Een eiwit Microarray Assay voor serologische bepaling van antigeen-specifieke antilichaam reacties volgende Clostridium difficile -infectie
15 juni 2018
Dit artikel bevat een beschrijving van een eenvoudige eiwit microarray methode voor profilering humorale immuunreacties aan een 7-plex panel van sterk gezuiverd Clostridium difficile antigenen in menselijke sera. Het protocol kan worden uitgebreid voor de bepaling van specifieke antilichaam reacties in preparaten van polyklonale intraveneuze immunoglobuline.
Deze methode kan helpen bij het optimaliseren en selecteren van klinisch bruikbare immunotherapieën voor Clostridium difficile-infectie op patiëntspecifieke wijze, en het verduidelijken van menselijke immuunresponsen op Clostridium difficile. Het grote voordeel van deze techniek is dat het nauwkeurige en gelijktijdige kwantificering van multi-isotype en stamspecifieke antilichaamresponsen op C.difficile-antigenen mogelijk maakt. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat er expertise vereist is in het opzetten en optimaliseren van een panel van sterk gezuiverde antigenen, en het opzetten van het technologische platform.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien methodologische lijsttypen die betrokken zijn bij het voorbereiden van de magnetronplaat, arrays afdrukken, een veilige procedure en de gegevensanalyse aandacht voor details vereisen. Het demonstreren van een deel van de procedure zal worden gedaan door Sam Greenwood, een technicus van mijn laboratorium. Om te beginnen, verdun Clostridium difficile-antigenen en afdrukbuffer tot optimale concentratie.
Breng vervolgens 10 microliter antigeenoplossing over naar een 384-wellplaat. Bedek de plaat met een plaatseal en centrifugeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur bij 300 keer zwaartekracht. Gebruik voor microarray-afdrukken een handgasbrander om de siliconen PIN drie keer twee seconden lang te verwarmen.
Spoel vervolgens de siliconen PIN drie keer gedurende drie seconden in schoon water. Plaats de microarrayplaat in de laadcartridge van een arrayer. Eject de lade en plaats vervolgens de aminosilaan slides in de slideslade en druk op de OK-knop om de vacuüm aan te zetten.
Zorg ervoor dat alle slides zijn vastgezet en klik vervolgens op OK. Breng de lade terug naar de oorsprong en sluit het deksel. Start vervolgens het juiste programma en ga naar Bestand, dan Microarraying Parameters, dan Open. Selecteer het Clostridium difficile-bestand om alle antigenen in viervoudige te printen.
Onder dit venster opent u het brontabblad om de monsteropslag aan te geven en het doeltabblad om microarraydetails in te voeren. Open vervolgens het optietabblad om het wasgereedschap te selecteren. Onder het algemene tabblad van Run Preferences, op de TAS-toepassingssuite-werkbalk, selecteert u Wassen aan het begin van de run en Wassen aan het einde van de run.
Open het Klimaattabblad en stel het vochtigheidsniveau in tussen 55 tot 60%Nu start u de run en controleert u periodiek de arrayer om ervoor te zorgen dat deze correct functioneert. Plaats na het afdrukken de afgedrukte slides voorzichtig in een slidehouder met 16 multi-wellkamers. Voeg vervolgens 100 microliter 5%BSAT toe aan elke blok.
Bedek de slides en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur met schudden. Gebruik 120 microliter PBST om elke blok vijf keer een minuut lang met schudden te wassen. Ontdooi vervolgens de serummonsters verkregen van C difficile geïnfecteerde patiënten en gezonde controles op ijs gedurende 20 minuten.
Voeg commercieel verkrijgbaar antilichaamverdunning toe aan de masterblok en voeg vervolgens monsters toe aan de masterblok en meng. Gooi de wasbuffer weg en voeg 100 microliter van elk verdund monster toe aan de experimentele blokken. Voeg voor de negatieve controleblok 100 microliter van alleen het antilichaamverdunner toe.
Incubeer vervolgens de slides gedurende één uur bij kamertemperatuur met zacht schudden. Gebruik vervolgens 120 microliter PBST om elke blok vijf keer drie minuten lang met schudden te wassen. Voeg vervolgens 100 microliter biotinylerend geitenanti-humaan antilichaam verdund in antilichaamverdunner toe aan elke blok.
Bedek de slides en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur met zacht schudden. Gebruik 120 microliter PBST om elke blok vijf keer drie minuten lang met schudden te wassen. Voeg vervolgens 100 microliter streptavidin SY5-conjugaat verdund in 5%BSAT toe, in een verhouding van een tot tweeduizend aan elke blok.
Bedek de slides met folie en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur met zacht schudden. Was de slides eerst met 120 microliter PBST vijf keer een minuut lang en was ze vervolgens nog twee keer een minuut lang met PBS. Om de slides te drogen, draai ze vijf minuten lang bij 300 keer zwaartekracht.
Schakel de laserscanner 30 minuten voor het scannen in, om hem te laten opwarmen. Plaats vervolgens de slide in de scanner met de bedrukte oppervlakte naar boven totdat het platelicht vast groen wordt. Druk vervolgens op de knop Instellingen.
Op het eerste tabblad, zorg ervoor dat de automatische scroll en streepjescode zijn uitgeschakeld. Stel vervolgens de Pixelgrootte in op 10, Scanmodus op Medium, Acquisitie op 635 alleen, Acquisitiemodus op Handmatig, versterking op 20 en vermogen op laag. Zorg erop het tweede tabblad voor dat het diatype ongelabeld is.
Op het derde tabblad, stel de Focusinstelling in op Auto focus. Druk op de knop importeren raster om de juiste arraylijst te selecteren die is gekoppeld aan het gescande beeld. Druk vervolgens op de knop autofind om het raster uit te lijnen met de punten op de slide.
Druk ten slotte op de knop Kwantificeringsproces om de fluorescentie-intensiteit van elke spot te meten. Bewaar vervolgens de resultaten in een geschikt formaat voor verdere analyse. In dit protocol wordt een eiwitmicroarray vergeleken met ELISA om de reproduceerbaarheid tussen deze twee technieken te beoordelen.
De Spearman-correlatiecoëfficiëntanalyse toont significante overeenstemming tussen de microarray en ELISA voor het detecteren van IgG Anti-toxine A en Anti-toxine B-niveaus in serummonsters. Intro-assay en inter-assay reproduceerbaarheid van de eiwitmicroarray worden berekend met behulp van de serummonsters van zeven patiënten. De monsters die op twee verschillende arrayslides zijn geanalyseerd tegen Toxin A, Toxin B, SLP001, SLP002, SLP027, Toxin B van Toxin B alleen producerende stam CCUG en pCDTb-antigenen tonen goede reproduceerbaarheid.
Een eiwitmicroarray wordt uitgevoerd om een isotype-specifiek anti
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een eiwit-microarray-methode voor het profileren van humorale immuunresponsen op Clostridium difficile-antigenen in humaan serum. De techniek maakt de nauwkeurige kwantificering van meerdere isotype- en stamspecifieke antilichaamresponsen mogelijk.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Microbiologie
- Klinisch onderzoek
Achtergrond
- Clostridium difficile is een belangrijke oorzaak van infecties.
- Het begrijpen van immuunresponsen is cruciaal voor de ontwikkeling van immunotherapieën.
- Huidige methoden hebben niet de mogelijkheid om meerdere antilichaamresponsen tegelijkertijd te profileren.
- Deze studie introduceert een microarray-methode om deze lacune te vullen.
Doel van het onderzoek
- Om de selectie van immunotherapie voor Clostridium difficile-infectie te optimaliseren.
- Om menselijke immuunresponsen op C. difficile te verduidelijken.
- Om patiëntspecifieke behandelbenaderingen mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- Bereiding van een 7-plex paneel van gezuiverde C. difficile-antigenen.
- Microarray-bedrukken en instelling.
- Gelijktijdige kwantificering van antilichaamresponsen.
- Gegevensanalyse en interpretatie van resultaten.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt gedetailleerd profileren van immuunresponsen mogelijk.
- Aangetoond nauwkeurigheid bij het kwantificeren van multi isotype antilichamen.
- Maakt de begrip van patiëntspecifieke immuunprofielen mogelijk.
- Visuele demonstraties verbeteren het leren van de techniek.
Conclusies
- Deze methode is een waardevol hulpmiddel voor immunologisch onderzoek.
- Het kan helpen bij de ontwikkeling van gerichte immunotherapieën.
- Toekomstige studies kunnen de toepassingen ervan in klinische omgevingen uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Profiling multi-isotype and strain-specific antibody responses enables mechanistic de-risking of immunotherapies for Clostridium difficile infection. This protein microarray assay supports target validation by quantifying functional antibody profiles across patient cohorts and therapeutic preparations. The method enhances predictive confidence in selecting clinically relevant immunotherapies through simultaneous, high-throughput serological analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring antigen-specific IgG, IgA, and IgM responses across isotypes and subclasses.
- Operational Value: Supports biological de-risking through simultaneous quantification of strain-specific antibodies to toxins A and B, SLPs, and binary toxin precursors.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by correlating microarray results with toxin neutralization efficacy and ELISA data for antitoxin IgG levels.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing a 7-plex panel of purified C. difficile antigens for simultaneous detection.
- Reproducibility: Demonstrates intra- and inter-assay reproducibility using patient serum samples against multiple antigens, enabling reliable compound or immunotherapy evaluation.
- Scalability: Highlights platform reuse potential for profiling antibody responses in vaccinated or infected humans, supporting assay standardization across clinical sample types.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase immune profiling to preclinical validation by detecting significant differences in antibody levels between patient groups, commercial IVIg, and pre/post-therapy sera.
- Biomarker Alignment: Enables identification of serological correlates of protection through multi-isotype, strain-specific antibody profiling linked to functional outcomes.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by revealing correlations between microarray signals and toxin neutralization, informing immunotherapy selection.
Pipeline & Workflow Integration
The assay integrates into the discovery continuum from early immune profiling to lead identification, supporting hypothesis testing and biological de-risking prior to preclinical advancement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying multi-isotype antibody responses to C. difficile antigens, clarifying immune pathways involved in infection and therapy response.
- Screening: Describes assay readiness through standardized printing, blocking, and detection steps that yield quantitative fluorescence outputs for comparative analysis.
- Analytics: Highlights measurable readouts such as fluorescence intensity and Spearman correlation with ELISA, enabling teams to compare antibody levels across conditions and samples.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by profiling antibody responses in sera from infected individuals and those receiving IVIg, informing biomarker-aligned advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Positions the microarray platform as a reusable capability for profiling humoral responses across diverse antigens, sample types, and therapeutic contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in immune-mediated protection.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of multi-antigen, multi-isotype antibody detection.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in immunotherapy development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on serological profiling of functional antibody responses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in antigen purification, panel optimization, and microarray platform setup and maintenance.
- Dependent on specialized instrumentation including arrayer, laser scanner, and environmental controls for humidity and dust-free operation.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation, blocking, washing, and detection protocols to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when extending the panel to new antigens, sample matrices (e.g., plasma, supernatants), or clinical cohorts.
- Limited by the need for highly purified antigens and careful optimization of printing buffers, surface chemistry, and antibody dilutions to maintain array quality and signal integrity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:14
Preparing a Microarray Plate and Printing with a Contact Robot
3:06
Array Probing
5:19
Array Scanning
6:36
Results: Validation of Protein Microarray to Detect Isotype Specific Antibody Response to Clostridium difficile Toxins and Its Reproducibility
8:01
Conclusion
