Name: Ruimtelijke kwantificering van Drugs in longtuberculose laesies door Laser vangen Microdissection vloeistof chromatografie massaspectrometrie (LCM-LC/MS) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Leer hoe u ethambutol kunt kwantificeren in tuberculose longlaesies met laser capture microdissectie en LC/MS. Deze methode biedt hoge ruimtelijke resolutie voor het meten van drugconcentraties in specifieke weefselcompartimenten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken Paul O'Brien, Marizel Mina en Isabella Freedman voor dierproeven, Jacquie Gonzalez en Danielle Weiner van NIH/NIAID voor hulp bij gamma bestraling van konijn weefsels voorafgaand aan de laser vangt microdissection en Jansy Sarathy voor manuscript gedachten en advies. Dit werk werd gesteund door financiële middelen van de Bill en Melinda Gates Foundation (OPP1174780) en NIH gedeeld instrumentatie verlenen 1S10OD018072. Wij danken Eliseo A. Eugenin voor toegang tot de Leica LMD 6500 Microscoop en het delen van expertise en advies. De aankoop en continue ondersteuning van de 6500 LMD werd gefinancierd door het National Institute of Mental Health grant, MH096625, het National Institute of Neurological Disorders en beroerte, NS105584, PHRI financiering (E.A.E) en GSK bijdragen (aan E.A.E).

Alle dierlijke studies werden uitgevoerd volgens de richtsnoeren voor de zorg en het gebruik van proefdieren van het National Institutes of Health met goedkeuring van de institutionele Animal Care en gebruik Comité van de NIAID (NIH), Bethesda, MD.
1. dierproeven en weefsel collectie
Dit gedeelte van het protocol beschrijft dierlijke procedures en sample collectie Biosafety Level 3 (BSL3) omstandigheden. Eerder beschreven gedetailleerde protocollen van de Mycobacterium tuberculosis aërosol infectie procedure drug administratie en protocollen bij konijnen zijn11,12.
<ol><li>Nieuw-Zeeland wit konijnen (mannelijk en vrouwelijk op 4-5 maanden oud) met M. tuberculosis HN878 infecteren11met behulp van een neus-alleen aërosol-systeem, zoals hiervoor is beschreven.</li>
	<li>Beheren van de gekozen drugs (Ethambutol in het voorbeeld hier gepresenteerd) via de gewenste route en euthanaseren van de dieren op 2, 6 en 24 uur na toediening. Ten eerste, het anesthetize van het konijn door intramusculaire injectie van Ketamine op 35 mg/kg en Xylazine bij 5 mg/kg. Wacht tien minuten en juiste afstomping bevestigen door knijpen de staart en zachtjes aanraken van het oog. Als er geen reactie, euthanaseren door intraveneuze toediening van pentobarbital en fenytoïne (Zie Tabel van materialen) in 1 mL/4,5 kg in 2 mL steriele zoutoplossing. Opmerking: Deze timepoints zijn optimale ter dekking van het farmacokinetische profiel voor Ethambutol en vereisen aanpassen/optimaliseren voor andere studie drugs.</li>
	<li>Gebruik pincet, schaar en/of scalpel, verwijderen van de longen van de borstholte, resect Long biopsieën met grote necrotische granulomas ingebed in het omringende afzijdig longweefsel (zoals eerder beschreven3). Necrotische granulomas verschijnen in beige kleur en meestal iets uitsteken van de omliggende rood/roze-gekleurde Long. Ter vergemakkelijking gemakkelijk cryosectioning, ervoor zorgen dat biopten niet groter zijn dan 2 x 1,5 x 1,5 cm.</li>
	<li>Plaats de biopsie op een vooraf gelabelde cryomold dienblad met de gewenste snijvlak met pincet, in direct contact met de basis van de lade. Na invriezing, zorgt dit voor een plat oppervlak waaruit cryosecties zal worden gesneden.</li>
	<li>Het bevriezen van de biopsie in vloeibare stikstof damp. Vul een piepschuim container tot een diepte van 2 inch met vloeibare stikstof en plaatsen van een metalen buis draadrek. Het rek moet uitsteken boven het oppervlak van de vloeibare stikstof bieden een plat oppervlak waarop de weefsel schaaltjes zijn geplaatst. Plaats het deksel terug op de styrofoam-container en laat weefsels voor 10 minuten naar het volledig bevriezen.</li>
	<li>Verwijder de weefsel schaaltjes, snel wikkel in aluminium film en plaats afzonderlijk label hersluitbare plastic zakken en zegel. Overbrengen-80 ° C vrieskast voor opslag. Opmerking: Stappen 1.1-1.6 zijn uitgevoerd in BSL3 voorwaarden (met inbegrip van alle dierlijke werk en behandeling van besmette organen en weefsels). Gamma bestralen de Long biopsieën 3 megarad behandeling buiten BSL3 insluiting inschakelen. Laser vangt microdissection op unsterilized weefsel kan worden uitgevoerd binnen de BLS3 faciliteit als goedgekeurd veiligheid protocollen zijn getroffen. De rest van dit protocol wordt echter beschreven downstream processing in een faciliteit BSL-2.</li>
</ol>2. de weefsels segmenteren
<ol><li>De cryostaat tot het snijden van de gewenste temperatuur instellen De gamma-bestraalde Long biopsie van-80 ° C opslag overbrengen naar de cryostaat en laat gedurende 30 minuten om de temperatuur van het weefsel equilibreer. Opmerking: -20 tot-22 ° C is optimaal voor TB laesie biopsieën.</li>
	<li>Met pincet, bevestigen de biopsie aan de cryostaat chuck met behulp van een kleine hoeveelheid van optimale scherpe temperatuur lijm (OCT) te houden van de basis van het weefsel aan de chuck. Het weefsel oriënteren zodat het platte oppervlak (dat was in contact met de basis van de cryomold) het blootgestelde oppervlak voor het snijden is. Zorg ervoor dat de LGO vervuilt niet het oppervlak van het weefsel, omdat dit met de Spectrometrie van de massa van de daaropvolgende analyse interfereren kan.</li>
	<li>Drie weefselsecties bij 25 µm dikte snijden en mount in PET membraan dia's. Zachtjes aanraken van het membraan naar de weefselsectie en verwijderen. Als te veel druk wordt toegepast, kan de dunne membraan scheurt.<ol>
<li>Vermijd buitensporige behandeling van de dia's vóór montage aangezien dit zal resulteren in het membraan van de PET steeds geladen en slechte hechting van de weefselsecties. Ervoor zorgen dat de membraan dia wordt bewaard bij kamertemperatuur om dooi-montage en succesvolle hechting van het weefsel aan de membraan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De dia uit de cryostaat verwijderen en laten drogen gedurende 3 minuten. Als LCM-LC/MS/MS zal niet onmiddellijk worden uitgevoerd, zegel de dia in een luchtdicht afsluitbaar zakje en overdracht aan-80 ° C opslag totdat vereist voor dissectie.</li>
	<li>Snijd een aangrenzende sectie op 10-12 µm en dooi-mount op een standaard glasplaatje voor haematoxyline en eosine (H & E) kleuring en verwijzing. Extra secties kunnen worden gesneden op dit moment voor andere gewenste histochemie vlekken (zoals Ziehl-Niellsen voor het visualiseren van Mycobacterium tuberculosis (MTB)).</li>
</ol>3. Microdissection
<ol><li>Verwijderen van verzegelde zak met de dia uit de opslag van-80 ° C en laat kamertemperatuur gedurende 5 minuten bereiken. Opmerking: Als de koude dia wordt direct blootgesteld aan de atmosfeer laboratorium, het weefsel zal worden bekleed met condensatie en de ruimtelijke integriteit van de drug kan worden aangetast.</li>
	<li>Schakel de Microscoop en laser (laser vereist 5-10 minuten opwarmen voordat snijden kan beginnen). Laad flat-cap 0,20 mL PCR buizen in de houder.</li>
	<li>Dia verwijderen uit de zak en nemen een optische beeld van de weefselsectie op de PET-dia een flatbedscanner gebruikt.</li>
	<li>Plaats van de dia in de dia houder (weefsel kant naar beneden) en gescheiden inzameling buizen toewijzen aan specifieke granuloma regio's van belang met behulp van de Microscoop software. Meestal zullen deze 'afzijdig lung,' 'cellulaire granuloma,' en 'caseum' (necrotisch midden), maar kan variëren afhankelijk van de specifieke pathologie van de granuloma/biopsie.</li>
	<li>Focus op het weefsel met de 5 X Microscoop doelstelling. Deze vergroting dient een goed overzicht van het weefsel bevattende zowel cellulaire en necrotische granuloma gebieden. Selecteer de aangewezen 'caseum' om deze te verplaatsen naar de gewenste positie onder het weefsel van de buis in de software.</li>
	<li>Voer de gewenste dissectie-parameters. Standaardinstellingen voor een 25 µm dik Long sectie zijn laser macht 30, 15, en diafragma 35 (willekeurige eenheden). Dit zal echter verschillen afhankelijk van de Microscoop gebruikt en potentieel afnemende macht als gevolg van de leeftijd van de laser.</li>
	<li>Selecteer het gereedschap 'gratis-draw' en met behulp van een muis of touchscreen pen, overzicht van het gewenste gebied voor dissectie. De oppervlakte van de regio zal getoond worden in de software. Geselecteerde regio's onder 500.000 µm2 (0,5 mm2) ter vergemakkelijking van gemakkelijker dissectie houden. Herhaal de dissectie tot 3 miljoen µm2 (3 mm2) zijn verzameld in totaal in de dop van de tube.<ol>
<li>Soms kan de ontleed regio blijven steken naar de omliggende membraan (bijvoorbeeld als gevolg van statische attractie) en niet vallen in het GLB collectie. Deze regio's uit de cumulatieve oppervlakte totaal verwijderen door te selecteren en handmatig verwijderen binnen de software.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selecteer het GLB voor 'cellulaire laesie' en verzamelen van 3 miljoen µm2 van weefsel via hetzelfde proces zoals beschreven in stap 3.7.</li>
	<li>Selecteer het GLB voor 'afzijdig lung' en verzamelen van 3 miljoen µm2 van weefsel via hetzelfde proces zoals beschreven in stap 3.7. Merk op dat afzijdig longweefsel vele bronchioli en alveolaire ruimten bevat. Let goed op het uitsluiten van de gedefinieerde weefsel regio's voor dissectie.</li>
	<li>Verwijder de dop houder en zorgvuldig unclip, zegel en label van elke buis. Bescherm de ontleed weefsels uit de omliggende lucht verstoringen (zoals met ingang van verstoring van de stroom van de lucht van een deur openen). Analyseer de ontleed weefsels onmiddellijk, of opslaan bij-80 ° C en voorafgaand aan de verwerking en analyse van de LCMS ontdooien.</li>
</ol>4. extractie en LCMS analyse
<ol><li>Bereid extractieoplossing van 1:1 acetonitril/methanol met Ethambutol d-10 interne standaard. Bij het selecteren van een interne standaard, gebruik een stabiele gelabelde vorm van de analyt drug (zoals deuterium-geëtiketteerden EMB gebruikt in deze demonstratie) en met voldoende massa SHIFT ingedrukt om te voorkomen dat isotoop cross talk tussen de analyt drug en standaard (meestal minimaal 4 Dalton) . Opmerking: Opstellen van normen op homogenaat van elke respectieve weefseltype is moeilijk omdat er is zeer beperkte controle weefsel waarmee homogenaat normen maken. Als alternatief voor het maken van de normen van een puntige homogenaat monster, kan een standaard worden gemaakt door toevoeging van lege weefsel en teststof samen en uitgepakt. Een volume van weefsel van het besturingselement in een homogenaat die overeenkomt met het doelvolume voor de studie steekproef weefselsecties wordt gecombineerd rechtstreeks met een bedrag van de teststof dat bij een bepaalde concentratie aanwezig zou zijn.</li>
	<li>Berekenen van het volume van de gerichte weefsel op basis van de oppervlakte en de dikte van de weefselsectie en bepalen de nodige verdunningsfactor voor het homogenaat met behulp van de hoeveelheid homogenaat die zal worden toegevoegd aan de standaard en QC-monsters. Berekeningen zijn hieronder geïllustreerd voor 3 miljoen µm2 (3 mm2) ontleed doelgebied met een 25 µm dikte en 2 µL homogenaat hoeveelheid. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq4.jpg">
</li>
	<li>Uitgaande van een weefsel dichtheid van 1 g/mL, bereiden de homogenaat voorraad door met een gewicht van 50 mg controle weefsel en het toevoegen van PBS buffer om te verdunnen (met behulp van de verdunningsfactor 26.67 homogenaat berekend in stap 4.2, het oplosmiddel is 1.283 mL). Meng door parel gewonnen van longweefsel en PBS buffer voor 5 minuten van 1750 toeren per minuut op een kraal homogenizer. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq5.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq6.jpg">
</li>
	<li>Verdunnen 1 mg/mL drug voorraden concentratie in 1:1 acetonitril/water maken standaard curve stekelige oplossingen. Bepalen stekelige standaard concentraties op basis van het volume spike en het doelvolume weefsel. Het geïllustreerde voorbeeld is voor een 100 ng/mL standaard gebruik van een 10 µL spike volume. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq7.jpg"> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq8.jpg">
</li>
	<li>Verwijder de buizen met de microdissected weefsels uit opslag-80 ° C en laat tot kamertemperatuur voor 5 minuten.</li>
	<li>10 µL van 1:1 acetonitril/water-oplossing en 2 µL van PBS buffer toevoegen aan de buizen met microdissected weefsel.</li>
	<li>Voor standaard curve en kwaliteitscontrole buizen, voegt u 10 µL van stekelige oplossing voor 2 µL van controle Long homogenaat.</li>
	<li>Voeg 50 µL van extractieoplossing aan elke buis.</li>
	<li>Vortex elke buis voor 5 minuten, bewerk ultrasone trillingen ten gedurende 5 minuten en centrifugeer bij 5000 TPM gedurende 5 minuten tot het vormen van een pellet van film en weefsel in elke buis.</li>
	<li>Breng 50 µL van bovendrijvende substantie over een diep-well 96-wells-plaat en Verdun met een extra 50 µL van gedeïoniseerd water in elk putje.</li>
	<li>LC/MS/MS analyses met behulp van geoptimaliseerde instrument parameters voor Ethambutol en Ethambutol-d10 interne standaard (zoals eerder beschreven in detail12) uit te voeren.</li>
	<li>Gebruik een verdunningsfactor om te corrigeren voor het exacte bedrag van weefsel ontleed voor elk monster. <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq9.jpg">
</li>
</ol>5. methode validatie
<ol><li>Maak een homogenaat in longweefsel controle door het combineren van 1 deel Long, 2 delen PBS en 3-4 stalen kralen. Beat longweefsel en PBS buffer voor 5 minuten van 1750 toeren per minuut met behulp van een kraal homogenizer.</li>
	<li>Spike de homogenaat door toevoeging van 10 µL van 1 mg/mL Ethambutol DMSO voorraad in 990 µL homogenaat maken een eindconcentratie van 10.000 ng/mL (10 mg/mL) en vortex gedurende 1 minuut.</li>
	<li>Maak een bevroren homogenaat blok door het homogenaat gieten in een cryomold en snel bevriezen op droog ijs gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Bereiden van 25 µm dik secties van het homogenaat blok zoals beschreven in stappen 2.1-2.5.</li>
	<li>Het doelgebied van de weefsel zoalsgespecificeerd in stappen 3.2-3.10 ontleden.</li>
	<li>10 µL 1:1 acetonitril/water en 2 µL van PBS buffer toevoegen aan de buizen met microdissected weefsel.</li>
	<li>Voeg 50 µL van extractieoplossing aan elke buis. Stappen 4.9-4.12 maakt een standaard curve te bepalen van de concentratie van de drug in het weefsel homogenaat blok.</li>
	<li>Bereken de extractie-efficiëntie met behulp van de onderstaande formule: <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq10.jpg">
</li>
</ol>

<ol><li>Dartois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+path+of+anti-tuberculosis+drugs%3A+From+blood+to+lesions+to+mycobacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The path of anti-tuberculosis drugs: From blood to lesions to mycobacterial cells.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).</li>
<li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+between+sterilizing+activity+and+drug+distribution+into+tuberculosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions.</a> Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).</li>
<li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li>
<li>Roscioli, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desorption+electrospray+ionization+%28DESI%29+with+atmospheric+pressure+ion+mobility+spectrometry+for+drug+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Desorption electrospray ionization (DESI) with atmospheric pressure ion mobility spectrometry for drug detection.</a> Analyst. 139 (7), 1740-1750 (2014).</li>
<li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+of+levofloxacin+distribution+in+TB-infected+pulmonary+lesions+by+MALDI-MSI+and+continuous+liquid+microjunction+surface+sampling%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging of levofloxacin distribution in TB-infected pulmonary lesions by MALDI-MSI and continuous liquid microjunction surface sampling.</a> Int J Mass Spectrom. 377, 699-708 (2015).</li>
<li>Griffiths, R. L., Randall, E. C., Race, A. M., Bunch, J., Cooper, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raster-mode+continuous-flow+liquid+microjunction+mass+spectrometry+imaging+of+proteins+in+thin+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Raster-mode continuous-flow liquid microjunction mass spectrometry imaging of proteins in thin tissue sections.</a> Anal Chem. 89 (11), 5683-5687 (2017).</li>
<li>Prideaux, B., Stoeckli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+for+drug+distribution+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging for drug distribution studies.</a> J Proteomics. 75 (16), 4999-5013 (2012).</li>
<li>Dilillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging%2C+laser+capture+microdissection%2C+and+LC-MS%2FMS+of+the+same+tissue+section%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging, laser capture microdissection, and LC-MS/MS of the same tissue section.</a> J Proteome Res. 16 (8), 2993-3001 (2017).</li>
<li>Xu, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+laser+capture+microdissection+and+proteomics%3A+methodologies+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">Combining laser capture microdissection and proteomics: methodologies and clinical applications.</a> Proteomics Clin Appl. 4 (2), 116-123 (2010).</li>
<li>Cahill, J. F., Kertesz, V., Van Berkel, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+dissection+sampling+modes+for+direct+mass+spectral+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Laser dissection sampling modes for direct mass spectral analysis.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 30 (5), 611-619 (2016).</li>
<li>Subbian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+pulmonary+cavitary+tuberculosis+in+rabbits%3A+A+failed+host+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: A failed host immune response.</a> Open Biol. 1 (4), 110016(2011).</li>
<li>Zimmerman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethambutol+partitioning+in+tuberculous+pulmonary+lesions+explains+its+clinical+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Ethambutol partitioning in tuberculous pulmonary lesions explains its clinical efficacy.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (9), (2017).</li>
<li>Kempker, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavitary+penetration+of+levofloxacin+among+patients+with+multidrug-resistant+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Cavitary penetration of levofloxacin among patients with multidrug-resistant tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59 (6), 3149-3155 (2015).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+drug+penetration+of+echinocandin+antifungals+at+the+site+of+infection+in+an+intra-abdominal+abscess+model%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Unraveling drug penetration of echinocandin antifungals at the site of infection in an intra-abdominal abscess model.</a> Antimicrob Agents Chemother. , (2017).</li>
<li>Pascal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+modeling+identifies+drug-uptake+history+as+predictor+of+tumor+drug+resistance+and+nano-carrier-mediated+response%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Mechanistic modeling identifies drug-uptake history as predictor of tumor drug resistance and nano-carrier-mediated response.</a> ACS Nano. 7 (12), 11174-11182 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Ruimtelijk-resolved kwantificering van drugs in de pulmonaire TB laesies is vereist om te bepalen of blootstelling van de drug bereikt steriliserende concentraties aan bacteriële bevolking woonachtig binnen de verschillende laesie compartimenten. De hier beschreven methode van LCM-LC/MS kunt absolute kwantificering van anti-TB geneesmiddelen binnen alle compartimenten van de laesie, met inbegrip van de bacteriën-rijke caseum, met behulp van slechts 1-3 weefselsecties in totaal. Traditionele weefsel homogenisering en LC/M...

De mogelijkheid voor ruimtelijk oplossen en kwantificeren van de niveaus van de drug is een cruciale eis om te bepalen of anti-tuberculose medicijnen bacteriële subpopulaties binnen pulmonaire laesies bereiken bij het steriliseren van concentraties1. Van bijzonder belang is het bepalen van drug penetratie in de necrotische kern van de laesie (ook wel caseum genoemd), die meestal bevat het hoogste aantal bacillen en kan slecht toegankelijk voor drugs te wijten aan de afwezigheid van vascularisatie.
Traditionele methodes om te beoordelen van de penetratie van de laesie, waarbij de homogenisering van de verwijderde pulmonaire laesies gevolgd door oplosmiddelen extractie en vloeistofchromatografie massaspectrometrie (LC/MS) analyse, zijn zeer gevoelige en selectieve voor de drugs belang. Echter, deze methoden bieden slechte ruimtelijke informatie, beperkt tot de grootte van het oorspronkelijke gehomogeniseerde weefsel. Massa spectrometrie gebaseerde imaging benaderingen, zoals laser matrix-bijgewoonde desorptie ionisatie (MALDI)2,3, desorptie electrospray ionisatie (DESI)4 of vloeistof-enhanced oppervlakte extractie5, 6 zeer ruimtelijk-resolved beeldvormende mogelijkheden bieden, maar directe kwantificering kan zeer uitdagend of onmogelijk toe te schrijven aan de heterogene ion onderdrukking effecten en verschillende extractie-efficiëntie van de analyt uit de verschillende cel of weefsel bestandstypen7. Bovendien zijn de meest directe weefsel MS imaging benaderingen inherent minder gevoelig dan LC/MS als gevolg van het ontbreken van de gaschromatografische scheiding van endogene soorten concurreren voor ionisatie en de lagere solvent extractie-efficiëntie van de drug van weefsel.
Laser vangt microdissection (LCM) gecombineerd met LC/MS analyse is routinematig toegepast om te isoleren en karakteriseren van weefsel van de onderscheiden regio's voor proteomic8,9 bestudeert en onlangs gebruikt voor de kwantificering van de drug in gedoseerd dierlijk weefsel10. Hier presenteren we een geoptimaliseerde protocol LCM gecombineerd met LC/MS (LCM-LC/MS) analyse om te kwantificeren van anti-TB geneesmiddelen binnen verschillende granuloma compartimenten toe te passen. In het opnameproces microdissection laser, is een UV-laser gericht door de doelstelling van de Microscoop op het gedeelte van het weefsel, dat snijdt en isoleert het gewenste weefsel gebied door het volgen van een pad dat is gedefinieerd door de gebruiker. Voor zwaartepunt-bijgewoonde LCM (de techniek die gebruikt wordt voor dit onderzoek), de weefselsectie is gemonteerd op een dunne polymeer membraan dia (PET of PEN) en het weefsel wordt vastgelegd in een collectie buis cap gevestigd onder de dia. De drugs worden geëxtraheerd uit het verwijderde weefsel en gekwantificeerd aan de hand van standaard LC/MS benaderingen. De hoeveelheid weefsel vereist te verzamelen wordt uiteindelijk bepaald door de verwachte concentratie van de drug in het weefsel aanwezig en de gevoeligheid van de LC/MS methode. Voor de meeste analyses van drugs gedoseerd therapeutische niveau en geanalyseerd met behulp van een massaspectrometer routine triple vierpolige, 3 miljoen µm2 (3 mm2) weefsel van het is oppervlak voldoende.
Dit protocol beschrijft een krachtige combinatie van ruimtelijke profilering en volledige kwantificering aangeboden door LCM-LC/MS, absolute drug concentraties binnen alle compartimenten van TB granulomas verstrekken. De techniek kan ook worden toegepast op het bepalen van de concentraties van de drug in vele verschillende zieke weefsels en vitale drug ontdekking en ontwikkeling voorlichting.

<table><tbody><tr><td>New Zealand White konijnen</td><td>Covance</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HN878 Mycobacterium tuberculosis</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13647</td><td></td></tr><tr><td>Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anased (Xylazine) 100 mg/mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbital natrium en fenytoïne natrium) Oplossing</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile (LC-MS kwaliteit)</td><td>Fisher</td><td>A955-212</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (LC-MS kwaliteit)</td><td>Fisher</td><td>A456-212</td><td></td></tr><tr><td>Formic Zuur (LC-MS kwaliteit)</td><td>Fisher</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>Water (LC-MS kwaliteit)</td><td>Fisher</td><td>W6212</td><td></td></tr><tr><td>0,2 mL flat-cap PCR buisjes</td><td>Corning</td><td>07-200-392</td><td></td></tr><tr><td>Stalen frames, PET-membraan</td><td>Leica</td><td>11505151</td><td></td></tr><tr><td>Premium Frosted Microscoopglaasjes</td><td>Fisher</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>96 Deep well plate 2.0ML PP RB</td><td>Fisher</td><td>NC0363259</td><td></td></tr><tr><td>Zorbax SB-C8 kolom (4,6 bij 50 mm; deeltjesgrootte, 3,5 &micro;m)</td><td>Agilent</td><td>820631-001D</td><td></td></tr><tr><td>"Zipper" Seal Sample Bags</td><td>Fisher</td><td>01-816-1B</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM1850 cryostat</td><td>Leica</td><td>Niet meer verkrijgbaar</td><td>Leica CM1860 is het huidige model</td></tr><tr><td>Laser Microdissection System 6500</td><td>Leica</td><td>Niet meer verkrijgbaar</td><td>Leica LMD 6 is het huidige model</td></tr><tr><td>Agilent 1260 Infinity II HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>API 4000 QTRAP Massaspectrometer</td><td>Sciex</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ruimtelijke kwantificering van drugs in longtuberculose laesies door laser vangen microdissection vloeistof chromatografie massaspectrometrie (lcm-lc/ms)

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Tuberculose is nog steeds een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. Verbeteringen aan bestaande drug regimes en de ontwikkeling van nieuwe therapeutics zijn dringend noodzakelijk. De mogelijkheid van gedoseerd TB drugs te bereiken en steriliseren van bacteriën binnen de slecht-gevacuoliseerd necrotische regio's (caseum) van pulmonaire granulomen is cruciaal voor succesvolle therapeutische interventie. Effectieve therapeutische regimes moeten daarom drugs met gunstige caseum penetratie eigenschappen bevatten. Huidige LC/MS-methoden voor het kwantificeren van de drug niveaus in biologische weefsels hebben beperkte spatiële resolutie mogelijkheden, waardoor het moeilijk te bepalen nauwkeurig absolute drug concentraties binnen kleine weefsel compartimenten zoals die gevonden in necrotische granulomas. Hier presenteren we een protocol laser vangt microdissection (LCM) van pathologisch-verschillende weefsel regio's combineren met LC/MS kwantificering. Deze techniek biedt absolute kwantificering van drugs binnen granuloma caseum, omringende cellulaire laesie en afzijdig longweefsel en daarom nauwkeurig bepaalt of bactericide concentraties worden bereikt. Naast tuberculose-onderzoek heeft de techniek vele mogelijke toepassingen voor ruimtelijk-resolved kwantificering van drugs in zieke weefsels.

Een overzicht van de LCM-LC/MS-aanpak is afgebeeld in Figuur 1. Na het steriliseren van het weefsel door gamma-bestraling, plaatsvinden alle opeenvolgende stappen (van weefsel afdelen vanaf) buiten BSL3 voorwaarden. Figuur 2 toont de laesie biopsie secties voor en na weefsel isolatie door de LCM. Necrotisch en cellulaire gebieden van TB letsels kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd en geïsoleerd door visuele inspectie van opt...

Hier beschrijven we een protocol met behulp van laser vangt microdissection LC/MS-analyse wordt gekoppeld aan het ruimtelijk-kwantificeren drug distributies binnen longtuberculose granulomas. De aanpak heeft brede toepasbaarheid te kwantificeren van de drug concentraties in weefsels bij hoge ruimtelijke detail.

Ruimtelijke kwantificering van Drugs in longtuberculose laesies door Laser vangen Microdissection vloeistof chromatografie massaspectrometrie (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Het algemene doel van deze analytische techniek is om het antituberculosemiddel ethambutol in de weefselcompartimenten van de longlesies van tuberculose te kwantificeren om te bepalen of er bacteriedodende geneesmiddelconcentraties worden bereikt. Deze methode kan vragen beantwoorden op het gebied van tuberculose-geneesmiddelontdekking en -ontwikkeling door te bepalen of toegediende geneesmiddelen bacteriële populaties bereiken bij steriliserende concentraties in alle granulomaweefselcompartimenten. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een volledige kwantificering van de geneesmiddelconcentraties mogelijk maakt met hoge ruimtelijke details binnen specifieke weefselstructuren en celpopulaties.Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de stappen voor weefselsnede en -montage moeilijk te leren zijn vanwege de mogelijkheid van weefselbesmetting en de kwetsbare aard van de membraanslides. Begin deze procedure met weefselverzameling zoals beschreven in het tekstprotocol. Om weefselsnede uit te voeren, stelt u eerst de cryostaat in op de gewenste snededemperatuur.Breng de gamma-bestraalde longbiopsie van de opslag op min 80 graden Celsius over naar de cryostaat en laat deze 30 minuten staan om de weefseltemperatuur te laten gelijkschakelen. Bevestig de biopsie met behulp van pincetten aan de cryostaat-klem met behulp van een kleine hoeveelheid optimaal snijtemperatuur-kleefmiddel om de basis van het weefsel aan de klem te hechten. Orienteer het weefsel zodat het platte oppervlak het blootgestelde oppervlak voor snijden is.Zorg ervoor dat de OCT het weefseloppervlak niet besmet, omdat dit de daaropvolgende massaspectrometrieanalyse kan verstoren. Snijd drie weefselsecties met een dikte van 25 micrometer en monteer ze op PET-membraanslides. Raak de membraan voorzichtig aan met het weefselsectie en verwijder de sectie.Als er te veel druk wordt uitgeoefend, kan de dunne membraan scheuren. Vermijd overmatig hanteren van de slide voor montage om geen PET-membraan op te laden en de hechting van het weefselsectie te verminderen. Bewaar de membraanslide op kamertemperatuur om het op smelten en succesvolle hechting van het weefsel aan het membraan mogelijk te maken.Verwijder de slide uit de cryostaat en laat de slide drie minuten aan de lucht drogen. Als LCM-LC-MS/MS niet onmiddellijk zal worden uitgevoerd, verzegel de slide in een kleine luchtdichte verzegelbare zak en breng deze over naar de opslag op min 80 graden Celsius totdat deze vereist is voor dissectie. Snijd een aangrenzende sectie van 10 tot 12 micrometer en smeltmontage op een standaard glazen slide voor hematoxylinen en eosinkleuring.Op dit moment kunnen aanvullende secties worden gesneden voor andere gewenste histochemische kleurstoffen. Verwijder de verzegelde zak met de slide uit de opslag op min 80 graden Celsius en laat deze vijf minuten op kamertemperatuur komen. Als de koude slide onmiddellijk wordt blootgesteld aan de laboratoriumatmosfeer, zal het weefsel bedekt raken met condensatie en kan de ruimtelijke integriteit van het geneesmiddel worden aangetast.Schakel de microscoop en laser in. De laser heeft vijf tot tien minuten nodig om op te warmen voordat het snijden kan beginnen. Laad vlakkap 0,20 milliliter PCR-buisjes in de houder.Nadat de slide uit de zak is verwijderd, neemt u een optisch beeld van de weefselsectie op de PET-slide met behulp van een flatbedscanner. Plaats de slide in de slidehouder, met de weefselzijde naar beneden. Wijs afzonderlijke verzamelbuisjes toe aan specifieke granuloma-regio's van belang met behulp van de microscoopsoftware.Deze zullen meestal niet-betrokken long, cellulair granuloma en caseum zijn, maar kunnen variëren afhankelijk van de specifieke pathologie van de granulomabiopsie. Richt de weefsels op met behulp van het 5X microscoopobjectief. Deze vergroting moet een goed overzicht geven van het weefsel met zowel cellulaire als necrotische granuloma-gebieden.Selecteer in de software het buisje dat is aangegeven als caseum om het onder het weefsel te brengen. Voer de gewenste dissectieparameters in. Typische instellingen voor een longsectie van 25 micron dik zijn laservermogen 30, snelheid 15 en diafragma 35.Deze zullen echter verschillen afhankelijk van de gebruikte microscoop en potentieel afnemend vermogen vanwege de leeftijd van de laser. Selecteer de Free Draw-tool en omlijn met behulp van een muis of touchscreen-pen het gewenste gebied voor dissectie. De oppervlakte van het gebied wordt weergegeven in de software.Houd geselecteerde regio's onder 500.000 vierkante micrometer om gemakkelijker dissectie mogelijk te maken. Herhaal de dissectie tot er in totaal drie miljoen vierkante micrometer in de buisjeskap is verzameld. Soms kan het gedissecteerde gebied aan de omringende membraan blijven plakken en niet in de verzamelkap vallen.Verwijder deze regio's van de cumulatieve oppervlaktetotaal door ze handmatig te selecteren en te verwijderen in de software. Selecteer vervolgens de kap voor cellulair letsel en verzamel drie miljoen vierkante micrometer weefsel met behulp van hetzelfde proces. Selecteer de kap voor niet-betrokken long en verzamel drie miljoen vierkante micrometer weefsel met behulp van hetzelfde proces.Let erop dat niet-betrokken longweefsel veel bronchiolen en longblaasjes bevat. Besteed zorgvuldige aandacht aan het uitsluiten van deze uit de gedefinieerde weefselregio's voor dissectie. Verwijder de buisjeshouder en ontgrendel, verzegel en label elke buis voorzichtig.Bescherm de gedissekteerde weefsels tegen verstoringen door omringende lucht. Analyseer de gedissekteerde weefsels onmiddellijk of bewaar ze op min 80 graden Celsius en smelt ze voorafgaand aan verwerking en LC/MS-analyse. Ga uit van een weefseldichtheid van één gram per milliliter en bereid de homogenaatvoorraad voor door 50 milligram controleweefsel te wegen en PBS-buffer toe te voegen om te verdunnen.Homogeniseer het weefsel door het longweefsel en PBS-buffer gedurende vijf minuten met 1750 omwente

spatial-quantification-drugs-pulmonary-tuberculosis-lesions-laser

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Laser ablatie electrospray ionisatie (LAESI) is een atmosferische druk ionenbron voor massaspectrometrie. In de beeldvorming modus, een mid-infrarood laser peilt naar de verdeling van moleculen over een tissue sectie of een biofilm. Deze techniek biedt een nieuwe aanpak voor de diverse bio-analytische studies onder autochtone experimentele omstandigheden uitgevoerd.

Atmosferische druk moleculaire beeldvorming van biologische weefsels en biofilms door LAESI massaspectrometrie

Laser-induced afbraak spectroscopie uitgevoerd op dunne orgaan-en tumorweefsel met succes natuurlijke elementen en kunstmatig geïnjecteerd gadolinium (Gd), die met ingang van Gd-gebaseerde nanodeeltjes aangetroffen. Afbeeldingen van chemische elementen bereikt een resolutie van 100 micrometer en kwantitatieve sub-mm gevoeligheid. De verenigbaarheid van de setup met standaard optische microscopie benadrukt het potentieel om meerdere beelden van een zelfde biologisch weefsel te bieden.

Laser-induced Breakdown Spectroscopy: Een nieuwe aanpak voor de nanodeeltjes&#39;s Mapping en kwantificering in orgaanweefsel

Microdissectie is uitgebreid toegepast voor de behandeling van DNA, RNA en eiwitten in weefsel. Laser capture microscopie (LCM) is de meest gebruikte methode, maar een nieuwe frees-techniek, mesodissection, is sinds kort beschikbaar. We tonen RNA extractie uit mesodissected formaline gefixeerd paraffine-ingebed weefsel slides van Mycobacterium tuberculosis granulomen.

A Novel Microdissection aanpak voor het herstellen<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Specifieke Afschriften van formaline gefixeerde in paraffine ingebedde Lung Granulomen

Hier beschrijven we een hoogwaardige vloeistofchromatografie-gekoppelde massaspectrometrie (HPLC-MS/MS) test om het immunosuppressivum tacrolimus in gedroogde bloedvlekken te kwantificeren met behulp van een eenvoudige handmatige eiwitprecipitatiestap en online kolomextractie.

Kwantificering van de Immunosuppressieve tacrolimus op opgedroogd bloed Spots Met behulp van LC-MS / MS

Tuberculose-infectie bij de mens is een complex proces, dat moeilijk te modelleren is in vitro. Hier beschrijven we een nieuw 3D-model van menselijk longweefsel dat de dynamische processen nabootst die tijdens infectie optreden, inclusief de migratie van immuuncellen en vroege granuloomvorming in een fysiologische omgeving.

Een 3D Human longweefsel Model voor functionele studies op<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infectie

Hier beschrijven we een werkwijze snel evenwicht dialyse (RED) drug binding aan ca- seum longtuberculose laesies en holtes meten. Het protocol wordt ook gebruikt met een schuimige-macrofaag afgeleide matrix met een effectieve surrogaat voor ca- seum.

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseum Binding Assay die de penetratie van drugs in tuberculose-lesingen voorspelt

Dit protocol presenteert een geïntegreerde Ramanspectroscopie-massaspectrometrie (MS) platform dat is geschikt voor het bereiken van één-cel resolutie. Raman-spectroscopie kan worden gebruikt om cellulaire reactie op drugs te bestuderen, terwijl MS kan worden gebruikt voor gerichte en kwantitatieve analyse van de opname van geneesmiddelen en metabolisme.

Een geïntegreerde Raman-spectroscopie en massaspectrometrie platform voor het bestuderen van de opname van één cel drug, metabolisme, en effecten

De huidige methoden voor het analyseren van de therapietrouw van patiënten aan complexe resistente tuberculose (DR-TB) regimes kunnen onjuist en resource-intensief zijn. Onze methode analyseert haar, een gemakkelijk verzamelde en opgeslagen matrix, voor concentraties van 11 DR-TB medicijnen. Met behulp van LC-MS / MS, kunnen we bepalen sub-nanogram drug niveaus die kunnen worden gebruikt om beter te begrijpen drug therapietrouw.

Gevalideerd LC-MS/MS Panel voor het kwantificeren van 11 resistente tb-medicijnen in small hair samples

Er wordt een protocol gepresenteerd om het totale lipidegehalte van de celwand van een breed scala aan mycobacteriën te extraheren. Bovendien worden extractie- en analyseprotocollen van de verschillende soorten mycolzuren getoond. Een dunne-laag chromatografisch protocol om deze mycobacteriële verbindingen te controleren is ook aanwezig.

Analyse van de lipidesamenstelling van mycobacteriën door dunnelaagchromatografie

Dit protocol beschrijft de stappen om een 3D-model van metabolietverdeling tijdens trypanosomatide-infectie te genereren, inclusief monsterverzameling, metabolietextractie, een overzicht van vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometriegegevensverzameling, 3D-modelgeneratie en ten slotte gegevensvisualisatie.

Chemische cartografie benaderingen om trypanosomatide infectie te bestuderen

Dit protocol beschrijft een high-throughput workflow voor kunstmatige intelligentie-gedreven segmentatie van pathologie-bevestigde gebieden van belang van gekleurde, dunne weefselsectiebeelden voor verrijking van histologie-opgeloste celpopulaties met behulp van lasermicrodissectie. Deze strategie omvat een nieuw algoritme dat de overdracht van afbakeningen die interessante celpopulaties aangeven, rechtstreeks naar lasermicroscopen mogelijk maakt.

Geïndustrialiseerde, kunstmatige intelligentie-geleide lasermicrodissectie voor proteomische analyse op microschaal van de tumormicro-omgeving

Leer hoe u ethambutol kunt kwantificeren in tuberculose longlaesies met laser capture microdissectie en LC/MS. Deze methode biedt hoge ruimtelijke resolutie voor het meten van drugconcentraties in specifieke weefselcompartimenten.

Ruimtelijke kwantificering van Drugs in longtuberculose laesies door Laser vangen Microdissection vloeistof chromatografie massaspectrometrie (LCM-LC/MS) (Video) | JoVE Journal

Ruimtelijke kwantificering van Drugs in longtuberculose laesies door Laser vangen Microdissection vloeistof chromatografie massaspectrometrie (LCM-LC/MS)

Meer video's verkennen