Ruimtelijke kwantificering van Drugs in longtuberculose laesies door Laser vangen Microdissection vloeistof chromatografie massaspectrometrie (LCM-LC/MS)
18 april 2018
Hier beschrijven we een protocol met behulp van laser vangt microdissection LC/MS-analyse wordt gekoppeld aan het ruimtelijk-kwantificeren drug distributies binnen longtuberculose granulomas. De aanpak heeft brede toepasbaarheid te kwantificeren van de drug concentraties in weefsels bij hoge ruimtelijke detail.
Het algemene doel van deze analytische techniek is om het antituberculosemiddel ethambutol in de weefselcompartimenten van de longlesies van tuberculose te kwantificeren om te bepalen of er bacteriedodende geneesmiddelconcentraties worden bereikt. Deze methode kan vragen beantwoorden op het gebied van tuberculose-geneesmiddelontdekking en -ontwikkeling door te bepalen of toegediende geneesmiddelen bacteriële populaties bereiken bij steriliserende concentraties in alle granulomaweefselcompartimenten. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een volledige kwantificering van de geneesmiddelconcentraties mogelijk maakt met hoge ruimtelijke details binnen specifieke weefselstructuren en celpopulaties.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de stappen voor weefselsnede en -montage moeilijk te leren zijn vanwege de mogelijkheid van weefselbesmetting en de kwetsbare aard van de membraanslides. Begin deze procedure met weefselverzameling zoals beschreven in het tekstprotocol. Om weefselsnede uit te voeren, stelt u eerst de cryostaat in op de gewenste snededemperatuur.
Breng de gamma-bestraalde longbiopsie van de opslag op min 80 graden Celsius over naar de cryostaat en laat deze 30 minuten staan om de weefseltemperatuur te laten gelijkschakelen. Bevestig de biopsie met behulp van pincetten aan de cryostaat-klem met behulp van een kleine hoeveelheid optimaal snijtemperatuur-kleefmiddel om de basis van het weefsel aan de klem te hechten. Orienteer het weefsel zodat het platte oppervlak het blootgestelde oppervlak voor snijden is.
Zorg ervoor dat de OCT het weefseloppervlak niet besmet, omdat dit de daaropvolgende massaspectrometrieanalyse kan verstoren. Snijd drie weefselsecties met een dikte van 25 micrometer en monteer ze op PET-membraanslides. Raak de membraan voorzichtig aan met het weefselsectie en verwijder de sectie.
Als er te veel druk wordt uitgeoefend, kan de dunne membraan scheuren. Vermijd overmatig hanteren van de slide voor montage om geen PET-membraan op te laden en de hechting van het weefselsectie te verminderen. Bewaar de membraanslide op kamertemperatuur om het op smelten en succesvolle hechting van het weefsel aan het membraan mogelijk te maken.
Verwijder de slide uit de cryostaat en laat de slide drie minuten aan de lucht drogen. Als LCM-LC-MS/MS niet onmiddellijk zal worden uitgevoerd, verzegel de slide in een kleine luchtdichte verzegelbare zak en breng deze over naar de opslag op min 80 graden Celsius totdat deze vereist is voor dissectie. Snijd een aangrenzende sectie van 10 tot 12 micrometer en smeltmontage op een standaard glazen slide voor hematoxylinen en eosinkleuring.
Op dit moment kunnen aanvullende secties worden gesneden voor andere gewenste histochemische kleurstoffen. Verwijder de verzegelde zak met de slide uit de opslag op min 80 graden Celsius en laat deze vijf minuten op kamertemperatuur komen. Als de koude slide onmiddellijk wordt blootgesteld aan de laboratoriumatmosfeer, zal het weefsel bedekt raken met condensatie en kan de ruimtelijke integriteit van het geneesmiddel worden aangetast.
Schakel de microscoop en laser in. De laser heeft vijf tot tien minuten nodig om op te warmen voordat het snijden kan beginnen. Laad vlakkap 0,20 milliliter PCR-buisjes in de houder.
Nadat de slide uit de zak is verwijderd, neemt u een optisch beeld van de weefselsectie op de PET-slide met behulp van een flatbedscanner. Plaats de slide in de slidehouder, met de weefselzijde naar beneden. Wijs afzonderlijke verzamelbuisjes toe aan specifieke granuloma-regio's van belang met behulp van de microscoopsoftware.
Deze zullen meestal niet-betrokken long, cellulair granuloma en caseum zijn, maar kunnen variëren afhankelijk van de specifieke pathologie van de granulomabiopsie. Richt de weefsels op met behulp van het 5X microscoopobjectief. Deze vergroting moet een goed overzicht geven van het weefsel met zowel cellulaire als necrotische granuloma-gebieden.
Selecteer in de software het buisje dat is aangegeven als caseum om het onder het weefsel te brengen. Voer de gewenste dissectieparameters in. Typische instellingen voor een longsectie van 25 micron dik zijn laservermogen 30, snelheid 15 en diafragma 35.
Deze zullen echter verschillen afhankelijk van de gebruikte microscoop en potentieel afnemend vermogen vanwege de leeftijd van de laser. Selecteer de Free Draw-tool en omlijn met behulp van een muis of touchscreen-pen het gewenste gebied voor dissectie. De oppervlakte van het gebied wordt weergegeven in de software.
Houd geselecteerde regio's onder 500.000 vierkante micrometer om gemakkelijker dissectie mogelijk te maken. Herhaal de dissectie tot er in totaal drie miljoen vierkante micrometer in de buisjeskap is verzameld. Soms kan het gedissecteerde gebied aan de omringende membraan blijven plakken en niet in de verzamelkap vallen.
Verwijder deze regio's van de cumulatieve oppervlaktetotaal door ze handmatig te selecteren en te verwijderen in de software. Selecteer vervolgens de kap voor cellulair letsel en verzamel drie miljoen vierkante micrometer weefsel met behulp van hetzelfde proces. Selecteer de kap voor niet-betrokken long en verzamel drie miljoen vierkante micrometer weefsel met behulp van hetzelfde proces.
Let erop dat niet-betrokken longweefsel veel bronchiolen en longblaasjes bevat. Besteed zorgvuldige aandacht aan het uitsluiten van deze uit de gedefinieerde weefselregio's voor dissectie. Verwijder de buisjeshouder en ontgrendel, verzegel en label elke buis voorzichtig.
Bescherm de gedissekteerde weefsels tegen verstoringen door omringende lucht. Analyseer de gedissekteerde weefsels onmiddellijk of bewaar ze op min 80 graden Celsius en smelt ze voorafgaand aan verwerking en LC/MS-analyse. Ga uit van een weefseldichtheid van één gram per milliliter en bereid de homogenaatvoorraad voor door 50 milligram controleweefsel te wegen en PBS-buffer toe te voegen om te verdunnen.
Homogeniseer het weefsel door het longweefsel en PBS-buffer gedurende vijf minuten met 1750 omwente
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het kwantificeren van geneesmiddelverdelingen binnen granulomen van pulmonale tuberculose met behulp van laser capture microdissection en LC/MS-analyse. De methode maakt een hoge ruimtelijke detaillering mogelijk bij het meten van geneesmiddelconcentraties binnen specifieke weefselstructuren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Farmacologie
- Microbiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van de medicijnverdeling in tuberculoseletsels is essentieel voor een effectieve behandeling.
- Ethambutol is een anti-tuberculosemiddel dat steriliserende concentraties moet bereiken.
- Granulomen zijn complexe structuren waarin bacteriën kunnen persisteren.
- Huidige methoden missen de ruimtelijke resolutie die nodig is voor een gedetailleerde analyse.
Doel van de studie
- Om ethambutolconcentraties in weefsels van tuberculoseletsels te kwantificeren.
- Om te beoordelen of drugconcentraties effectieve niveaus bereiken in alle compartimenten van het granuloom.
- Om een visuele demonstratie van de methode te geven voor een beter begrip.
Gebruikte methoden
- Laser capture microdissectie voor het isoleren van specifieke weefselregio's.
- LC/MS-analyse voor het kwantificeren van drugconcentraties.
- Weefselcoupes maken met een cryostaat bij gecontroleerde temperaturen.
- Zorgvuldig monteren van weefselmonsters om contaminatie te voorkomen.
Belangrijkste resultaten
- De methode kwantificeert met succes de drugspiegels in verschillende compartimenten van het granuloom.
- Het vermogen om de drugdistributie met een hoge ruimtelijke detaillering te visualiseren is aangetoond.
- Er is inzicht verschaffen in de effectiviteit van ethambutol bij het bereiken van bacteriële populaties.
- De uitdagingen bij de weefselverwerking en -preparatie zijn belicht.
Conclusies
- Deze techniek is waardevol voor de ontdekking en ontwikkeling van geneesmiddelen tegen tuberculose.
- Het stelt onderzoekers in staat om de dynamiek van de medicijndistributie binnen weefsels te begrijpen.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methode om behandelstrategieën te verbeteren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Een nauwkeurige ruimtelijke kwantificering van drugconcentraties binnen compartimenten van het granuloom is essentieel om te evalueren of anti-tuberculeuze middelen bactericide niveaus bereiken in necrotisch caseum en cellulaire laesiegebieden. Deze mogelijkheid informeert direct go/no-go-beslissingen bij de ontwikkeling van TB-medicijnen door mechanische risicoreductie van target-engagement en farmacokinetische adequaatheid mogelijk te maken. De methode ondersteunt voorspellend vertrouwen bij lead-optimalisatie door drugblootstelling te koppelen aan steriliserende concentraties over heterogene micro-omgevingen van laesies.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door vast te stellen of geneesmiddelen steriliserende concentraties bereiken in specifieke compartimenten van het granuloom.
- Operationele waarde: Levert ruimtelijk opgeloste kwantitatieve gegevens om de risico's bij targetvalidatie-inspanningen in complexe, ziekte-relevante systemen te verminderen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op standaardisatie van downstream-assays door pathologisch onderscheidbare weefselregio's te isoleren.
- Operationele waarde: Ondersteunt de reproduceerbaarheid van assays en kwantitatieve read-outs die essentieel zijn voor een betrouwbare evaluatie van verbindingen in screeningscascades.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Behoudt de ziekterelevantie door drugspiegels te kwantificeren in menselijk relevante granuloomstructuren, wat afstemming van translationele biomarkers mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Faciliteert risico-gecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling door middel van gegevens die het gehele continuüm beslaan, van discovery tot preklinische validatie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm door ruimtelijk opgeloste gegevens over de drugconcentratie te leveren, die de identificatie van lead-verbindingen en preklinisch werk informeren door middel van mechanistische risicoreductie van target-engagement in granuloomcompartimenten.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en de verduidelijking van pathways door de distributie van geneesmiddelen in necrotische en cellulaire laesiegebieden te kwantificeren.
- Screening: Maakt assay-gereedheid en reproduceerbaarheid mogelijk door hoogwaardige isolatie van weefselcompartimenten voor consistente tests van verbindingen.
- Analytics: Levert absolute metingen van de geneesmiddelconcentratie die vergelijking tussen verschillende condities en exposure-responsmodellering mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Sluit aan bij preklinische continuïteit door menselijk weefselrelevante gegevens te verschaffen over de penetratie van geneesmiddelen in het caseum en de rand van granulomen.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor ruimtelijk opgeloste kwantificering van geneesmiddelen, toepasbaar op meerdere ziektebeelden met gestructureerde laesies.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit bij interacties tussen geneesmiddel en laesie.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van workflows voor ruimtelijk opgeloste kwantificering van geneesmiddelen.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en vermindering van biologische risico's in een laat stadium binnen anti-infectieuze programma's.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van compartimentspecifieke gegevens over blootstelling aan geneesmiddelen.
Overwegingen bij de implementatie
- Expertise in laser capture microdissectie en weefselverwerking om contaminatie te voorkomen en ruimtelijke integriteit te waarborgen.
- Toegang tot een cryostaat, LC-MS/MS-instrumentatie en acetonitril/water-extractie-oplossingen voor monstervoorbereiding.
- Standaardisatie tussen de teams voor histologie, moleculaire analyse en farmacologie voor een consistente definitie van de region-of-interest.
- Aanpassingen met het oog op variërende granuloompathologie en weefseldichtheid in verschillende ziekte-modellen.
- Praktische beperkingen omvatten de fragiliteit van weefselcoupes en potentiële OCT-interferentie met de MS-analyse indien dit niet zorgvuldig wordt gecontroleerd.
