Isolatie van menselijke endotheliale cellen van normale Colon en colorectaal carcinoom - een verbeterde Protocol
4 april 2018
Endotheliale cellen van de tumor zijn belangrijke determinanten van de communicatie van de tumor en het verloop van de ziekte. Hier, wordt een protocol voor de isolatie van zuiver en levensvatbare endotheliale cellen van menselijke colorectaal carcinoom en normale dikke darm moet worden gebruikt in drugsonderzoek testen en pathogenese beschreven.
Het algemene doel van dit celisolatieprotocol is om pure en levensvatbare endotheelcellen te verkrijgen van patiënten die lijden aan colorectaal carcinoom, zowel uit de tumor als uit het bijbehorende normale colon. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van tumorbiologie en angiogenese, zoals het schatten en analyseren van de impact van het bloedvatensysteem op colorectale tumorigenese. Het grote voordeel van deze techniek is dat men een relatief hoge slagingskans heeft om pure en levensvatbare humane endotheelcellen te verkrijgen van patiënten met colorectaal carcinoom.
Om het weefselmonster van patiënten met colorectaal carcinoom te verkrijgen, gebruikt u een scherp mes om stukken weefsel te verkrijgen die ongeveer een gram wegen. Gebruik vervolgens steriele pincetten om de verse weefselstukken over te brengen in 40 milliliter ijskoud HBSS-buffer met antibiotica in een 50-milliliter centrifugeerbuis. Gebruik vervolgens aparte steriele pincetten om het carcinoom en het normale weefsel achtereenvolgens van de ene centrifugeerbuis naar de andere over te brengen om vier keer te wassen in 40 milliliter ijskoud HBSS-buffer met antibiotica.
Om alle vet, niet-tumoreus weefsel of mogelijk necrotisch weefsel te verwijderen, gebruikt u steriele pincetten en brengt u de weefselstukken over naar een steriele celkweek-Petrischaal. Voeg vervolgens drie tot vijf milliliter van de antibioticum-aangevulde HBSS-buffer toe om de weefselstukken vochtig te houden. Gebruik vervolgens een scherp mes om de weefselstukken te trimmen.
Gebruik vervolgens een mes met een gebogen lemmet om het resterende weefsel in kleine stukjes te snijden. Breng de gesneden weefselstukken over in een weefseldissociatiebuis gevuld met voorverwarmd celkweekmedium. Dissocieer de gesneden weefselstukken met behulp van een weefseldissociatieapparaat, samen met een tumordissociatiekit voor menselijk weefsel volgens de instructies van de fabrikant.
De eerste cruciale stap is om het chirurgische specimen correct te verwerken en microdissectie uit te voeren om weefselstukken met de juiste grootte en weefseltype te verkrijgen. Na het dissociëren van de weefselstukken, centrifugeer het bij kamertemperatuur gedurende één minuut met 300 keer de zwaartekracht. Gebruik vervolgens een serologische pipette om 10 milliliter voorverwarmd DMEM Low-medium toe te voegen aan de MACS-buis.
Pomp vervolgens de celsuspensie uit de buis op een celsifter met een poriegrootte van 100 micrometer die bovenop een 50-milliliter centrifugeerbuis is geplaatst. Pipetteer een extra 10 milliliter DMEM Low-medium in de MACS-buis om de extra cellen uit de buis door de sifter in de centrifugeerbuis te spoelen. Zodra de hele celsuspensie is gefilterd, was de celsifter met een extra 10 milliliter DMEM Low-medium.
Centrifugeer de celsuspensie bij kamertemperatuur gedurende zeven minuten met 300 keer de zwaartekracht. Gooi vervolgens de supernatant weg zodra de centrifugatie voorbij is. Los vervolgens het celpellet op in vijf milliliter antibioticum-aangevuld, voorverwarmd EBM-2-MV-medium in dezelfde 50-milliliter centrifugeerbuis.
Verwijder de coating-oplossing uit de kweekfles en breng de celsuspensie direct over in een T-25 kweekfles die op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide wordt gehouden. Wanneer de confluency ongeveer 80 tot 90% bereikt, voegt u één milliliter Accutase toe om de cellen in de fles los te maken. Laat vervolgens de cellen gedurende 10 minuten met Accutase staan.
Voeg vervolgens vier milliliter EBM-2-MV-medium toe dat op 37 graden wordt gehouden. Gebruik vervolgens een geautomatiseerd celtellingsapparaat met een bereik van 10 tot 25 micrometer om de cellen te tellen. De tweede meest cruciale stap zijn alle stappen waarbij de cellen moeten worden gesplitst.
De schatting van het juiste tijdstip vereist ervaring. Als de splitsing te vroeg is, zullen de cellen afsterven. Als de splitsing te laat is, zullen de endotheelcellen senescentie bereiken of zal fibroblastische overgroei een probleem zijn.
Centrifugeer vervolgens de cellen bij kamertemperatuur gedurende vier minuten met 250 keer de zwaartekracht en giet het supernatant af aan het einde van de draai. Los vervolgens het celpellet op in voorverwarmde FACS-buffer. Voeg vervolgens de FACS-kleuringsantilichamen toe aan de cellen.
Meng en incubeer vervolgens gedurende een totaal van 15 minuten bij kamertemperatuur. Halverwege deze incubatieperiode, draai de buis eenmaal om. Gebruik een serologische pipette om twee milliliter FACS-buffer toe te voegen aan de gelabelde celsuspensie.
Centrifugeer vervolgens de celsuspensie bij kamertemperatuur gedurende vier minuten met 250 keer de zwaartekracht en gooi het supernatant weg nadat de centrifugatie is voltooid. Voeg vervolgens twee milliliter FACS-buffer toe om het celpellet op te lossen en centrifugeer de cellulaire suspensie bij kamertemperatuur gedurende vier minuten met 250 keer de zwaartekracht. Breng vervolgens het pellet opnieuw op in 500 microliter antibioticum-aangevuld EBM-2-MV-medium.
Breng vervolgens de cellen over naar het FACS-sorteerapparaat. Identificeer tripel-positieve cellen en laat ze zaaien in de 24-well kweekplaat gevuld met vers, voorverwarmd EBM-2-MV-medium. Kweek de cellen de volgende 48 uur en ververs vervolgens het medium.
Ga door met het verversen van het medium om de twee dagen totdat de confluency 90 tot 100% bereikt in vijf tot tien dagen. Breid vervolgens de celpopulatie uit volgens de gewenste kweekplaat. Oogst vervolgens zodra de confluency is bereikt en ga verder met karakterisering.
Eerst wordt het verkregen tumormonster gedissocieerd en gezaaid in een celkweekplaat. De niet-aderente cellen worden afgespoeld en de aderente cellen worden gekweekt tot 80 tot 90% confluency vóór FACS-sortering. Vervolgens wordt FACS-analyse uitgevoerd om de populatie van de immunogelabelde levensvatbare tumor- en normale endotheelcellen te identifi
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het isoleren van zuivere en levensvatbare endotheelcellen uit menselijk colorectaal carcinoom en normaal colonweefsel. De methode is bedoeld om geneesmiddelentesten en onderzoek naar de pathogenese van colorectale kanker te faciliteren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Oncologie
Achtergrond
- Tumorale endotheelcellen beïnvloeden de tumormicro-omgeving aanzienlijk.
- Inzicht in deze cellen kan leiden tot nieuwe inzichten in tumorbiologie en angiogenese.
- Het isoleren van levensvatbare endotheelcellen is essentieel voor het bestuderen van colorectaal carcinoom.
- Dit protocol is erop gericht het succespercentage bij het verkrijgen van deze cellen van patiënten te verhogen.
Doel van de studie
- Om endotheelcellen te isoleren uit colorectale carcinomen en normaal colonweefsel.
- Om de rol van het bloedvatenstelsel bij colorectale tumorigenese te analyseren.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor geneesmiddelentesten en onderzoek naar pathogenese.
Gebruikte methoden
- Verzamelen van weefselmonsters van patiënten met colorectaal carcinoom.
- Sequentieel wassen en verwerken van weefselmonsters.
- Dissociatie van fijngehakt weefsel met behulp van een weefseldissociator.
- FACS-sortering om levensvatige endotheelcellen te identificeren en te isoleren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van tumor- en normale endotheelcellen.
- Identificatie van celpopulaties via FACS-analyse.
- Immunocytochemie bevestigde de expressie van endotheelcelmarkers.
- Opbrengst van 3,6% tumor- en 5,6% normale endotheelcellen van de totale populatie.
Conclusies
- Het protocol isoleert effectief levensvatbare endotheelcellen voor onderzoek.
- De verkregen inzichten kunnen het begrip van de biologie van colorectale kanker bevorderen.
- Deze methode kan worden toegepast in verdere studies naar tumorangiogenese.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Betrouwbare isolatie van zuivere, levensvatbare menselijke endotheelcellen uit zowel normaal colonweefsel als colorectaal carcinoomweefsel maakt mechanische analyse van de tumormicro-omgeving en de vasculaire bijdragen aan tumorigenese mogelijk. Dit protocol ondersteunt het voorspellend vertrouwen bij vroege ontdekking en targetvalidatie door ziekterelevante cellulaire modellen te bieden voor functionele studies en het testen van therapeutische hypothesen. De aanpak verbetert de besluitvorming over het portfolio door een robuuste evaluatie van anti-angiogene strategieën en resistentiemechanismen bij colorectale kanker mogelijk te maken.
Strategische toepassingen in BioPharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe studie mogelijk van de biologie van tumorendotheelcellen (TEC) en hun rol in de tumormicro-omgeving.
- Ondersteunt de functionele validatie van vasculaire targets die betrokken zijn bij de progressie van colorectale kanker en de respons op therapie.
- Vergemakkelijkt mechanische risicoreductie door TEC's te onderscheiden van normale endotheelcellen (NEC's) middels marker-gebaseerde FACS-sortering.
- Biedt een platform voor het evalueren van de impact van specifieke micro-omgevingsfactoren op het endotheel-fenotype en de functie.
Screening & Assayontwikkeling
- Levert zuivere, levensvatbare primaire TEC- en NEC-culturen die geschikt zijn voor downstream compound-screening en assay-ontwikkeling.
- Maakt kwantitatieve beoordeling van de expressie van endotheelcelmarkers en functionele outputs mogelijk via immunocytochemie en RT-qPCR.
- Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie van assays door het waarborgen van celpopulaties met een hoge zuiverheid via triple-marker FACS-sortering.
- Ondersteunt de screening van anti-angiogene middelen in een ziekterelevante cellulaire context.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt in vitro endotheliale modellen uit in lijn met patiëntafgeleide tumorbiologie voor translationele biomarkerontdekking.
- Maakt onderzoek mogelijk naar TEC memory-like effecten en hun bijdrage aan de tumoromgeving.
- Faciliteert studies naar resistentiemechanismen tegen anti-angiogene therapieën met behulp van primaire menselijke cellen.
- Ondersteunt de risico-gecorrigeerde ontwikkeling van vasculair gerichte therapieën in preklinische pijplijnen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek door gevalideerde primaire endotheelcelculturen te leveren voor mechanistische studies, assayontwikkeling en translationeel onderzoek naar colorectale kanker.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing met betrekking tot vasculaire bijdragen aan tumorigenese en therapierespons.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, hoogzuivere celpopulaties voor reproduceerbare evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Maakt kwantitatieve meting van endotheliale markers en functionele outputs mogelijk voor vergelijkende studies.
- Translationeel Onderzoek: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en patiëntafgeleide tumorbiologie voor de afstemming van biomarkers.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare workflow voor het isoleren van primaire endotheliale cellen uit diverse weefselbronnen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van vasculaire targets en mechanistische studies.
- Operationele waarde: Standardiseert de isolatie en karakterisering van primaire endotheelcellen voor schaalbare R&D-workflows.
- Strategische waarde: Maakt onderbouwde go/no-go beslissingen mogelijk voor anti-angiogene therapieën en therapieën gericht op de micro-omgeving.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van vasculaire targets in oncologische pipelines.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in primaire endotheelcelkweek en FACS-gebaseerde cel sortering.
- Vereist toegang tot verse menselijke weefselmonsters en coördinatie met chirurgische teams en pathologieafdelingen.
- Necessiteert gespecialiseerde instrumentatie voor weefseldissociatie, FACS-analyse en kwantitatieve moleculaire assays.
- Omvat standaardisatie van weefselverwerking en celkarakteriseringsprotocollen tussen verschillende teams.
- Praktische beperkingen omvatten de fragiliteit van cellen, de timing van het splitsen van cellen en het potentieel voor overgroei van fibroblasten indien dit niet zorgvuldig wordt beheerd.
Veelgestelde vragen over biopharma
Chapters in this video
0:04
Title
0:51
Surgery, Preparation of Tissue, and Generation of Single Cell Suspension
4:17
FACS Sorting, Harvesting and Characterization of Endothelial Cells
7:17
Results: Isolation of Normal and Tumor Endothelial Cells via FACS Sorting and Study of Endothelial Cell Specific Markers
8:59
Conclusion
