die gericht zijn op angiogenese.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in het target door het modelleren van mensachtige iris-neovascularisatie, aangestuurd door geconserveerde angiogene pathways.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde timing van de punctie, selectie van de locatie en postoperatieve monitoring bij traumatische cataract.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege, niet-invasieve effectiviteitsmetingen mogelijk te maken, waardoor het risico op falen in een laat stadium wordt verminderd.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van angiogene kandidaten op basis van de in-vivo vasculaire respons van de iris.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in microsurgische technieken, waaronder uveale punctie en iris-isolatie onder stereoscopische begeleiding.
- Afhankelijk van instrumentarium zoals 30-gauge schuine naalden, knoopnijpers en Clayman-Vannas scharen voor nauwkeurige weefselmanipulatie.
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor het tijdstip van punctie (om de 4 dagen van P12.5 tot P24.5) en postoperatieve monitoring om de consistentie van het model te waarborgen.
- Overwegingen bij de aanpassing omvatten variaties in pigmentatie van de muizenstam en corneale transparantie die de kwaliteit van de vasculaire visualisatie beïnvloeden.
- Praktische beperkingen omvatten de technische uitdaging van iris-dissectie vanwege de kleine ooggrootte, waarvoor training nodig is voor een betrouwbare weefselisolatie.
