Name: Beoordeling van lysosomale gealkaliseerd in de darm van levende Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Leer hoe je lysosomale verzuring in de darm van levende Caenorhabditis elegans beoordeelt met de pH-gevoelige kleurstof cDCFDA. Deze eenvoudige, reproduceerbare methode biedt waardevolle inzichten in autofagie en lysosomale functie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zouden graag bedanken het Caenorhabditis genetica Center for stammen, the Natural Sciences and Engineering Research Raad (NSERC), en de Stichting van Canada voor innovatie (CFI) voor financiering. Wij zouden graag willen bedanken Dr. Lizhen Chen (departement van Cell Systems en anatomie, UT gezondheid San Antonio) voor het toestaan van onbeperkt gebruik van haar lab voorzieningen voor alle C. elegans experimenten evenals Dr. Exing Wang (Associate Director, optische Imaging faciliteit UT gezondheid San Antonio) voor hulp bij confocale microscopie. Ook bedank we Dr Myron Ignatius voor het verstrekken van steun en aanmoediging om de video-shoot.

1. vlekken en intestinale lysosomen Image
<ol><li>Zaad nematode groei media (NGM) platen met OP50
	<ol>
<li>Bereiden van NGM platen volgens de aanbevolen protocol19 en laat de gesloten platen voor 2 dagen bij kamertemperatuur drogen.</li>
		<li>Inoculeer OP50 bacteriën in steriele Luria Bouillon (LB) Bouillon en groeien in een schudden incubator of water bad bij 37 ° C gedurende 36 uur of totdat de OD tussen 0,2 en 0.4 is. Vermijd het gebruik van een bacteriële cultuur met OD > 1 of OD < 0.2.</li>
		<li>Zodra NGM platen droog zijn, breng een druppel (~ 30 µL) van OP50 entmateriaal in het midden van de plaat, en verspreidde zich vervolgens de daling in een patch ongeveer 2 cm x 2 cm groot. Opmerking: Alle resterende OP50 entmateriaal kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal een maand.</li>
		<li>Omkeren van de platen OP50 zodra het entmateriaal is opgedroogd (ongeveer 10 of 15 min), en vervolgens Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 36 h.</li>
		<li>Na 36 h, verwijder de platen uit de incubator en winkel bij 4 ° C tot later opnieuw kunt gebruiken. Opmerking: De platen moet goed voor maximaal 1 maand bij 4 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>Ter aanvulling van cDCFDA naar OP50
	<ol>
<li>Ter aanvulling van cDCFDA op OP50 platen, bereiden een voorraad van de werken van 10 mM cDCFDA in dimethylsulfoxide (DMSO). Bewaar de oplossing van de cDCFDA beschermd tegen licht en opslag bij-20 ° C voor later gebruik.</li>
		<li>Voorzichtig plaats 100 µL van 10 mM cDCFDA oplossing op het oppervlak van de 2 cm x 2 cm OP50 patch, zodanig dat de gehele patch gelijkmatig met cDCFDA bedekt is. Opmerking: Het is zeer belangrijk dat de gehele patch van OP50 met cDCFDA bedekt is. Indien nodig, gebruik maximaal 150 µL van cDCFDA voor elke plaat. Het is ook noodzakelijk dat de cDCFDA oplossing niet buiten de grenzen van de OP50 patch, geldt aangezien elke cDCFDA die uit de OP50-patch stroomt niet zal worden opgenomen in de voedselketen, en in een verminderde kleuring intensiteit resulteren zal.</li>
		<li>Plaats de platen OP50 in een donkere kast op de top van de bank totdat alle van de cDCFDA oplossing wordt geabsorbeerd in de bacteriële patch (meestal ongeveer 25 tot 30 minuten).</li>
	</ol></li>
	<li>Kleuring van wormen met behulp van cDCFDA
	<ol>
<li>Zodra de cDCFDA de OP50 patch volledig doordrongen heeft, plaats van niet meer dan 20 wormen per plaat en Incubeer de platen bij 20 ° C gedurende ten minste 14 h omgekeerd. Opmerking: Het is aanbevolen om de plaats van de cDCFDA platen in een ondoorzichtige vak om te minimaliseren van de blootstelling aan licht.</li>
		<li>Voor de bediening voor inname verschillen tussen experimenten en te normaliseren cDCFDA signalen, aanbevolen () mede vlek met 3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)) difluoro) boor (2,5 µL van een vers bereide 1 mM-oplossing), een acidotropic zwak amine kleurstof waarvan fluorescentie grotendeels niet-variant het zure pH-spectrum is (Zie Tabel van materialen voor gemeenschappelijke namen van reagentia). Opmerking: Geen vlekken wormen voor minder dan 14 h aangezien dit kan onvoldoende cDCFDA kleuring intensiteit bieden en een valse interpretatie van lysosomale pH.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia's voorbereiden microscopie
	<ol>
<li>Plaats twee evenwijdige stroken van labeling tape ongeveer 3 inch uit elkaar op een gladde vlakke ondergrond, zoals een spiegel (Figuur 1).</li>
		<li>Coat het oppervlak van de spiegel met waterafstotende spray en veeg overtollige vloeistof af.</li>
		<li>Smelt 2% agarose (opgelost in gedestilleerd H2O) in de magnetron totdat volledig vloeibaar gemaakt, dan plaatst u een 50 µL druppel agarose tussen de twee stroken tape en snel dekken de daling met een microscoopglaasje, zodanig dat de dia loodrecht op de stroken staat tape. Nadat de agarose is gestold, vormen een cirkelvormig pad onder de dia, de dia flipover en voeg 10 à 15 µL van 5mM natriumazide (NaN3) op de agarose pad. Opmerking: NaN3 is een inhibitor van cytochroom C dat wanneer gebruikt in lage concentraties, omkeerbaar anesthetizes wormen zodat ze zal niet worden verplaatst tijdens imaging.</li>
		<li>Kies wormen uit de plaat van de OP50 aangevuld met cDCFDA, en deze overbrengen naar een schone NGM plaat zonder enige OP50. Toestaan dat de wormen te bewegen voor een paar seconden om het merendeel van de OP50 van het oppervlak van de wormen worden verwijderd, en vervolgens de wormen overbrengen in de agarose pad met 5 mM natriumazide.</li>
		<li>Onmiddellijk dekken de agarose pad met een cover slip. Zorg ervoor dat zachtjes plaats de cover slip zonder teveel druk, toe te passen, aangezien dit kan resulteren in wormen barsten. Opmerking: OP50 bacteriën aangevuld met cDCFDA lichten wanneer gevisualiseerd door microscopie, daarom is het belangrijk om de wormen zo goed mogelijk schoon alvorens ze te plaatsen op de agarose pad met natriumazide. Als prepping meer dan 6 stammen van C. elegans (met inbegrip van N2, wild type controle), is het raadzaam om voor te bereiden van de monsters in batches van 6, om ervoor te zorgen dat de wormen niet voort naar de agarose stempelkussen doen uitdrogen. In sommige stammen begint de vulva te scheuren na langere tijd als gevolg van druk van de cover slip, dus het is belangrijk om het plan dienovereenkomstig.</li>
	</ol></li>
	<li>Confocale microscopie Opmerking: Sommige microscopen hebben een ingebouwde functie die automatisch verhoogt de intensiteit van de fluorescentie te compenseren voor verschillende niveaus van fluorescentie. Deze Microscopen werken mogelijk niet goed voor imaging wormen gekleurd met cDCFDA, aangezien ze inherent de intensiteit van de fluorescentie van monsters toenemen zal.<ol>
<li>Uitvoeren van imaging op een norm confocal microscoop met behulp van excitatie/emissie golflengten ingesteld op 488/530 nm voor de cDCFDA. Neem enkel vliegtuig beelden (niet Z-stacks) van intestinale lysosomen en gebruik van alleen lysosomen zijn in focus (maximale signaal intensiteit) voor de kwantificering van de intensiteit. Opmerking: Misschien vanwege verschillen in de beschikbaarheid van de kleurstof, lysosomen van de intestinale cellen rechtstreeks posterieure naar de farynx handhaven cDCFDA kleuring intensiteit ongeacht genotype of leeftijd, dus zorg moet worden genomen om te voorkomen imaging lysosomen in deze cellen.</li>
		<li>Het imago van de dia met 2 dag oud wild type die N2 eerst wormen. Terwijl doen, pas de confocal imaging parameters zoals laser macht pinhole en diafragma om ervoor te zorgen dat de cDCFDA kleuring intensiteit niet is oververzadigd. Opmerking: Zodra deze instellingen zijn ingesteld, niet wijzigt voor de gehele duur van de beeldvorming voor die dag.</li>
		<li>1024 x 1024 pixel foto's vastleggen van een enkel vliegtuig van darm (3 tot en met 4 beelden per worm) met behulp van een 60 X vergroting lens. Opmerking: Het emissiespectrum van de cDCFDA in wormen levert een enkele prominente piek op 520 nm samenvalt met de gerapporteerde fluorescentie spectrum20, leveren een uitlezing voor specifieke signaal dat verschilt van intestinale autofluorescence (Figuur 3).</li>
		<li>Confocale raw-afbeeldingen (.lsm bestanden) exporteren als TIFF-bestanden voor elk kanaal.</li>
		<li>Volgende, open ImageJ en klik op bestand | Open te openen het afbeeldingsbestand worden gekwantificeerd. Zodra de afbeelding is geladen, gebruikt u het ovale vorm-gereedschap in ImageJ om een gebied van belang (ROI) te selecteren.</li>
		<li>Daarna, klik op de Analyze | Maatregel te kwantificeren van de intensiteit van de fluorescentie voor dat ROI. 4 – 5 verschillende in-focus lysosomen per afbeelding selecteren en de intensiteit van de gemiddelde relatieve fluorescentie van elke regio van belang (ROI) berekenen.</li>
		<li>Voor elke afbeelding, meet de intensiteit van de fluorescentie achtergrond in een regio van de darm tussen lysosomen. Aftrekken van de achtergrond fluorescentie intensiteitswaarden van de intensiteitswaarden lysosomale fluorescentie.</li>
		<li>Verzamelen in totaal ongeveer 30 tot 50 afzonderlijke genormaliseerde waarden voor cDCFDA intensiteit (6 tot 10 dieren) voor elke stam wordt getest. Deze waarden kunnen worden uitgezet op een perceel van het vak en friemeltje met behulp van passende statistische software gebruiken. Opmerking: Kleuring kan aanzienlijk variëren afhankelijk van factoren zoals temperatuur, incubatietijd en de algehele gezondheid/leeftijd van dieren zodanig dat fluorescentie intensiteit vergelijkingen alleen relevant is binnen monsters proces in hetzelfde kleuring experiment zijn. Het is daarom belangrijk voor het verwerken van besturingselementen in elke kleuring experiment. Berekenen van de statistische verschillen (t-tests) met behulp van passende statistische software.</li>
		<li>Afbeelding alle stammen uit hetzelfde experiment (gekleurd op dezelfde dag) in volgorde, als u niet wilt wijzigen van de imaging parameters verzorgen.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nystrom, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+aging+and+failure+to+segregate+damaged+proteins+in+Sir2+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants.</a> Genes Dev. 21 (19), 2410-2421 (2007).</li>
<li>Madeo, F., Eisenberg, T., Kroemer, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2758740/">Autophagy for the avoidance of neurodegeneration.</a> Genes Dev. 23 (19), 2253-2259 (2009).</li>
<li>Rubinsztein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+intracellular+protein-degradation+pathways+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration.</a> Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).</li>
<li>Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+activities+protect+against+age-onset+proteotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity.</a> Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).</li>
<li>Cuervo, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+aging%3A+the+importance+of+maintaining+%26%2334%3Bclean%26%2334%3B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy and aging: the importance of maintaining &#34;clean&#34; cells.</a> Autophagy. 1 (3), 131-140 (2005).</li>
<li>Harrington, A. J., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system+for+identifying+effectors+of+alpha-synuclein+misfolding+and+dopaminergic+cell+death+associated+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a model system for identifying effectors of alpha-synuclein misfolding and dopaminergic cell death associated with Parkinson's disease.</a> Methods. 53 (3), 220-225 (2011).</li>
<li>Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding%2C+amyloid+formation%2C+and+neurodegeneration%3A+a+critical+role+for+molecular+chaperones%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding, amyloid formation, and neurodegeneration: a critical role for molecular chaperones?</a> Neuron. 35 (1), 9-12 (2002).</li>
<li>Cuervo, A. M., Dice, J. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10806201">Age-related decline in chaperone-mediated autophagy.</a> J Biol Chem. 275 (40), 31505-31513 (2000).</li>
<li>Tonoki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+evidence+linking+age-dependent+attenuation+of+the+26S+proteasome+with+the+aging+process%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic evidence linking age-dependent attenuation of the 26S proteasome with the aging process.</a> Mol Cell Biol. 29 (4), 1095-1106 (2009).</li>
<li>Squier, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+protein+aggregation+during+biological+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and protein aggregation during biological aging.</a> Exp Gerontol. 36 (9), 1539-1550 (2001).</li>
<li>Sarkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+enhance+autophagy+and+reduce+toxicity+in+Huntington%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Small molecules enhance autophagy and reduce toxicity in Huntington's disease models.</a> Nat Chem Biol. 3 (6), 331-338 (2007).</li>
<li>Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy%3A+cellular+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Autophagy: cellular and molecular mechanisms.</a> J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).</li>
<li>Boya, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+function+and+dysfunction%3A+mechanism+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Lysosomal function and dysfunction: mechanism and disease.</a> Antioxid Redox Signal. 17 (5), 766-774 (2012).</li>
<li>Kim, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-aging+treatments+slow+propagation+of+synucleinopathy+by+restoring+lysosomal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function.</a> Autophagy. 12 (10), 1849-1863 (2016).</li>
<li>Vila, M., Bove, J., Dehay, B., Rodriguez-Muela, N., Boya, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+membrane+permeabilization+in+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Lysosomal membrane permeabilization in Parkinson disease.</a> Autophagy. 7 (1), 98-100 (2011).</li>
<li>Cuervo, A. M., Dice, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+intracellular+proteolytic+systems+change+with+age%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">How do intracellular proteolytic systems change with age?</a> Front Biosci. 3, d25-d43 (1998).</li>
<li>Cuervo, A. M., Dice, J. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10767573">When lysosomes get old.</a> Exp Gerontol. 35 (2), 119-131 (2000).</li>
<li>Gachet, Y., Codlin, S., Hyams, J. S., Mole, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((btn1%2C+the+Schizosaccharomyces+pombe+homologue+of+the+human+Batten+disease+gene+CLN3%2C+regulates+vacuole+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">btn1, the Schizosaccharomyces pombe homologue of the human Batten disease gene CLN3, regulates vacuole homeostasis.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5525-5536 (2005).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19649/?report=reader">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Preston, R. A., Murphy, R. F., Jones, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+vacuolar+pH+in+yeast+and+identification+of+acidification-defective+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Assay of vacuolar pH in yeast and identification of acidification-defective mutants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (18), 7027-7031 (1989).</li>
<li>Pringle, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+methods+for+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy methods for yeast.</a> Methods Cell Biol. 31, 357-435 (1989).</li>
<li>Baxi, K., Ghavidel, A., Waddell, B., Harkness, T. A., de Carvalho, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Lysosomal+Function+by+the+DAF-16+Forkhead+Transcription+Factor+Couples+Reproduction+to+Aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of Lysosomal Function by the DAF-16 Forkhead Transcription Factor Couples Reproduction to Aging in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 207 (1), 83-101 (2017).</li>
<li>Colacurcio, D. J., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorders+of+lysosomal+acidification-The+emerging+role+of+v-ATPase+in+aging+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Disorders of lysosomal acidification-The emerging role of v-ATPase in aging and neurodegenerative disease.</a> Ageing Res Rev. 32, 75-88 (2016).</li>
<li>Kang, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+screening+identifies+ATM+as+a+target+for+alleviating+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical screening identifies ATM as a target for alleviating senescence.</a> Nat Chem Biol. 13 (6), 616-623 (2017).</li>
<li>Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+body+formation+reduces+levels+of+mutant+huntingtin+and+the+risk+of+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death.</a> Nature. 431 (7010), 805-810 (2004).</li>
<li>Brunk, U. T., Terman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial-lysosomal+axis+theory+of+aging%3A+accumulation+of+damaged+mitochondria+as+a+result+of+imperfect+autophagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial-lysosomal axis theory of aging: accumulation of damaged mitochondria as a result of imperfect autophagocytosis.</a> Eur J Biochem. 269 (8), 1996-2002 (2002).</li>
<li>Gerland, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autolysosomes+accumulate+during+in+vitro+CD8%2B+T-lymphocyte+aging+and+may+participate+in+induced+death+sensitization+of+senescent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Autolysosomes accumulate during in vitro CD8+ T-lymphocyte aging and may participate in induced death sensitization of senescent cells.</a> Exp Gerontol. 39 (5), 789-800 (2004).</li>
<li>Poon, H. F., Vaishnav, R. A., Getchell, T. V., Getchell, M. L., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+analysis+of+differential+protein+expression+and+oxidative+modification+of+specific+proteins+in+the+brains+of+old+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics analysis of differential protein expression and oxidative modification of specific proteins in the brains of old mice.</a> Neurobiol Aging. 27 (7), 1010-1019 (2006).</li>
<li>Yin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+basis+of+lipofuscin%2C+ceroid%2C+and+age+pigment-like+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Biochemical basis of lipofuscin, ceroid, and age pigment-like fluorophores.</a> Free Radic Biol Med. 21 (6), 871-888 (1996).</li>
<li>Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reduction+in+intestinal+cell+pHi+due+to+loss+of+the+Caenorhabditis+elegans+Na%2B%2FH%2B+exchanger+NHX-2+increases+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span.</a> J Biol Chem. 278 (45), 44657-44666 (2003).</li>
<li>Chakraborty, K., Leung, K., Krishnan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+lumenal+chloride+in+the+lysosome+is+critical+for+lysosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">High lumenal chloride in the lysosome is critical for lysosome function.</a> Elife. 6, (2017).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Een verscheidenheid van cellulaire en moleculaire gebeurtenissen bijdragen aan veroudering, beïnvloed door levensgeschiedenis karaktertrekken en genetische factoren. Onze recente studie22 suggereert dat de reproductieve cyclus een belangrijke rol speelt bij de controle van de geschiktheid van het soma door middel van de verordening van lysosomale pH dynamiek. We toonden dat lysosomal-gemedieerde proteolyse wordt bevorderd terwijl dieren actief reproduceren door opregulatie van v-ATPase transcripti...

Het uiterlijk van eiwit-aggregaten is algemeen aanvaard als een kenmerk van veroudering in eukaryote cellen1,2,3, en de vorming van die wordt beschouwd als onder de bestuurders van het principe van cellulaire senescentie4 , 5 , 6 , 7. er zijn steeds meer aanwijzingen dat leeftijd cellen, eiwit katabolisme bijzondere waardevermindering heeft ondergaan is, wat leidt tot een toename van de aggregatie van eiwitten. De ineenstorting van proteolyse in de veroudering van de cellen impliceert een bijzondere waardevermindering van autophagy8 evenals proteasoom-gemedieerde eiwit afbraak9. Ten slotte, onomkeerbare eiwit oxidatie wordt verhoogd in oude cellen, verder afbreuk te doen aan eiwit katabolisme10.
Autophagy was in eerste instantie dacht dat een niet-selectieve proces voor bulk afbraak van beschadigde eiwitten, maar recente studies hebben aangegeven dat autophagy is zeer selectief aan het katabolisme van eiwit-aggregaten en disfunctionele organellen die niet vatbaar voor afbraak via andere eiwit klaring mechanismen11. Tijdens het proces van autophagy, zijn beschadigde en geaggregeerde eiwitten afgezonderd in een dubbel-membraan blaasje genaamd de autophagosome. Dit autophagosome vervolgens combineert met de zure organellen genaamd lysosomen, die leidt tot aantasting van de lading autophagosome12. Lysosomen vertegenwoordigen het eindpunt van het autophagic traject en deelnemen aan verschillende cellulaire processen zoals membraan reparatie, transcriptionele controle en nutriënten sensing; markeren hun centrale rol in de cellulaire homeostase (herzien in ref. 13). Verschillende studies hebben een associatie tussen een leeftijd afhankelijke daling in lysosomale functie en verschillende neurodegeneratieve aandoeningen13aangetoond. Consequent, kan herstel van de lysosomale functie in oudere cellen vertragen het ontstaan van veroudering-gerelateerde fenotypen14,15. Studies van de samenstelling van de intralumen kring suggereren dat de ineenstorting van de lysosomale functie in oudere cellen niet te wijten aan een vermindering van de productie van lysosomale proteasen16 is. Er wordt ook geopperd dat verlies van intralysosomal zuurgraad, een kritieke eis van de enzymatische activiteit, de daling lysosoom-gemedieerde proteolyse17ten grondslag kan liggen. Om te kunnen verkennen deze hypothese, is het essentieel om reagentia en protocollen om te sonderen dynamische veranderingen in lysosomale pH in levende cellen in een repliceerbare en consistente manier te ontwikkelen.
De darm van C. elegans is het belangrijke metabole weefsel in wormen en is een kritische regelgever van systemische homeostase en levensduur. Hebben we testen om te evalueren van de veranderingen in de zuurgraad van het lumen van de darm lysosomen van wormen om te bepalen hoe lysosoom-gemedieerde proteolyse bijdraagt aan veroudering. Hoewel pH-gevoelige fluorophores hebben eerder is gebruikt in C. elegans om te markeren van intestinale lysosomen, is er nog niet een poging om een succesvolle protocol dat kleine stijgingen in lysosomale pH in vivo18. detecteren kan Wij bieden hier, een protocol dat kan worden gebruikt voor het detecteren van verlies van lysosomale zuurgraad in de intestinale cellen van C. elegans met behulp van een eenvoudige en handige voeding protocol waarin een pH-gevoelige fluorophore (cDCFDA) in OP50 voedsel.

<table><tbody><tr><td>OP50 (E. coli)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>Bestel online op https://cgc.umn.edu/strain/OP50</td></tr><tr><td>5(6)-carboxy-2&rsquo;,7&rsquo;-dichlorofluorescein diacetaat&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>C369</td><td>Algemeen bekend als cDCFDA</td></tr><tr><td>9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-on en (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylideen]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidaat)(difluoro)boron</td><td>ThermoFisher</td><td>L7528</td><td>Algemeen bekend als Lysotracker Red</td></tr><tr><td>Confocal microscoop (bijv. Zeiss LSM 510)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Download gratis van https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>LB Broth poeder</td><td>ThermoFisher</td><td>22700041</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Sigma</td><td>A5306-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>S71604</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol poeder</td><td>Sigma</td><td>C3045&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>449709</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>K3PO4</td><td>Sigma</td><td>P5629</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopglaasjes</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes</td><td>ThermoFisher</td><td>3406</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A6013</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spiegel of andere gladde platte oppervlak</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

beoordeling van lysosomale gealkaliseerd in de darm van levende caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

De nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is een modelsysteem dat veel gebruikt wordt om te studeren, lange levensduur en ontwikkelings trajecten. Dergelijke studies worden gefaciliteerd door de transparantie van het dier, de mogelijkheid om te vooruit en achteruit genetische tests, het relatieve gemak van genereren fluorescently geëtiketteerde eiwitten, en het gebruik van fluorescente kleurstoffen die kan worden microinjected in de vroege embryo of opgenomen in zijn voedsel (E. coli stam OP50) op het etiket van cellulaire organellen (bijvoorbeeld 9-diethylamino-5 H-benzo (a) phenoxazine-5-één en (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-pyrrol-5-yl-kappaN} - N - [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Hier presenteren we het gebruik van een fluorescente kleurstof van pH-gevoelige die vlekken intestinale lysosomen, voorzien van een visuele uitlezing van dynamische, fysiologische veranderingen in lysosomale zuurgraad in levende wormen. Dit protocol niet lysosomale pH meet, maar wil liever een betrouwbare methode voor de beoordeling van de fysiologische relevante varianten in lysosomale zuurgraad. cDCFDA is een cel-permeant verbinding die wordt geconverteerd naar de fluorescerende fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) na hydrolyse door intracellulaire esterasen. Protonering binnen lysosomen overlapt cDCF in deze organellen, waar het zich ophoopt. Als gevolg van zijn lage pKa van 4.8, is deze kleurstof gebruikt als een pH sensor in gist. Hier beschrijven we het gebruik van cDCFDA als een voedingssupplement te beoordelen van de zuurgraad van intestinale lysosomen in C. elegans. Deze techniek zorgt voor de detectie van alkalinizing lysosomen in levende dieren in, en heeft een breed scala van experimentele toepassingen met inbegrip van studies over autophagy, veroudering en lysosomale biogenese.

cDCFDA vlekken lysosomen in een pH-afhankelijke manier, en de lage pKa en klaar opname in de lysosomen maakt het een ideale pH sensor21. cDCFDA kleuring intensiteit is omgekeerd evenredig met de lysosomale pH (d.w.z. kleuring intensiteit toeneemt als pH daalt)18,22. cDCFDA signalen zijn consequent zwak in de lysosomen van dieren die zijn behandeld met 20 mM van chloroquine, een inhibitor van de omw...

Een stapsgewijze handleiding sonde verlies van lysosomale zuurtegraad in de darm van C. elegans met behulp van de pH-gevoelige vitale kleurstof 5 (6) - carboxy - 2', 7'-dichlorofluorescein-DIACETAAT (cDCFDA)

Beoordeling van lysosomale gealkaliseerd in de darm van levende Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Het algemene doel van deze procedure is om een relatieve verlies van lysosomale zuurgraad in de intestinale lysosomen van C.elegans te beoordelen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van autofagie te beantwoorden door indirect informatie te verschaffen over de lysosomale functie en eiwitafbraak. Het grote voordeel van deze techniek is dat het eenvoudig, goedkoop, gemakkelijk en reproduceerbaar is.We hadden eerst het idee voor deze methode toen we de kleuringstechniek zagen gebruiken voor het beoordelen van vacuolaire alkalinisatie in gist. Visuele demonstratie van deze methode is belangrijk omdat bepaalde stappen, zoals het toevoegen van cDCFDA aan OP50 voedsel en het afbeelden van controle twee dagen oude wildtype wormen, cruciaal zijn. Na het voorbereiden van de NGM platen, laat de platen twee dagen drogen op kamertemperatuur met de deksel gesloten.Vervolgens, inoculeer de OP50 bacteriën in steriele Luria bouillon. Na inoculatie, laat de inoculant in de incubator tot de OD tussen 0,2 en 0,4 is. Plaats vervolgens een druppel van de OP50 inoculant in het midden van de droge NGM plaat.Gebruik vervolgens een spreader om de inoculant in een vlek van ongeveer twee bij twee centimeter te verspreiden. Ongeveer na 15 minuten, draai de OP50 plaat om nadat de inoculant is opgedroogd. Bewaar vervolgens de plaat gedurende 36 uur bij 37 graden Celsius.Zodra de incubatie voorbij is, breng de plaat over op vier graden Celsius tot gebruik. Bereid vervolgens een werkoplossing van 10 millimolar cDCFDA in M9 buffer. Bewaar de cDCFDA oplossing uit het licht bij min 20 graden Celsius.Pipet vervolgens 100 microliters van 10 millimolar cDCFDA om de gehele OP50 vlek gelijkmatig op de plaat te bedekken. Laat de cDCFDA platen in een donkere doos op de werkbank ongeveer 30 minuten staan. Nadat de cDCFDA de OP50 vlek volledig is binnengedrongen, zet 20 wormen op de plaat, en laat de plaat vervolgens ongeveer 14 uur in omgekeerde toestand staan bij 20 graden Celsius.Neem vervolgens twee stroken etikettape en plaats ze 1,5 inch uit elkaar op een gladde, vlakke spiegeloppervlakte. Bedek vervolgens het oppervlak van de spiegel met waterafstotende spray en verwijder het overtollige vocht. Smelt vervolgens 2% agarose in gedistilleerd water in de magnetron.Nadat de agarose is vloeibaar gemaakt, plaats een druppel agarose tussen de twee stroken tapes en bedek de druppel met de microscoopglasplaat. Nadat de agarose is gestold in de vorm van een cirkelvormige pad onder de schuif, draai de schuif om. Voeg vervolgens 10 tot 15 microliters van vijf millimolar natriumazid toe aan de agarose pad.Breng nu de wormen over van de cDCFDA aangevulde plaat naar een schone NGM plaat zonder OP50. Laat de wormen een paar seconden bewegen zodat de OP50 van hun oppervlak wordt verwijderd. Breng vervolgens de worm over op de agarose pad die vijf millimolar natriumazid bevat.Bedek snel de agarose pad met een dekglas. Gebruik vervolgens een 60X vergrotingslens en maak afbeeldingen in een enkel vlak van de darm van twee dagen oude wildtype en mutant wormen. Open vervolgens ImageJ en klik op het bestand.Klik vervolgens op Openen om het bestand te openen dat gequantificeerd moet worden. Nadat het beeld is geladen, gebruik de ovaalvormige Selectietool om het gebied van belang te selecteren. Klik vervolgens op Analyseren, en ten slotte op Meten om de fluorescentie-intensiteit van het gebied van belang te kwantificeren.Om de lysosomale functionele activiteit te bestuderen, wordt de cDCFDA kleuringsintensiteit gekwantificeerd met behulp van confocale beeldvorming. In dit beeld is er een robuuste cDCFDA fluorescentie signaal intensiteit in de intestinale lysosomen van twee dagen oude wildtype C.Elegans. Dit duidt op een functioneel competent zuur lysosome.In tegenstelling, is de fluorescentie intensiteit aanzienlijk onderdrukt in de intestinale lysosomen van twee dagen oude wildtype wormen. Dit is in vergelijking met de intestinale lysosomen van twee dagen oude wormen. Het resultaat duidt op de aanwezigheid van functioneel incompetent alkalisch lysosome in acht dagen oude wormen.Interessant genoeg is de cDCFDA fluorescentie in intensiteit ook aanzienlijk verminderd in zowel twee dagen oude als acht dagen oude RNAi wormen in vergelijking met de wildtype worm. Hier is het vha gen, dat codeert voor de vacuolaire ATPase subeenheden in de lysosomale bekleding, in de twee dagen oude en acht dagen oude wormen uitgeschakeld. Eenmaal beheerst, kan dit hele kleurings- en microscopie regime in minder dan 18 uur worden voltooid, indien goed uitgevoerd.Wanneer u deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden dat wormen in cDCFDA supplement in OP50 voedsel gedurende minimaal 14 uur moeten worden geïncubeerd. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u verlies van lysosomale zuurgraad in de intestinale lysosomen van levende C.elegans kunt beoordelen.

assessing-lysosomal-alkalinization-intestine-live-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Source: Le, T. A. N., et al., Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates a fluorescence-based assay to quantify intestinal permeability in C. elegans exposed to Pseudomonas aeruginosa. Compared to controls fed Escherichia coli, pathogen-treated worms show increased fluorophore leakage into the body cavity, indicating epithelial barrier damage.

Assessment of Intestinal Permeability in C. elegans Following Bacterial Exposure

This video describes a colorimetric assay for lactate measurement in cell lysates by using the lactate dehydrogenase enzyme. This enzyme converts lactate into pyruvate, along with the conversion of NAD to NADH that reacts with tetrazolium dyes and gives a colored product that can be measured spectrophotometrically to quantitate the lactate.

Colorimetric Assay for Quantification of Lactate in Test Samples

Beschrijven we methoden om aspecten van amylopathies in de worm te...

Een<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Model Systeem voor Amylopathy Study

Om de relatie tussen eiwithomeostase, stress en veroudering te bestuderen, hebben we veranderingen in eiwitvouwing gemonitord door eiwitdisfunctie, eiwitlocalisatie in de cel en eiwitstabiliteit op organismisch, cellulair en eiwitniveau te volgen, met behulp van de genetisch hanteerbare metazoa Caenorhabditis elegans als modelsysteem.

Gebruik Caenorhabditis elegans Als een modelsysteem voor de Protein Homeostase studeren in een meercellige

De transparante C. elegans darm kan dienen als een"in-vivo weefsel kamer" voor de studie van apicobasal membraan en lumen biogenese de eencellige en subcellular niveau tijdens meercellige tubulogenesis. Dit protocol beschrijft hoe te combineren met het standaard labeling, verlies-van-functie genetische/RNAi en microscopische benaderingen te ontleden van deze processen op een moleculair niveau.

C. elegans darm als een Model voor intercellulaire Lumen genuitdrukking en In Vivo gepolariseerde biogenese van eencellige niveau: Labeling door antilichaam kleuring, RNAi verlies-van-functie analyse en beeldvorming

Het uitscheidingsmechanisme kanaal van C. elegans is een uniek eencellige model voor de visuele in vivo analyse van biogenese van DOVO gepolariseerd. Dit protocol beschrijft een combinatie van standaard genetische/RNAi en imaging benaderingen, aanpasbaar voor de identificatie en karakterisering van moleculen eencellige tubulogenesis en apicale membraan en lumen biogenese regisseren.

Het kanaal Excretory C. elegans als een Model voor de intracellulaire Lumen genuitdrukking en In Vivo gepolariseerde biogenese van organellen in één cel: labelen door GFP-fusies, RNAi interactie scherm en beeldvorming

We beschrijven een gemodificeerde kleinschalige extractie en colorimetrische vitrotests van lactaat en pyruvaat in de nematode C. elegans. Bij gebruik van commerciële assay kits, is de technische ontwikkeling van hun gevoeligheid en nauwkeurigheid belangrijk. Eiwit neerslag in extractie is de meest kritische stap voor de kwantitatieve bepaling van intracellulaire metabolieten.

Kleinschalige colorimetrische testen van intracellulaire lactaat en pyruvaat in de Nematode Caenorhabditis elegans

Dit protocol beschrijft hoe de intestinale permeabiliteit van Caenorhabditis elegansmeten. Deze methode is nuttig voor fundamenteel biologisch onderzoek naar intestinale gezondheid in verband met de interactie tussen darmbacteriën en hun gastheer en voor screening om te identificeren van probiotische en chemische agentia te genezen van lekkende gut syndroom en inflammatoire darmziekten.

Meten van de effecten van bacteriën en chemicaliën op de intestinale permeabiliteit van Caenorhabditis elegans

Proteostatische achteruitgang is een kenmerk van veroudering en vergemakkelijkt het begin van neurodegeneratieve ziekten. We schetsen een protocol om proteostase kwantificeerbaar te meten in twee verschillende Caenorhabditis elegans-weefsels door heterologe expressie van polyglutamine-herhalingen gefuseerd met een fluorescerende verslaggever. Dit model maakt een snelle in vivo genetische analyse van proteostase mogelijk.

Kwantificering van weefselspecifieke proteostatische achteruitgang van Caenorhabditis elegans

Gestimuleerde Raman scattering (SRS) microscopie maakt selectieve, labelvrije beeldvorming van specifieke chemische moieties mogelijk en het is effectief gebruikt om lipidemoleculen in vivo in beeld te brengen. Hier geven we een korte inleiding tot het principe van SRS-microscopie en beschrijven we methoden voor het gebruik ervan bij de opslag van beeldvormende lipiden in Caenorhabditis elegans.

Labelvrije beeldvorming van lipideopslagdynamiek bij Caenorhabditis elegans met behulp van gestimuleerde Raman-verstrooiingscopie

Het onderwijs in biologische wetenschappen kan voor studenten stimulerender worden gemaakt door het gebruik van experimenten. Dit manuscript presenteert twee verschillende maar complementaire protocollen die in de klas kunnen worden gebruikt om studenten aan te moedigen hypothesen te formuleren en te testen met betrekking tot calorierijke diëten, uithongering en veroudering.

Goedkope kleurstoffen gebruiken om glycogeenaccumulatie en darmintegriteit bij Caenorhabditis elegans te visualiseren

Leer hoe je lysosomale verzuring in de darm van levende Caenorhabditis elegans beoordeelt met de pH-gevoelige kleurstof cDCFDA. Deze eenvoudige, reproduceerbare methode biedt waardevolle inzichten in autofagie en lysosomale functie.

Beoordeling van lysosomale gealkaliseerd in de darm van levende Caenorhabditis elegans

Meer video's verkennen