Name: Geheel-mount confocale microscopie voor volwassen oor huid: een modelsysteem om te studeren, Neuro-vasculaire vertakkende genuitdrukking en immuun cel distributie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Verken geheel-mount confocale microscopie om neuro-vasculaire vertakking en immuuncelverdeling in volwassen muizenoorhuid te visualiseren. Deze methode biedt inzicht in driedimensionale weefselarchitectuur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken K. Gill voor het Laboratoriumbeheer en technische ondersteuning, J. Hawkins en het personeel van National Institutes of Health (NIH) gebouw 50 dier faciliteit voor de hulp bij de zorg van de muis, en R. Reed en F. Baldrey voor administratieve bijstand. Ook dank aan S. Motegi en M. Udey voor het delen van hun oor huid dissectie protocol, N. Burns voor redactionele hulp, en de leden van het laboratorium van de cel van de stam en Neuro-vasculaire biologie voor technische hulp en nadenkende bespreking. T. Yamazaki werd gesteund door de Japan-maatschappij voor de promotie van wetenschap (JSPS) NIH-KAITOKU. Dit werk werd gesteund door de intramurale programma van het onderzoek van de National Heart, Lung en bloed Instituut (HL005702-11 tot en met Y.M.)

Alle experimenten in deze sectie werden uitgevoerd onder goedkeuring van de National Heart, Lung, Blood Institute (NHLBI) Animal Care en gebruik Comité.
1. de volwassen muis oor huid collectie
<ol><li>Volwassen muizen door kooldioxide (CO2) blootstelling in een gesloten kamer euthanaseren en bevestig de euthanasie door cervicale dislocatie. Opmerking: Het experiment volgt de National Institutes of Health (NIH) richtsnoer voor de methode van de euthanasie.</li>
	<li>Ontleden van het oor van de base en plaats deze in een 35 x 10 mm2 petrischaal met 2 mL van Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS). Kort knippen haren met een schaar.</li>
	<li>Schil de posterieure huid en anterior huid weg zorgvuldig van de tussenliggende kraakbeen. Opmerking: Kraakbeen hecht aan de voorste huid.</li>
	<li>Breng de posterior en anterior huid afzonderlijk tot en met een goed 24 plaat met 1 mL van de ijskoude verse 4% paraformaldehyde (PFA) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) per putje. Afvlakken van de posterieure en anterieure huid in de 4% PFA.</li>
	<li>Fix het posterieure en anterieure huid met kraakbeen bij 4 ° C gedurende 1 uur.</li>
	<li>Wassen van de huid van het posterieure en anterieure 3 keer gedurende 5 minuten in 1 mL PBS met zacht mengen op een mixer bij kamertemperatuur.</li>
	<li>De posterieure en anterieure huid met kraakbeen aan de onderkant van een 35 x 10 mm2 petrischaal overdragen. Afgesneden de basis regio, die is gevouwen en heeft adipeus en bindweefsel. Het kraakbeen van anterior huid met behulp van fijn gebogen pincet afschilferen.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de haren, vetweefsel en bindweefsel vanaf de binnenkant van de posterieure huid met behulp van fijn gebogen pincet. Houd de huid nat met PBS.</li>
</ol>2. geheel-mount immunohistochemische kleuring van muis oor huid
Opmerking: Alle experimenten in de volgende gedeelten werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de veiligheid van het laboratorium van NIH.
<ol><li>De buffer met blokkerend voor te bereiden. Filter 10% warmte geïnactiveerd geit serum (HIGS) verdund in PBS met 0,2% triton blokkeerbuffer X-100 (TX-100) of 10% ezel serum (DS) verdund in PBS met 0,2% TX-100 blokkeerbuffer, met behulp van een 0,45 µm filter eenheid.</li>
	<li>Breng de posterior en anterior huid tot een 24 goed plaat met 1 mL 10% HIGS blokkeerbuffer of 10% DS blokkeerbuffer per putje. Incubeer de huid voor 30 min met zacht mengen op een mixer bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Bereid de primair antilichaam-oplossing door het verdunnen van de primaire antilichamen (Tabel van materialen) in blokkeerbuffer (ofwel 10% HIGS of 10% DS). Opmerking: Geheel-mout immunohistochemische analyse van volwassen oor huid met antilichamen tegen pan-neuronale marker neuron-specifieke klasse III β-tubuline (Tuj1, konijn polyklonale IgG of muis monocloncal IgG2a, 1:500 verdunning op de uiteindelijke concentratie van 2 µg/mL), pan-endothelial cel marker bloedplaatjes endothelial cel adhesie molecuul 1 (PECAM-1, hamster monoclonal IgG, 1:300 verdunning op de uiteindelijke concentratie van 3.3 µg/mL), myelineschede marker myeline fundamentele eiwit (MBP, konijn polyklonale IgG, 1:200 verdunning in de eindconcentratie van 5 µg/mL) en inflammatoire myeloïde cel marker CD11b (Rat monoclonal IgG2b, 1:50 verdunning op de uiteindelijke concentratie van 20 µg/mL) was te zien in Figuur 1 en Figuur 2. De huid was geïncubeerd met Cy3-geconjugeerde antilichaam voor vasculaire glad spierweefsel cel marker α glad spierweefsel actine (αSMA) samen met secundaire antilichamen (2.6). De primaire antilichamen getest door onszelf werden vermeld in de Tabel van materialen. Meerdere primaire antilichamen afgeleid van verschillende species kunnen gelijktijdig worden gemengd.</li>
	<li>De posterieure en anterieure huid overdragen aan nieuwe putje met 150 µL van de primaire antilichamen oplossing. Incubeer de huid met zacht mengen op een mixer bij 4 ° C's nachts.</li>
	<li>De volgende dag, het posterieure en anterieure huid overbrengen naar nieuwe putten in de 24 goed plaat of gecombineerd de buffer met blokkerend met primaire antilichamen. Voeg 1 mL ofwel 2% HIGS verdund in PBS met 0,2% TX-100 wassen buffer of 2% DS verdund in PBS met 0,2% TX-100 wassen buffer. Wassen van de huid met 3 veranderingen van de buffer wassen elke 15 min met zacht mengen op een mixer bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Bereid de oplossing van secundair antilichaam (Tabel van materialen). Verdun secundaire antilichamen in de blokkeerbuffer (ofwel 10% HIGS of 10% DS) en filter de buffer met blokkerend met secundaire antilichamen door een 0,22 µm Polyvinylideenfluoride (PVDF) difluoride spuit membraanfilter met een spuit van 1 mL verbonden. Opmerking: Alexa 488 of anti-konijn geit 633-geconjugeerde IgG (H + L) of IgG2a voor Tuj1, Alexa 647-geconjugeerde geit anti-hamster IgG (H + L) voor PECAM-1, Alexa 488-geconjugeerde geit anti-konijn IgG (H + L) voor MBP, muis en rat Alexa 594-geconjugeerde IgG (H + L) voor CD11b werden gebruikt met de verdunning van het 1:250 op de uiteindelijke concentratie van 8 µg/mL. De huid was geïncubeerd met αSMA Cy3-geconjugeerde antilichaam (1:500 verdunning op de uiteindelijke concentratie van 2-3 µg/mL) in combinatie met deze secundaire antilichamen.</li>
	<li>De oplossing bij 13.000 x g gedurende 10 minuten geaggregeerde om deeltjes te verwijderen van de secundaire antilichamen van de buffer met blokkerend centrifugeren. Opmerking: Verschillende TL geconjugeerd secundaire antilichamen afgeleid van verschillende species kunnen gelijktijdig worden gemengd.</li>
	<li>Overbrengen in de huid van posterieure en anterieure putje met 150 µL van de secundaire antilichamen oplossing. De 24 goed plaat wikkel in aluminiumfolie te voorkomen licht en de huid voor 1 h met zacht mengen op een mixer bij kamertemperatuur incuberen.</li>
	<li>Overdracht van de posterieure en anterieure huid aan nieuwe putjes in de 24 goed plaat of gecombineerd de secundair antilichaam oplossing door Pipetteer volledig. Voeg 1 mL 2% HIGS wassen buffer of 2% DS wassen buffer.</li>
	<li>De 24 goed plaat wikkel in aluminiumfolie en wassen met 3 wijzigingen van de buffer wassen elke 15 min met zacht mengen op een mixer bij kamertemperatuur.</li>
</ol>3. montage van de oor-huid op dia
<ol><li>Plaats de huid aan de onderkant van een 35 x 10 mm2 petrischaal. Verwijder voorzichtig de haren, vetweefsel, bindweefsels, stof en vezels uit de binnenkant van de huid met behulp van fijn gebogen pincet onder de stereomicroscoop met lage verlichting om te minimaliseren uitgebreide foto bleken. Houd de huid nat met PBS.</li>
	<li>De huid overbrengen in een zelfklevende microscoopglaasje met pincet. Plaats van de achterste en voorste huid met de binnenkant naar boven op de dia. Het afvlakken van de huid met behulp van de verlostang.</li>
	<li>Monteer de huid in een vloeibare anti-fade montage medium te voorkomen photobleaching en fluorescerende signalen behouden. Zorg ervoor dat geen luchtbellen op of rond de huid.</li>
	<li>Bedek met dekglaasje aan op de huid monsters zorgvuldig en opslaan van de gemonteerde huid voorbeelddia's in het donker 's nachts bij kamertemperatuur zodat de montage media krijgen vast. Zegel van het dekglaasje aan naar de dia met nagellak en het bewaren bij 4 ° C voor langdurige opslag.</li>
</ol>4. confocale microscopie
<ol><li>Passende lasers voor fluorophores instellen. Een confocal microscoop met drie laser bronnen (Argon 488 nm, DPSS 561 nm en HeNe 633 nm) wordt gebruikt in dit experiment.</li>
	<li>Gebruik de sequentiële scan-hulpprogramma, waarmee gelijktijdig triple gebeitste monsters prikkelt, overlappingen te vermijden. Opmerking: Afbeeldingen zullen worden genomen in een sequentiële wijze met behulp van de sequentiële scan-modus.</li>
	<li>Afbeelding onder een 10 X doelstelling. De tegel scan tool gebruiken om vast te leggen van de hele oor huid. Z-stack instellen en ervoor te zorgen dat de z-positie heeft betrekking op de gehele dikte van de huid van het oor.</li>
</ol>

<ol><li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+confocal+microscopy+for+vascular+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).</li>
<li>Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+immunohistochemical+analysis+for+embryonic+limb+skin+vasculature%3A+a+model+system+to+study+vascular+branching+morphogenesis+in+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Yamazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Myeloid+Progenitors+Differentiate+into+Pericytes+through+TGF-beta+Signaling+in+Developing+Skin+Vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature.</a> Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).</li>
<li>Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel-dependent+recruitment+of+sympathetic+axons%3A+looking+for+innervation+in+all+the+right+places%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Vessel-dependent recruitment of sympathetic axons: looking for innervation in all the right places.</a> J Clin Invest. 124, 2855-2857 (2014).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve-derived+CXCL12+and+VEGF-A+regulate+the+patterning+of+arterial+vessel+branching+in+developing+limb+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin.</a> Dev Cell. 24, 359-371 (2013).</li>
<li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> J Vis Exp. , e51749(2014).</li>
<li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+Whole+Mount%3A+A+Novel+Processing+and+Imaging+Protocol+for+Thick%2C+Three-dimensional+Tissue+Cross-sections+of+Skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin.</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>Liakath-Ali, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+skin+phenotypes+revealed+by+a+genome-wide+mouse+reverse+genetic+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Novel skin phenotypes revealed by a genome-wide mouse reverse genetic screen.</a> Nat Commun. 5, 3540(2014).</li>
<li>Gunawan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methyltransferase+Ezh2+controls+cell+adhesion+and+migration+through+direct+methylation+of+the+extranuclear+regulatory+protein+talin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin.</a> Nat Immunol. 16, 505-516 (2015).</li>
<li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+skin+disease+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Dis%22%5BJournal%5D)">Animal models of skin disease for drug discovery.</a> Expert Opin Drug Dis. 8, 331-355 (2013).</li>
<li>Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+atopic+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Animal models of atopic dermatitis.</a> J Invest Dermatol. 129, 31-40 (2009).</li>
<li>Wagner, E. F., Schonthaler, H. B., Guinea-Viniegra, J., Tschachler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psoriasis%3A+what+we+have+learned+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Psoriasis: what we have learned from mouse models.</a> Nat Rev Rheumatol. 6, 704-714 (2010).</li>
<li>Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+challenges+of+chronic+wounds%3A+searching+for+an+optimal+animal+model+to+recapitulate+their+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity.</a> Dis Model Mech. 7, 1205-1213 (2014).</li>
<li>O'Brien, P. D., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24615439">Mouse models of diabetic neuropathy.</a> ILAR J. 54, 259-272 (2014).</li>
<li>Yamazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Mount+Adult+Ear+Skin+Imaging+Reveals+Defective+Neuro-Vascular++Branching+Morphogenesis+in+Obese+and+Type+2+Diabetic+Mouse+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Whole-Mount Adult Ear Skin Imaging Reveals Defective Neuro-Vascular Branching Morphogenesis in Obese and Type 2 Diabetic Mouse Models.</a> Sci Rep. 8, (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol beschrijft de geheel-mount immunonohistochemical beeldvorming van volwassen oor huid voor de analyse van de neuro-vasculaire structuren en immuun cel distributie. Wij geloven dat deze methode heeft tal van voordelen voor onderzoekers te bestuderen vertakkende genuitdrukking en de patronen van de perifere zenuwen en bloedvaten, alsmede driedimensionale distributie huid componenten zoals immuuncellen en haar experimentele follikels. De resultaten van de beeldvorming kunnen worden gekwantificeerd aan de hand va...

Huid bestaat uit drie lagen: de epidermis, de dermis en de hypodermis. Het is gebruikt als een modelsysteem om te studeren stamcel onderhoud, differentiatie en voedselproductie in ontwikkeling evenals de regeneratie, tumorvorming en ontstekingen bij volwassenen. Huid is rijkelijk gevacuoliseerd en geïnnerveerd zodanig zijn dat de ontwikkeling van het perifere zenuwstelsel en vasculaire systeem goed gecoördineerd.
Wij hebben eerder aangetoond een geheel-mount embryonale huid beeldvormende techniek met meerdere labelen om te studeren intact perifere zenuwen en bloedvaten, met inbegrip van hun cellulaire componenten1,2,3, 4: sensorische axonen, sympathieke axonen Schwann cellen in zenuwen, endotheliale cellen, pericytes en vasculaire zachte spiercellen (VSMCs) in de bloedvaten. Tijdens de angiogenese, een primaire capillaire netwerk ondergaat intensieve vasculaire remodeling en ontwikkelt zich tot een hiërarchisch vasculaire vertakkende netwerk. In de ontwikkelingslanden dermis/hypodermis, slagaders vertakken naast perifere sensoriële zenuwen en aders dan vormen grenzend aan de slagaders. Nadat het hiërarchische vasculaire netwerk grondig met VSMCs bedekt is, sympathische zenuwen uitbreiden langs en innervate grote diameter bloedvaten1,5,6. Ondanks het belang in de nauwe samenwerking tussen de ontwikkelingslanden nerveus en vasculaire systemen, een grote vraag geweest om te pakken wat gebeurt er met de neuro-vasculaire netwerken in diverse pathologische situaties bij volwassenen. Een driedimensionale high-resolution imaging is noodzakelijk om te waarderen de pathogenese, samen met anatomisch herkenbaar vertakkende genuitdrukking en patronen.
Neuronale en vasculaire morfogenese in volwassen muis huid is vaak geanalyseerd door weefsel sectie kleuring. Andere studies hebben geheel-mount beeldvorming van de huid gebruikt voor het visualiseren van de perifere zenuwen en bloedvaten, naast de haarzakjes sebaceous klieren en de arrector pili spieren7,8,9. Echter, de dikte van volwassen huid heeft het moeilijk gemaakt voor het analyseren van de huid over de gehele diepte.
In de huidige studie ontwikkelden we een nieuwe hoge resolutie geheel-mount beeldvorming van volwassen oor huid om deze uitdagingen te overwinnen. Oor huid is gemakkelijk toegankelijk zijn voor dissectie en latere geheel-mount beeldvorming van de huid over de gehele diepte. Dus, het is een eenvoudig en zeer reproduceerbare methode die kan worden toegepast om te vergelijken van driedimensionale architectuur van perifere zenuw- en vasculaire systemen in de huid, met uitgebreide kwantificering metingen. We toonden aan dat de uitlijning van perifere zintuiglijke en sympathische zenuwen met grote diameter bloedvaten bewaard in de volwassen huid gebleven is. Het doel van dit protocol is te visualiseren vertakkende genuitdrukking en de patronen van perifere zenuwen en bloedvaten, evenals de immuun cel distributie op een cellulair niveau in volwassen Muismodellen in verschillende omstandigheden zoals ontsteking en regeneratie weer gecontroleerd.

<table><tbody><tr><td>10 x Phosphate Buffered Saline</td><td>KD Medical</td><td>RGE-3210</td><td>PBS, zonder Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>Hank&rsquo;s Balanced Salt Solution</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>HBSS, met Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>PFA, fixatief, verdund in PBS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>Detergens</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Gibco</td><td>16210064</td><td>Component van blokkerings-/wasbuffer</td></tr><tr><td>Normal donkey serum</td><td>Jackson Immuno research</td><td>017-000-121</td><td>Component van blokkerings-/wasbuffer</td></tr><tr><td>Gebogen fijne pincetten</td><td>Dumont</td><td>RS-5047</td><td></td></tr><tr><td>Gebogen pincetten</td><td>Integra Miltex Vantage</td><td>V918-782, V918-784</td><td></td></tr><tr><td>Filter Unit 0.45 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>157-0045</td><td>Voor filtratie</td></tr><tr><td>1 mL spuit</td><td>Coviden</td><td>8881501400</td><td>Voor filtratie</td></tr><tr><td>Spuitenfilter Unit 0.22 mm</td><td>Millex-GV</td><td>SLGVR04NL</td><td>Voor filtratie</td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36934</td><td>Anti-fade montagemedium</td></tr><tr><td>Nail Polish</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td>Voor afdichting</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Leica</td><td>MZ95</td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CC 2017</td><td>Adobe</td><td></td><td>Grafische editorsoftware</td></tr><tr><td>Illustrator CC 2017</td><td>Adobe</td><td></td><td>Grafische editorsoftware</td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td>Beeldverwerkingssoftware</td></tr><tr><td>Anti-PECAM-1 (CD31) antilichaam</td><td>Millipore</td><td>MAB1398Z</td><td>Hamster IgG, vasculair endotheelcelmarker, 1:300</td></tr><tr><td>Anti-PECAM-1 (CD31) antilichaam</td><td>BD Pharmingen</td><td>553369</td><td>Rat IgG2a kappa, vasculair endotheelcelmarker, 1:300</td></tr><tr><td>Anti-&#945;SMA antilichaam geconjugeerd met cy-3</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>Mouse IgG2a, vasculair soepel spiercelmarker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-EphB1 antilichaam</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9319</td><td>Geast polyclonaal, veneus endotheelcelmarker, 1:100</td></tr><tr><td>Anti-neuron-specifiek Class III &#946;-tubuline (Tuj1)</td><td>Abcam</td><td>AB18207</td><td>Tuj1, konijn polyclonaal IgG, pan-axonaal marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-Tuj1 antilichaam</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>Mouse IgG2a, pan-axonaal marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-MBP antilichaam</td><td>Abcam</td><td>AB40390</td><td>Konijn polyclonaal IgG, myelinisatiemarker, 1:200</td></tr><tr><td>Anti-Tyrosine Hydroxylase antilichaam</td><td>Chemicon</td><td>AB152</td><td>Konijn polyclonaal, sympathisch neuron marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-Peripherin antilichaam</td><td>Chemicon</td><td>AB1530</td><td>Konijn polyclonaal, perifeer neuron marker, 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-CD11b antilichaam</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA74G</td><td>Rat IgG2b, inflammatoire celmarker (macrofagen), 1:50</td></tr><tr><td>Anti-CD45 antilichaam</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0451-85</td><td>Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietische celmarker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-CD3 antilichaam</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1477T</td><td>Rat IgG1, immuuncelmarker, 1:100</td></tr><tr><td>Anti-CD45R (B220) antilichaam</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0452</td><td>Rat IgG2a kappa, inflammatoire celmarker, 1:200</td></tr><tr><td>Anti-GFP antilichaam</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11122</td><td>Konijn polyclonaal, 1:300</td></tr><tr><td>Anti-GFP antilichaam</td><td>Abcam</td><td>Ab13970</td><td>Kip polyclonaal, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-&#946;-gal antilichaam</td><td>Cappel</td><td>55976</td><td>Konijn polyclonaal, 1:5000</td></tr><tr><td>Anti-RFP antilichaam</td><td>Abcam</td><td>Ab62341</td><td>Konijn polyclonaal, 1:300</td></tr><tr><td>Goat anti-konijn IgG (H+L) Alexa 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11034</td><td>Konijn polyclonaal secundair antilichaam, 1:250</td></tr><tr><td>Goat anti-geast IgG (H+L) Alexa 647</td><td>Jackson Immuno research</td><td>127-605-160</td><td>Geast polyclonaal secundair antilichaam, 1:250</td></tr><tr><td>Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594</td><td>Jackson Immuno research</td><td>112-585-167</td><td>Rat polyclonaal secundair antilichaam, 1:250</td></tr><tr><td>Goat anti-muis IgG2a Alexa 633</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21136</td><td>Muis IgG2a secundair antilichaam, 1:250</td></tr></tbody></table>

geheel-mount confocale microscopie voor volwassen oor huid: een modelsysteem om te studeren, neuro-vasculaire vertakkende genuitdrukking en immuun cel distributie

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Hier presenteren we een protocol van de huid van een geheel-mount volwassen oor imaging techniek om te bestuderen van de uitgebreide driedimensionale neuro-vasculaire vertakkende genuitdrukking en patronen, evenals immuun cel distributie op een cellulair niveau. De analyse van perifere zenuwen en bloedvat anatomische structuren in volwassen weefsels biedt sommige inzicht in het begrip van functionele neuro-vasculaire bedrading en neuro-vasculaire degeneratie in pathologische omstandigheden zoals de wondgenezing. Als een zeer informatief modelsysteem, hebben we onze studies gericht op volwassen oor huid, dat gemakkelijk toegankelijk zijn voor dissectie is. Onze eenvoudige en reproduceerbare protocol biedt een nauwkeurige voorstelling van de cellulaire componenten in de gehele huid, zoals de perifere zenuwen (sensorische axonen, sympathieke axonen en cellen van Schwann), bloedvaten (endotheliale cellen en vasculaire zachte spiercellen ), en ontstekingscellen. Wij geloven dat dit protocol zal de weg effenen naar onderzoeken morfologische afwijkingen in het perifere zenuwen en bloedvaten en de ontsteking in de huid van de volwassen oor onder verschillende pathologische condities.

Volwassen muis posterieure oor huid (figuur 1A) en anterior oor huid (figuur 1B) waren immunostained met antilichamen tegen αSMA (rood), Tuj1 (groen), en PECAM-1 (blauw). De huid van de posterieure was immunostained om te studeren van neuro-immuun distributie met behulp van antilichamen tegen CD11b (rood) en MBP (groen), samen met Tuj1 (blauw) (figuur 2A). Distributie van CD11b+ ontsteking...

Hier beschrijven we een hoge resolutie geheel-mount beeldvorming methode in de hele volwassen muis oor huid, waarmee we kunnen visualiseren vertakkende genuitdrukking en patronen van perifere zenuwen en bloedvaten, evenals immuun cel distributie.

Geheel-mount confocale microscopie voor volwassen oor huid: een modelsysteem om te studeren, Neuro-vasculaire vertakkende genuitdrukking en immuun cel distributie

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

Het algemene doel van deze procedure is om vertakkingsmorfogenese en patterning van perifere zenuwen en bloedvaten, evenals immuunceldistributie te visualiseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neurobiologie, vasculaire biologie en immunologie door morfologische afwijkingen in perifere zenuwen en bloedvaten, evenals ontsteking, te verlichten. De belangrijkste sterkte van deze techniek is dat we de cellulaire componenten van perifere zenuwen, bloedvaten en immuuncellen in de huid over de volledige diepte kunnen visualiseren en de driedimensionale architectuur van zenuw- en vasculaire systemen kunnen vergelijken.Deze methode kan inzicht bieden in neuro-vaatstructuren en immuunceldistributie bij juveniele tot volwassen muizen onder normale en pathologische omstandigheden. Na het euthanaseren van volwassen muizen volgens het tekstprotocol, verwijder het oor vanaf de basis en plaats het in een 35-bij-10-millimeter petrischaaltje met twee milliliter HBSS. Gebruik vervolgens een schaar om de haren kort te knippen.Schil voorzichtig de achterste en voorste huid los van het tussenliggende kraakbeen. Breng elk huidstuk afzonderlijk over in

whole-mount-confocal-microscopy-for-adult-ear-skin-model-system-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We introduceren een hele-mount immunohistochemie en laser scanning confocale microscopie met meerdere etikettering voor het analyseren van complexe vasculaire netwerk-vorming in de muis embryonale ledematen huid.

Whole-mount Immunohistochemische Analyse voor Embryonale Limb Skin vaatstelsel: een modelsysteem voor Vasculaire Vertakkingen Morphogenesis in Embryo Study

De extracellulaire matrix ondergaat ingrijpende verbouwing tijdens de wondgenezing, ontsteking en het ontstaan ​​van tumoren. Wij presenteren een nieuwe intravitale immunofluorescentie microscopie benadering van de dynamiek van fibrillaire en mesh-achtige matrix componenten met hoge ruimtelijke en temporele resolutie met behulp van epifluorescentie of twee-foton microscopie visualiseren.

Langdurige Intravitale Immuunfluorescentie beeldvorming van Tissue Matrix Bestanddelen met Epifluorescentie en twee-foton microscopie

Zoogdierhuid bevat een divers scala aan structuren - zoals haarfollikels en zenuwuiteinden - die onderscheidend patronen van ruimtelijke organisatie vertonen. Het analyseren van de huid als een platte berg maakt gebruik van de 2-dimensionale geometrie van dit weefsel tot volledige dikte van hoge-resolutie afbeeldingen van de huid structuren te produceren.

Flat Mount beeldvorming van de huid van muizen en de toepassing ervan op de Analyse van Haarzakje Patterning en Sensorische Axon morfologie

We presenteren een methode om de volwassen orgaan van Corti isoleren drie intacte cochleaire windingen (apex, midden en base). We tonen ook een procedure voor immunokleuring met fluorescent gelabelde antilichamen. Samen technieken maken het bestuderen van haarcellen, steuncellen en andere celtypen in de cochlea.

Hele Mount Dissection en Immunofluorescentie van de Adult Mouse Cochlea

De mechanismen die de interstitiële beweeglijkheid van CD4-effector-T-cellen regelen op plaatsen van ontsteking zijn relatief onbekend. Wij presenteren een niet-invasieve benadering visualiseren en manipuleren in vitro geprimed CD4 T-cellen in het ontstoken oor dermis, waardoor studie van het dynamisch gedrag van deze cellen in situ.

Beeldvorming CD4 T Cell interstitiële Migratie in de ontstoken Dermis

Hier beschrijven we een nieuwe voorbereiding voor het beeldvormen van levende lancetvormige sensorische terminalen van palissade-uiteinden die tijdens kleuring en ontkleur met styryl pyridinium kleurstoffen de haarzakjes van de muizenoorhuid innerveren.

Optical Monitoring van Living zenuwuiteinde Labeling in haarfollikel Lanceolate Endings van de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse Ear Skin

Dit protocol beschrijft de inductie van een ischemie-reperfusie (IR) model op de muis oor huid met behulp van magneet klemmen. Met behulp van een custom-built intravitale imaging model, bestuderen we in vivo ontstekingsreacties post-reperfusie. De reden voor de ontwikkeling van deze techniek is om te begrijpen hoe leukocyten reageren op huid IR schade verlengen.

Induceren van ischemie-reperfusie schade in de Mouse Ear Skin voor intravitale Multiphoton Imaging van immuunresponsen

Het oor model van de kale SKH1-Hr uur muis maakt intravitale fluorescentiemicroscopie microcirculatie en fototoxische trombus inductie zonder voorafgaande chirurgische preparaten in de onderzochte microvasculaire bed. Daarom is het oor van de haarloze muis is een uitstekend in vivo model voor de complexe interacties te bestuderen tijdens microvasculaire trombusvorming, trombus evolutie, en trombolyse.

Opklaren en Trombus inductie in de oorlel van een Hairless Mouse

Het protocol presenteert een nieuw hulpmiddel om intravitale beeldvorming te vereenvoudigen met behulp van omgekeerde confocale microscopie.

Gestroomlijnde intravitale beeldvormingsbenadering voor langetermijnmonitoring van de dynamiek van epitheelweefsel op een omgekeerde confocale microscoop

Dit protocol, bedoeld voor beginnende gebruikers van binnenoorweefsel van muizen, beschrijft uitgebreid de stappen voor het verwerken van de binnenoren van muizen in verschillende ontwikkelingsstadia voor sectie-immunokleuring.

Cryosectie en immunokleuring van het binnenoorweefsel van muizen: van embryonale tot volwassen stadia

Verken geheel-mount confocale microscopie om neuro-vasculaire vertakking en immuuncelverdeling in volwassen muizenoorhuid te visualiseren. Deze methode biedt inzicht in driedimensionale weefselarchitectuur.

Geheel-mount confocale microscopie voor volwassen oor huid: een modelsysteem om te studeren, Neuro-vasculaire vertakkende genuitdrukking en immuun cel distributie (Video) | JoVE Journal

Geheel-mount confocale microscopie voor volwassen oor huid: een modelsysteem om te studeren, Neuro-vasculaire vertakkende genuitdrukking en immuun cel distributie

Meer video's verkennen