Name: Analyse van mineralen geproduceerd door hFOB 1.19 en Saos-2 cellen met behulp van Transmissie Electronenmicroscopie met energie dispersieve x-stralen Microanalyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Leer mineralisatieprofielen vergelijken in hFOB 1.19 en Saos-2 botcellijnen met TEM en EDX-microanalyse. Deze methode biedt inzicht in nucleatieprocessen voor botbiologieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MK en ASK handmatige bewerkingen uitgevoerd en LB bereid tekeningen en maakte de film. ASK schreef het manuscript, LB schreef het script en MK bereid de tabel. SM, RB en SP lezen kritisch in de tabel, het script en het manuscript. De auteurs bedank Hanna Chomontowska voor haar uitstekende hulp bij ultramicrotomie evenals Szymon Suski en Henryk Bilski voor hun uitstekende hulp bij de analyse van de TEM-EDX. De auteurs bedank dr Patrick Groves voor professionele Engelstalige correctie en Barbara Sobiak voor het opnemen van de instructies.
Dit werk werd gesteund door grant N N401 140639 van het Poolse ministerie van Wetenschappen en hoger onderwijs te stellen vragen, door subsidies van de National Science Centre, Polen 2016/23/N/NZ4/03313 LB en 2016/23/N/NZ1/02449 te MK, EU KP7 Project BIOIMAGINE : BIO-IMAGing in onderzoek, innovatie en onderwijs, GA nr. 264173, en door de wettelijke middelen van het Nencki Institute of Experimental Biology, Poolse Academie van Wetenschappen.

1. cultuur en behandeling van de cel
<ol><li>Zet alle noodzakelijke materialen onder de motorkap laminaire flow en steriliseren hen onder UV-licht. De voedingsbodems zijn: een 1:1-mengsel van Ham de F12 en DMEM media met 2.5 mM L-glutamine aangevuld met 100 U/mL penicilline, 100 U/mL streptomycine, 0,3 mg/mL G418 en 10% foetale runderserum (FBS) (v/v) voor menselijke foetus hFOB 1.19 SV40 grote T antigeen transfected Botcellen en McCoy's 5A medium met 1,5 mM L-glutamine aangevuld met 100 U/mL penicilline, 100 U/mL streptomycine en 15% FBS (v/v) voor menselijke Osteosarcoom Saos-2 cellen.</li>
	<li>Cultuur hFOB 1.19 cellen bij 34 ° C in een atmosfeer van 5% CO2 en Saos-2 cellen bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO2. Overdracht van celculturen, ofwel hFOB-1.19 of Saos-2 cellen, van de incubator de laminaire flow Hood en wijzig het medium in 10 mL verse kweekmedium met FBS.</li>
	<li>Incubeer de cellen zonder stimulatoren (rustende cellen) of stimuleren ze met 50 µg/mL ascorbinezuur (AA) gevolgd door 7.5 mM β-Glycerophosphate (β-GP), bereid eerder in ultrazuiver water en gefilterd door 0,22 µm spuit filters. Voeg de stimulatoren van kunststof microcentrifuge buizen op het oppervlak van het kweekmedium. Zachtjes roeren van de cultuur-schotel en incubeer gedurende 7 dagen.</li>
</ol>2. opsporing van Calcium mineralen
<ol><li>Wassen van de celculturen met fosfaat Buffer zoutoplossing (PBS: 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM nb2HPO4, 1 mM KH2PO4, pH 7,0).</li>
	<li>Voeg 5 mL van 2% (g:100 mL) AR-S in PBS, pH 5.0 en Incubeer de platen gedurende 30 minuten om de mineralen vlek.</li>
	<li>3 keer wassen met PBS. Zorgvuldig PBS toevoegen aan de muur van de schotel, probeer niet te vernietigen de mineralen.</li>
	<li>Calcium mineralen onder een omgekeerde lichte Microscoop te observeren en nemen van beelden.</li>
</ol>3. visualisatie van sondes onder UV-licht
<ol><li>Behandelen voor cel lysates, celculturen, rusten of gestimuleerd voor 7 dagen, volgens de collagenase spijsvertering protocol24.</li>
	<li>Het medium van celculturen verzamelen en wassen van de cellen met PBS.</li>
	<li>Het verteren van de cellen met 3 mL 500 U/mL collagenase in een oplossing van 0,25 M sacharose, 0,12 M NaCl, 0,01 M KCl en 0,02 M Tris-HCl buffer, pH 7,45, bij 37 ° C gedurende 3 uur.</li>
	<li>Mechanisch schrapen van de cellen, overbrengen naar kunststof microcentrifuge buizen en passeren ze 10 keer een 1 mL 40 U spuit met 0,5 × 16 naald.</li>
	<li>Centrifugeer de monsters bij 500 × g gedurende 5 min.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en Suspendeer de pellet cel in 500 µL van synthetische kraakbeen lymfe (SCL, 100 mM NaCl, 12,7 mM KCl, 0,57 mM MgCl2, 1.83 mM NaHCO3, 0,57 mM NaH2PO4, 5.5 mM D-glucose, sacharose 63 mM, 16,5 mM Hepes, pH 7.4).</li>
	<li>Overdracht van het hydroxyapatiet (HA), fluorapatiet (FA) en chlorapatite (CA) poeders van de flessen op de UV-transilluminator met een spatel en gebruik als besturingselementen.</li>
	<li>Overdracht van de cel lysates van de plastic buizen met kunststof tips en zorgvuldig plaats op de UV-transilluminator.</li>
	<li>Neem beelden onder zichtbaar en UV-licht.</li>
</ol>4. voorbereiding van sondes voor TEM-EDX
<ol><li>Voorbereiding van mineralen negatieve kleuring<ol>
<li>Opschorten van 2,5 mg van synthetisch geproduceerde HA, CA en FA mineralen25 in 500 ÂµL van gedeïoniseerd water en Incubeer bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO2 voor 1 h.</li>
		<li>Neem Formvar/Carbon 300 Mesh Ni rasters uit de kist met een antistatische Tang, plaats op een porseleinen multi goed plaat en drop 10 µL van HA, CA en FA schorsingen op de rasters.</li>
		<li>Het drogen van de monsters gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voorbereiding van de rust en gestimuleerd cellen voor het insluiten van 26<ol>
<li>Medium van de celculturen verzamelen en wassen van de cellen met fysiologische desensibilisatie (PD), medium (125 mM NaCl, 5 mM KCL, 10 mM, NaHCO3, 1 mM KH2PO4, 10 mM glucose, 20 mM HEPES, pH 7.4).</li>
		<li>Het herstellen van de cellen met 5 mL van een mengsel van 3% (g:100 mL) paraformaldehyde/1% (g:100 mL) Glutaaraldehyde in 100 mM natrium fosfaatbuffer, pH 7,2, gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder de zuurkast.</li>
		<li>Spoel de cellen met 5 mL 100 mM natriumfosfaat buffer en zachtjes de buffer te verwijderen na het wassen.</li>
		<li>Postfix in de donkere kamer, de monsters met 2 mL van de 1% (g:100 mL) osmium tetroxide in 100 mM natrium fosfaatbuffer, pH 7,2, gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur onder de zuurkast.</li>
		<li>Osmium tetroxide verwijderen en gebruiken.</li>
		<li>Wassen van de cellen met 5 mL 100 mM natriumfosfaat buffer.</li>
		<li>Vervolgens het uitdrogen van de monsters in 5 mL aliquots van een gesorteerde ethanol oplossing reeks bij kamertemperatuur: 25% (vol.) voor 5 min 50% (vol.) gedurende 10 minuten, 75% (vol.) gedurende 15 minuten, 90% (vol.) voor 20 min. Ten slotte absolute ethanol twee keer toepassen en incubeer gedurende 30 min en 12u.</li>
		<li>Mechanisch schrapen van de cellen van de plastic petrischaaltjes voor cultuur, verzamelen in kunststof microcentrifuge buizen en centrifugeren van de monsters bij 130 x g gedurende 1 minuut.</li>
		<li>Verwijder het supernatant en opschorten van de cellen in 1 mL van een mengsel van de LR White hars en absolute ethanol op een volumeverhouding 1:2.</li>
		<li>Meng goed de inhoud van de glazen buizen voor gebruik en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Centrifugeer de monsters bij 130 x g gedurende 1 minuut.</li>
		<li>Verwijder het supernatant en herhaal de vorige stap met behulp van 1 mL van een mengsel van 1:1 van LR White hars en absolute ethanol.</li>
		<li>Meng goed en laat 30 minuten bij kamertemperatuur inwerken.</li>
		<li>Centrifugeer de monsters bij 130 x g gedurende 1 minuut.</li>
		<li>Verwijder het supernatant.</li>
		<li>Ten slotte, voeg 1 mL pure LR wit hars aan de monsters tweemaal en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in plastic buizen.</li>
		<li>Plaats 500 µL van elk monster in gelatine capsules. Opmerking: De monsters worden aangeduid met behulp van een klein vel papier en een potlood zodat de hars niet van de etiketten vernietigen doet.</li>
		<li>Sluit de gelatine capsules, zet hen in kunststof microcentrifuge buizen en centrifugeer bij 130 x g voor 1 min in de rotor van een swing-out.</li>
		<li>Verwijder de capsules van de plastic buizen met behulp van een vacuümpomp.</li>
		<li>De monsters naar de oven en polymeriseren bij 56 ° C gedurende 48 uur.</li>
		<li>Bereid de blokken door hen in de houder montage- en trimmen hen naar de piramide.</li>
		<li>Zet de houder in de ultramicrotome, hechten de diamond Ultra 45° mes en vul deze met gedeïoniseerd water; denk er aan het mes van incidentele luchtbellen.</li>
		<li>Knip secties (700 Å) met behulp van het mes van de diamant op het gedeïoniseerd waterbad.</li>
		<li>De restjes met behulp van boviene wimper en plaats die ze op de glanzende zijde van de Formvar/Carbon 300 mesh Ni raster instellen en droog ze af.</li>
		<li>Bereiden van 2,5% (vol.) uranyl acetaat in absolute ethanol in het donker in een zuurkast. Houd de uranyl-acetaat in een container van lood en vergeet niet te halen van het sediment.</li>
		<li>Counterstain in de donkere kamer, de rasters van synthetische apatites en celsteekproeven met 2,5% (vol.) uranyl acetaat in ethanol gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur onder de zuurkast.</li>
		<li>De rasters in 50% ethanol (door vol.), vervolgens in gedeïoniseerd water wassen en drogen bij kamertemperatuur gedurende 24 uur. Ten slotte zet de rasters in het vak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. TEM-EDX analyse
<ol><li>TEM beeldvorming door een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) uitgerust met volledige reeks Energy Dispersive X-ray Microanalyse (EDX) systeem en 11 Megapixel camera<ol>
<li>De houder van een beryllium voorbereiden op de waarneming van mineralen en cellen. Antistatische hulpmiddelen gebruiken.</li>
		<li>Het paar van schroeven verwijderen en til de beryllium plaat en beryllium wasmachine weg van de rest van de retainer.</li>
		<li>Monteer het raster, de glanzende zijde, op de houder.</li>
		<li>Zorgvuldig plaatst de beryllium wasmachine en beryllium plaat en schroef de schroeven stevig vast.</li>
		<li>Zet de houder in de Vacuuemcel en zet de vacuümpomp.</li>
		<li>Zodra een vacuüm is bereikt, zachtjes de houder aansluit op de imaging kamer en inschakelen van de lichtbundel.</li>
		<li>Stel de diafragma-parameters van de Microscoop op de fluorescerende monitor. Uitvoeren van beeld astigmatisme correctie; instellen van de zoom, focus en frame; en nemen van beelden van de TEM bij een vergroting van 50, 000 X.</li>
	</ol>
</li>
	<li>STAM beeldvorming en X-ray Microanalyse spectrale en compositorische p.a.<ol>
<li>De energie dispersieve x-stralen (EDX) detector invoegen de scannen imaging zaal van de transmissie-elektronenmicroscopie (STEM).</li>
		<li>De scherpte van de afbeelding in de focus-modus instellen.</li>
		<li>STAM beelden nemen bij een vergroting van 15 000 X.</li>
		<li>Selecteer een punt in de steekproef voor X-ray Microanalyse en verzamelen van spectra.</li>
		<li>Verkrijgen van gegevens langs de optelling van alle atoommassa voor alle elementen van het periodiek in de steekproef (als 100%) en de inhoud van de geselecteerde elementen betekenende: Ca, F, Cl en P (in atomaire %). Vervolgens berekenen de ratio's van Ca, F of Cl tot P voor elk monster.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ion toewijzing<ol>
<li>Selecteer elementen zoals calcium, fluor, chloor en fosfor ion toewijzing maken en uitvoeren van EDX kaarten van de geselecteerde elementen in de monsters.</li>
		<li>Verkrijgen van gegevens door aan te geven van de lokalisatie van de geanalyseerde elementen: Ca, F, Cl en P (in atomaire %) en de co lokalisatie (in %) van de Ca, F of Cl met P voor elk monster te berekenen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Buckwalter, J. A., Cooper, R. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3325555">Bone structure and function.</a> Instr. Course Lect. 36, 27-28 (1987).</li>
<li>Anderson, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+matrix+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of matrix vesicles.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 314, 266-280 (1995).</li>
<li>Anderson, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+vesicles+and+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Matrix vesicles and calcification.</a> Curr Rheumatol. 5 (3), 222-226 (2003).</li>
<li>Bolean, M., Simão, A. M. S., Barioni, M. B., Favarin, B. Z., Sebinelli, H. G., Veschi, E. A., Janku, T. A. B., Bottini, M., Hoylaerts, M. F., Itri, R., Millán, J. L., Ciancaglini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+aspects+of+biomineralization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rev%22%5BJournal%5D)">Biophysical aspects of biomineralization.</a> Biophys Rev. 9 (5), 747-760 (2017).</li>
<li>Bottini, M., Mebarek, S., Anderson, K. L., Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Simão, A. M. S., Bolean, M., Ciancaglini, P., Bandorowicz Pikula, J., Pikula, S., Magne, D., Volkmann, N., Hanein, D., Millán, J. L., Buchet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+vesicles+from+chondrocytes+and+osteoblasts%3A+Their+biogenesis%2C+properties%2C+functions+and+biomimetic+models%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Matrix vesicles from chondrocytes and osteoblasts: Their biogenesis, properties, functions and biomimetic models.</a> Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 532-546 (2018).</li>
<li>Hessle, L., Johnson, K. A., Anderson, H. C., Narisawa, S., Sali, A., Goding, J. W., Terkeltaub, R., Millan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-nonspecific+alkaline+phosphatase+and+plasma+cell+membrane+glycoprotein-1+are+central+antagonistic+regulators+of+bone+mineralization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Tissue-nonspecific alkaline phosphatase and plasma cell membrane glycoprotein-1 are central antagonistic regulators of bone mineralization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (14), 9445-9449 (2002).</li>
<li>Garimella, R., Bi, X., Anderson, H. C., Camacho, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+of+phosphate+substrate+as+a+major+determinant+of+mineral+type+formed+in+matrix+vesicle-mediated+in+vitro+mineralization%3A+An+FTIR+imaging+study%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Nature of phosphate substrate as a major determinant of mineral type formed in matrix vesicle-mediated in vitro mineralization: An FTIR imaging study.</a> Bone. 38 (6), 811-817 (2006).</li>
<li>Thouverey, C., Bechkoff, G., Pikula, S., Buchet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inorganic+pyrophosphate+as+a+regulator+of+hydroxyapatite+or+calcium+pyrophosphate+dihydrate+mineral+deposition+by+matrix+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthr.+Cartil%22%5BJournal%5D)">Inorganic pyrophosphate as a regulator of hydroxyapatite or calcium pyrophosphate dihydrate mineral deposition by matrix vesicles.</a> Osteoarthr. Cartil. 17, 64-72 (2009).</li>
<li>Terkeltaub, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inorganic+pyrophosphate+generation+and+disposition+in+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Phys%22%5BJournal%5D)">Inorganic pyrophosphate generation and disposition in pathophysiology.</a> Am. J. Phys. 281 (1), 1-11 (2001).</li>
<li>Guicheux, J., Palmer, G., Shukunami, C., Hiraki, Y., Bonjour, J. P., Caverzasio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vitro+culture+system+for+analysis+of+functional+role+of+phosphate+transport+in+endochondral+ossification%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">A novel in vitro culture system for analysis of functional role of phosphate transport in endochondral ossification.</a> Bone. 27 (1), 69-74 (2000).</li>
<li>Yadav, M. C., Bottini, M., Cory, E., Bhattacharya, K., Kuss, P., Narisawa, S., Sah, R. L., Beck, L., Fadeel, B., Farquharson, C., Millán, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+mineralization+deficits+and+impaired+biogenesis+and+function+of+chondrocyte-derived+matrix+vesicles+in+Phospho1%28-%2F-%29+and+Phospho1%2FPi+t1+double-knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Miner.+Res%22%5BJournal%5D)">Skeletal mineralization deficits and impaired biogenesis and function of chondrocyte-derived matrix vesicles in Phospho1(-/-) and Phospho1/Pi t1 double-knockout mice.</a> J. Bone Miner. Res. 31 (6), 1275-1286 (2016).</li>
<li>Thouverey, C., Malinowska, A., Balcerzak, M., Strzelecka-Kiliszek, A., Buchet, R., Dadlez, M., Pikula, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+biogenesis+and+functions+of+matrix+vesicles+released+from+mineralizing+human+osteoblast-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of biogenesis and functions of matrix vesicles released from mineralizing human osteoblast-like cells.</a> J. Proteome. 74 (7), 1123-1134 (2011).</li>
<li>Wang, W., Xu, J., Kirsch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin-mediated+Ca2%2B+influx+regulates+growth+plate+chondrocyte+maturation+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Annexin-mediated Ca2+ influx regulates growth plate chondrocyte maturation and apoptosis.</a> J. Biol. Chem. 278 (6), 3762-3769 (2003).</li>
<li>Nollet, M., Santucci-Darmanin, S., Breuil, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+osteoblasts+is+involved+in+mineralization+and+bone+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy in osteoblasts is involved in mineralization and bone homeostasis.</a> Autophagy. 10 (11), 1965-1977 (2014).</li>
<li>Boonrungsiman, S., Gentleman, E., Carzaniga, R., Evans, N. D., McComb, D. W., Porter, A. E., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+intracellular+calcium+phosphate+in+osteoblast-mediated+bone+apatite+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">The role of intracellular calcium phosphate in osteoblast-mediated bone apatite formation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (35), 14170-14175 (2012).</li>
<li>Genge, B. R., Wu, L. N., Wuthier, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+modeling+of+matrix+vesicle+nucleation%3A+synergistic+stimulation+of+mineral+formation+by+annexin+A5+and+phosphatidylserine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">In vitro modeling of matrix vesicle nucleation: synergistic stimulation of mineral formation by annexin A5 and phosphatidylserine.</a> J. Biol. Chem. 282 (36), 26035-26045 (2007).</li>
<li>Jahnen-Dechent, W., Schäfer, B., Ketteler, M., McKee, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mineral+chaperones%3A+a+role+for+fetuin-A+and+osteopontin+in+the+inhibition+and+regression+of+pathologic+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Med.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Mineral chaperones: a role for fetuin-A and osteopontin in the inhibition and regression of pathologic calcification.</a> J. Mol. Med. (Berl). 86 (4), 379-389 (2008).</li>
<li>Suchanek, W., Yoshimura, M. <a target="_blank" href="http://adsabs.harvard.edu/abs/1998JMatR..13...94S">Processing and properties of hydroxyapatite-based biomaterials for use as hard tissue replacement implants.</a> J. Miner. Res. 13 (1), 94-117 (1998).</li>
<li>Pautke, C., Schieker, M., Tischer, T., Kolk, A., Neth, P., Mutschler, W., Milz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+osteosarcoma+cell+lines+MG-63%2C+Saos-2+and+U-2+OS+in+comparison+to+human+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of osteosarcoma cell lines MG-63, Saos-2 and U-2 OS in comparison to human osteoblasts.</a> Anticancer Res. 24 (6), 3743-3748 (2004).</li>
<li>Yen, M. -L., Chien, C. -C., Chiu, I. -M., Huang, H. -I., Chen, Y. -C., Hu, H. -I., Yen, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+differentiation+and+characterization+of+the+human+fetal+osteoblastic+1.19+cell+line%3A+a+possible+in+vitro+model+of+human+mesenchymal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Multilineage differentiation and characterization of the human fetal osteoblastic 1.19 cell line: a possible in vitro model of human mesenchymal progenitors.</a> Stem Cells. 25 (1), 125-131 (2007).</li>
<li>Brittle, S. W., Foose, D. P., O'Neil, K. A., Sikon, J. M., Johnson, J. K., Stahler, A. C., Ryan, J. D., Higgins, S. R., Sizemore, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+raman-based+imaging+method+for+characterizing+the+molecular+adsorption+and+spatial+distribution+of+silver+nanoparticles+to+hydrated+mineral+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">A raman-based imaging method for characterizing the molecular adsorption and spatial distribution of silver nanoparticles to hydrated mineral surfaces.</a> Environ Sci Technol. , (2018).</li>
<li>Liu, N., Wang, Y., Ge, F., Liu, S., Xiao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+effect+of+nano-ZnO+and+cetyltrimethyl+ammonium+chloride+on+the+growth+of+Chlorella+vulgaris%3A+Dissolution+and+accumulation+of+nano-ZnO%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Antagonistic effect of nano-ZnO and cetyltrimethyl ammonium chloride on the growth of Chlorella vulgaris: Dissolution and accumulation of nano-ZnO.</a> Chemosphere. 196, 566-574 (2018).</li>
<li>Tasbihi, M., Kočì, K., Troppová, I., Edelmannová, M., Reli, M., Čapek, L., Schomäcker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocatalytic+reduction+of+carbon+dioxide+over+Cu%2FTiO2+photocatalysts%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Pollut+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Photocatalytic reduction of carbon dioxide over Cu/TiO2 photocatalysts.</a> Environ Sci Pollut Res Int. , (2017).</li>
<li>Chen, N. X., O'Neill, K. D., Chen, X., Moe, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin-Mediated+Matrix+Vesicle+Calcification+in+Vascular+Smooth+Muscle+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Miner.+Res%22%5BJournal%5D)">Annexin-Mediated Matrix Vesicle Calcification in Vascular Smooth Muscle Cells.</a> J. Bone Miner. Res. 23 (11), 1798-1805 (2008).</li>
<li>Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+minerals+in+vesicles+produced+by+human+osteoblasts+hFOB+1.19+and+osteosarcoma+Saos-2+cells+stimulated+for+mineralization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Inorg.+Bioch%22%5BJournal%5D)">Characteristics of minerals in vesicles produced by human osteoblasts hFOB 1.19 and osteosarcoma Saos-2 cells stimulated for mineralization.</a> J. Inorg. Bioch. 171, 100-107 (2017).</li>
<li>Thouverey, C., Strzelecka-Kiliszek, A., Balcerzak, M., Buchet, R., Pikula, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+vesicles+originate+from+apical+membran%C4%99+microvilli+of+mineralizing+osteoblast-like+Saos-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Matrix vesicles originate from apical membranę microvilli of mineralizing osteoblast-like Saos-2 cells.</a> J. Cell. Biochem. 106 (1), 127-138 (2009).</li>
<li>Cazalbou, S., Eichert, D., Ranz, X., Drouet, C., Combes, C., Harmand, M. F., Rey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+exchanges+in+apatites+for+biomedical+application%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Sci.+Mater.+Med%22%5BJournal%5D)">Ion exchanges in apatites for biomedical application.</a> J. Mater. Sci. Mater. Med. 16 (5), 405-409 (2005).</li>
<li>Kraus, D. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1179/2047480613Z.000000000181?journalCode=ymew20">Consolidated data analysis and presentation using an open-source add-in for the Microsoft Excel® spreadsheet software.</a> Med. Writ. 23 (1), 25-28 (2014).</li>
<li>Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomineralization+in+humans%3A+making+the+hard+choices+in+life%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Biomineralization in humans: making the hard choices in life.</a> Annu. Rev. Genet. 43, 119-142 (2009).</li>
<li>Bonucci, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22201735">Bone mineralization.</a> Front. Biosci. 17, 100-128 (2012).</li>
<li>Veis, A., Dorvee, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomineralization+mechanisms%3A+A+new+paradigm+for+crystal+nucleation+in+organic+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Calcif.+Tissue+Int%22%5BJournal%5D)">Biomineralization mechanisms: A new paradigm for crystal nucleation in organic matrices.</a> Calcif. Tissue Int. 93 (4), 307-315 (2013).</li>
<li>Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A., Sone, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+collagen+biomineralization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro models of collagen biomineralization.</a> J. Struct. Biol. 183 (2), 258-269 (2013).</li>
<li>Alliston, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4134366/">Biological regulation of bone quality.</a> Curr. Osteoporos. Rep. 12 (3), 366-375 (2014).</li>
<li>Wang, W., Kirsch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+stimulates+annexin-mediated+growth+plate+chondrocyte+mineralization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid stimulates annexin-mediated growth plate chondrocyte mineralization.</a> J. Cell Biol. 157 (6), 1061-1069 (2002).</li>
<li>Wang, W., Xu, J., Kirsh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+V+and+terminal+differentiation+of+growth+plate+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Annexin V and terminal differentiation of growth plate chondrocytes.</a> Exp. Cell Res. 305 (1), 156-165 (2005).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen conflict van belang hebben.

In het huidige document, beschreven we de protocollen voor AR-S kleuring, UV licht identificatie van fluorapatiet en TEM-EDX in vitro beeldvorming van MVs uitgebracht door mineralizing cellen en mineralen geproduceerd door MVs. Het is mogelijk om alle methodes hierboven vermeld door sommige gemeenschappelijke stappen voor probleemoplossing te volgen. Met het oog op een optimale resultaten, moeten verschillende kritische stappen zorgvuldig worden uitgevoerd. Eerst, is het beter om toe te voegen AA (die i...

Bot is een soort bindweefsel bestaat uit twee delen: organische (cellen en collageenvezels) en mineralen (calcium en fosfaat verbindingen). De belangrijkste minerale componenten in botten zijn apatites1. Verschillende soorten mineralisatie-bevoegde cellen in bot (botcellen), tanden (odontoblasts) en kraakbeen (chondrocyten) regelen de eerste stappen van mineralisatie door de productie van eiwitten van de extracellulaire matrix (ECM) en het vrijgeven van matrix blaasjes (MVs) (Figuur 1). MVs zijn 100-300 nm diameter blaasjes die zich ophopen van calcium en fosfaat te vergemakkelijken apatiet nucleatie en vervolgens binden aan collageen2,3. Vervolgens desintegreren MVs om apatites aan het extracellulaire medium vrij te geven. De apatites blijven groeien in het contact met de collageenvezels en vormen de bot-matrix. De mineralisatie is opgelopen door de constante aanvoer van Pik en Ca2 + in het extracellulaire medium. Sommige onlangs gepubliceerde gegevens ondersteunen onze model4,5. Zachte weefsels doen niet mineralize onder fysiologische omstandigheden. Ectopische verkalking kan zich echter voordoen onder pathologische omstandigheden zoals vasculaire verkalking3. Vasculaire cellen die het osteoblast fenotype verwerven kunnen produceren MVs dat induceren nucleatie van apatites en initiëren van mineralisatie in de mediale en intima lagen van de wand van de bloedvaten. Sinds ectopische verkalking lijken op normale endochondral mineralisatie3, inzicht in de moleculaire mechanismen van mineralisatie van ossaal cellen en chondrocyten dienen enkele aanwijzingen op ectopische verkalking van de zachte weefsels die gevormd.
De ontwikkeling van het skelet weefsels wordt geregeld door verschillende enzymen, groeifactoren, en initiatiefnemers of remmers van mineralisatie. De antagonistische actie van weefsel-nonspecific alkalisch fosfatase (TNAP) (Figuur 1) en ectonucleotide pyrophosphatase/fosfodiësterase ik (NPP1), samen met ankyrin (ANK), besturingselementen concentratie van de anorganische pyrofosfaat (PPik) 6. PPik, een krachtige remmer van HA formatie, is gehydrolyseerd door TNAP; NPP1 ontstabiel nucleotide trifosfaat tot PPik terwijl ANK uitvoer PPik uit de cel aan de ECM. De Pi/PPi verhouding kan reguleren apatiet vorming7,8 met mogelijke gevolgen van de pathologische9.
De MV membraan is verrijkt met ion vervoer eiwitten die het eerste neerslaan van calcium en fosfaat binnen de MVs tijdens de nucleatie (Figuur 1 vergemakkelijken). De fosfaat transporter 1 (PiT) helpt te nemen Pik gegenereerd in de perivesicular ruimte in de MVs10,11. Annexins kan worden betrokken in het bindende en vervoeren van Ca2 + en de biofysische proces waarmee mineralisatie in de MV lumen12,13. Wij keuren de hypothese, eerder voorgesteld voor mineralisatie binnen intracytoplasmatische blaasjes van interne nucleatie van apatiet binnen de MV voordat de vermeerdering in de ECM14,15. In vitro modellering bevestigd de inductie van Ca2 +/Pik complexen vorming in proteoliposomes gemaakt van PS en AnxA516. Dit kan erop duiden dat accumulatie van Ca2 +, Pi, AnxA5 en PS complexen in lipide vlotten van de microvilli-achtige membranesrepresent de nucleatie kern (NC) van apatiet binnen MVs. Annexins en TNAP bezitten ook collageen-bindende capaciteiten die nuttig zijn in het plaatsen van MVs langs collageenvezels en bij het stimuleren van de verspreiding van mineralisatie in de ECM kunnen zijn. Fetuin A en osteopontin (OPN)17, staan bekend als remmers van apatiet formatie die de verspreiding van mineralisatie op de collagene steiger kan vertragen. Nucleatie en vermeerdering zijn verschillende evenementen, de voormalige voorafgaand aan de laatste, en beide relevant kunnen zijn voor het proces van pathologische mineralisatie.
Om te ontdekken hoe de chemie van calciumfosfaat complexen fysiologische mineralisatie en ectopische verkalking kan veranderen, is het noodzakelijk om te identificeren van de mineralen geproduceerd door cellen. Apatites zijn een groep van calcium en fosfaat met mineralen met de algemene crystal eenheid cel Ca formule10(PO4)6X2, waarbij X = Cl, F, OH. Ze worden geclassificeerd als volgt18: fluorapatiet (FA) Ca10(PO4)6F2, chlorapatite (CA) Ca10(PO4)6Cl2 en hydroxyapatiet (HA) Ca10(PO4 )6(OH)2.
De keuze van osteoblast cellijnen voor het opwekken van minerale vorming is van cruciaal belang, aangezien elke cellijn een duidelijk profiel van mineralisatie vertoont. In dit verslag, vergeleken we de nucleatie van mineralen door twee geselecteerde menselijke cel modellen van mineralisatie: osteoblastic hFOB 1.19 cellen en Osteosarcoom Saos-2 cellen. Osteosarcoom-afgeleide cellen worden vaak gebruikt als osteoblastic modellen en Saos-2 cellen zijn de meest volwassen osteoblastic teken19 bewaard terwijl ongedifferentieerde menselijke foetale hFOB cellen veel als een model voor de normale osteoblastic gebruikt worden differentiatie20. Hun mineralisatie profielen werden geanalyseerd door verschillende methoden: Alizarine Red-S (S-AR) kleuring, ultraviolet (UV) licht visualisatie, Transmissie Electronenmicroscopie (TEM) imaging, energie dispersieve x-stralen Microanalyse (EDX) kwantificatie en ion in kaart brengen. Het voordeel van de TEM-EDX over alternatieve technieken die worden gebruikt in eerdere studies is dat het kwantitatieve en kwalitatieve resultaten van ion vervanging in apatiet kristallen4,5,21geeft. Het algemene doel van het gebruik van de TEM-EDX was te vinden van een eenvoudige methode voor beeldbewerking en kwantificering van de verdeling van de Ca, F en Cl-ionen in verschillende mineralen uit verschillende soorten cellen tijdens de verschillende fasen van het proces van mineralisatie. Deze methode is met succes gebruikt, bijvoorbeeld voor het toezicht op de interactie van zink nanodeeltjes met naast elkaar bestaande chemische stoffen en hun gecombineerde effecten op aquatische organismen22. In een andere studie, een koperen photocatalyst op titanium materialen in waterige oplossing werd uitgebreid gekenmerkt door middel van inductief gekoppeld plasma optische-emissiespectrometrie (ICP-OES), N2 physisorption (inzet), XRD, UV-vis DRS, FT-IR, Raman spectroscopie, TEM-EDX en photoelectrochemical metingen23. Ons doel was om te vergelijken van de herkomst en eigenschappen van blaasjes en mineralen in twee cellijnen te begrijpen van het mechanisme waarmee mineralisatie tijdens werden differentiatie.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57423/57423fig1.jpg"> Figuur 1 . Regeling van de eerste stappen van mineralisatie in werden cellen waarbij de synthese van de extracellulaire matrix (ECM) eiwitten en vrijlating van matrix blaasjes (MVs) van de membraan. MVs accumuleren calcium door de werking van calcium bindende proteïnen, annexins en fosfaat, door de werking van een anorganisch fosfaat transporter (PiT) gevolgd door de activiteit van weefsel aspecifieke alkalisch fosfatase (TNAP), die dephosphorylates PPik om Pik, teneinde apatiet nucleatie. Vervolgens MVs desintegreren en vrij van apatites aan het extracellulaire medium. De mineralisatie is opgelopen door de constante aanvoer van Pik en Ca2 + in de extracellulaire middellange4,5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57423/57423fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

<table><tbody><tr><td>Reagens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ham&rsquo;s DMEM/F12 media mixture</td><td>PAA</td><td>E15-813</td><td>1:1, voor menselijke foetus hFOB 1.19 SV40 large T antigeen getransfecteerde osteoblasten (ATCC CRL-11372)</td></tr><tr><td>McCoy&rsquo;s 5A medium</td><td>PAA</td><td>E82312-0025</td><td>voor menselijke osteosarcoom Saos-2 cellen (ATCC HTB-85)</td></tr><tr><td>Antibiotica mengsel (penicilline/streptomycine)</td><td>Sigma</td><td>P0781-100ML</td><td>100 U/mL elk</td></tr><tr><td>G-418</td><td>Sigma</td><td>68168</td><td>0.3 mg/mL</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>10% voor hFOB 1.19 en 15% voor Saos-2</td></tr><tr><td>AA</td><td>Sigma</td><td>A-5960</td><td>50 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>&szlig;-GP</td><td>Sigma</td><td>G9422-100G</td><td>7.5 mM</td></tr><tr><td>Bio-Gel HTP Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>130-0420</td><td>voor HA</td></tr><tr><td>FA</td><td></td><td></td><td>gesynthetiseerd door ons</td></tr><tr><td>CA</td><td></td><td></td><td>gesynthetiseerd door ons</td></tr><tr><td>Natriumfosfaatbuffer Na2HPO4/NaH2PO4 mengsel</td><td>Sigma</td><td>S7907/S8282</td><td>0.1 M, pH 7.2</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>pH 7.0, bereid door ons</td></tr><tr><td>AR-S in PBS</td><td>Sigma</td><td>A5533-25G</td><td>0.5 g/100 mL, pH 5.0</td></tr><tr><td>Collageenase type IA</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>500 U/mL</td></tr><tr><td>SCL buffer</td><td></td><td></td><td>bereid door ons</td></tr><tr><td>Deionized water</td><td></td><td></td><td>geproduceerd door ons</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>POCh</td><td>BA6480111</td><td>absoluut 99.8% en oplossingen 25, 50, 75, 90%</td></tr><tr><td>Uranyl acetaat in 50% ethanol</td><td>Polysciences Inc.</td><td>21447-25</td><td>0.25 g/10 mL</td></tr><tr><td>PD medium</td><td></td><td></td><td>pH 7.4, bereid door ons</td></tr><tr><td>Fixatie mengsel (paraformaldehyde/glutaaraldehyde)</td><td>Sigma</td><td>158127/G-6257</td><td>3%:1%</td></tr><tr><td>Post-fixatie OsO4</td><td>Sigma</td><td>75633</td><td>1%</td></tr><tr><td>LR White hars in ethanol</td><td>Polysciences Inc.</td><td>17411-MUNC 500g</td><td>1:2, 1:1, 100%</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>CHEMPUR</td><td>111024800</td><td>puur</td></tr><tr><td>Gereedschap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryogene vials</td><td>Corning Inc.</td><td>430487</td><td>1.2 mL</td></tr><tr><td>Kunststof Petri-kweekschalen</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>100 mm</td></tr><tr><td>Kunststof buizen</td><td>Falcon</td><td>352096 en 352070</td><td>15 en 50 mL</td></tr><tr><td>Serologische pipetten</td><td>Falcon en VWR</td><td>357521 en 612-3700</td><td>1 en 10 mL</td></tr><tr><td>Kunststof microcentrifugebuisjes</td><td>Sigma</td><td>Z688312 en Z628034</td><td>1.5 mL zwart en 2 mL transparant</td></tr><tr><td>Kunststof pipettentips</td><td>VWR</td><td>613-0364, 613-0239 en 613-1050</td><td>0.1-10 &micro;L natuurlijk, 1-200 &micro;L geel en 200-1000 &micro;L blauw</td></tr><tr><td>Kunststof rekjes</td><td>Light Labs</td><td>A-7055-Z, A-7053-C</td><td>groen voor buizen, oranje voor microbuisjes en blauw voor TEM-sonde</td></tr><tr><td>Laminair Hera Save</td><td>Thermo Scientific Co.</td><td>KS12</td><td>HEPA-filter (H14 volgens DIN EN 1822)</td></tr><tr><td>Incubators Hera Cell</td><td>Thermo Scientific Co.</td><td>150</td><td>34&deg;C voor hFOB 1.19 en 37&deg;C voor Saos-2</td></tr><tr><td>Dampfabriek</td><td>POLON</td><td>WCS-2</td><td>voor TEM-kleuringen</td></tr><tr><td>Glazen flessen</td><td>SIMAX</td><td>1632414501050 en 1632414501100</td><td>50 en 100 mL</td></tr><tr><td>Kwartsglas buizen</td><td>SIMAX</td><td>638422010100</td><td>&Oslash; 10 mm, L 100 mm</td></tr><tr><td>Pomp</td><td>IBS Integra Biosciences</td><td>VACUSAFE comfort</td><td>voor vacuüm</td></tr><tr><td>Oven</td><td>Memmert</td><td>UNE 400</td><td>56&deg;C</td></tr><tr><td>Porseleinen multi-well plaat</td><td>Rosenthal technik</td><td>229/12</td><td>12 wells</td></tr><tr><td>Glazen bekers</td><td>SIMAX</td><td>632417010025</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>Kunststof flessen</td><td>Pocord</td><td>DIN22</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Kunststof doos</td><td>Agar Scientific Ltd.</td><td></td><td>voor duisternis</td></tr><tr><td>Snap Fit Gelatin Capsules</td><td>Agar Scientific Ltd.</td><td>G3741</td><td>maat 1</td></tr><tr><td>Formvar/Carbon 300 Mesh Ni roosters in doos</td><td>Agar Scientific Ltd.</td><td>S162N3</td><td>film op de glanzende kant</td></tr><tr><td>Siliconen celschraper</td><td>Sigma</td><td>SIAL0010-100EA</td><td>maat 1.8/25 cm</td></tr><tr><td>Spuit met naald</td><td>BogMark</td><td>007</td><td>spuit 1 mL 40 U, naald 0.5 x 16</td></tr><tr><td>Spuit</td><td>Chirana</td><td>CH005L</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>MPW Medical Instruments</td><td>MPW-350R</td><td>130 x g en 500 x g</td></tr><tr><td>UV transluminator</td><td>UVP</td><td>M-20</td><td>voor zichtbaar en UV-licht</td></tr><tr><td>Ultramicrotoom</td><td>LKB</td><td>NOVA</td><td>700&Aring; secties</td></tr><tr><td>Blokhouder</td><td>LKB</td><td>E6711</td><td>ronde vorm</td></tr><tr><td>Diamantmes</td><td>DiATOME</td><td>Ultra 45&deg;</td><td>maat 3</td></tr><tr><td>Oogwenkhouders</td><td></td><td></td><td>runder, bereid door ons</td></tr><tr><td>Pincet</td><td>ROTH</td><td>2855.1</td><td>antistatisch voor roosters</td></tr><tr><td>Spatelset</td><td>ROTH</td><td>E286.1</td><td>antistatisch voor poeders</td></tr><tr><td><

analyse van mineralen geproduceerd door hfob 1.19 en saos-2 cellen met behulp van transmissie electronenmicroscopie met energie dispersieve x-stralen microanalyse

Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis

Deze video presenteert het gebruik van het transmissie-elektronenmicroscopie met energie dispersieve x-stralen Microanalyse (TEM-EDX) te vergelijken de status van mineralen in blaasjes uitgebracht door twee menselijk bot cellijnen: hFOB 1.19 en Saos-2. Deze cellijnen, na behandeling met ascorbinezuur (AA) en β-glycerophosphate (β-GP), ondergaan van volledige osteogenic transdifferentiatie van proliferatie te mineralisatie en produceren van matrix blaasjes (MVs) die leiden tot apatiet nucleatie in de extracellulaire matrix (ECM).
Gebaseerd op Alizarine Red-S (S-AR) kleuring en analyse van de samenstelling van mineralen in cel lysates met behulp van ultraviolet (UV) licht of blaasjes met behulp van TEM imaging gevolgd door EDX kwantificatie en ion mapping, we kunnen afleiden dat Osteosarcoom Saos-2 en osteoblastic hFOB 1.19 cellen onthullen verschillende mineralisatie profielen. Saos-2 cellen efficiënter dan hFOB 1.19 cellen mineralize en produceren van grotere minerale afzettingen die zijn niet zichtbaar onder UV-licht, maar zijn vergelijkbaar met hydroxyapatiet (HA) in dat ze meer Ca en F vervangingen hebben.
De resultaten verkregen met behulp van deze technieken kunnen we concluderen dat het proces van mineralisatie afhankelijk van het celtype verschilt. Wij stellen voor dat, op het cellulaire niveau, de herkomst en eigenschappen van blaasjes vooraf het type van mineralen bepalen.

TEM-EDX zorgt voor de beeldvorming in vitro van matrix blaasjes (MVs) uitgebracht door mineralizing cellen en mineralen geproduceerd door MVs. de resultaten verkregen met behulp van deze techniek laten zien dat het proces van mineralisatie anders kan gaan in verschillende soorten cellen. De twee cellijnen ontvangen dezelfde osteoblastic transdifferentiatie behandeling, maar gestimuleerd Saos-2 cellen gemineraliseerde efficiënter dan hFOB 1.19 botcellen, zoals blijkt uit ...

We presenteren een protocol om te vergelijken de status van mineralen in blaasjes uitgebracht door twee menselijk bot cellijnen: hFOB 1.19 en Saos-2. Hun mineralisatie profielen werden geanalyseerd door Alizarine Red-S (S-AR) kleuring, ultraviolet (UV) licht visualisatie, Transmissie Electronenmicroscopie (TEM) beeldvorming en energie dispersieve x-stralen Microanalyse (EDX).

Analyse van mineralen geproduceerd door hFOB 1.19 en Saos-2 cellen met behulp van Transmissie Electronenmicroscopie met energie dispersieve x-stralen Microanalyse

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in ...

Tijdens de eerste stappen van mineralisatie produceren cellen extracellulaire matrixeiwitten en geven matrixvesicles vrij die calcium en fosfaat accumuleren om apatietnucleatie te vergemakkelijken. In dit rapport vergelijken we de nucleatie van mineralen door twee geselecteerde menselijke celmodellen, osteoblastische hFOB 1.19 en osteosarcoma Saos-2 cellen. Hun mineralisatieprofielen werden geanalyseerd door verschillende methoden.Plaats alle materialen onder de laminaire en steriliseer ze onder UV-licht. Ververs het medium naar 10 milliliter vers kweekmedium met foetaal bovien serum. Rustende cellen worden geïncubeerd zonder stimulatoren, terwijl gestimuleerde cellen worden behandeld met zowel ascorbinezuur als bèta-glycerofosfaat.Laat eerst voorzichtig ascorbinezuur druppelen tot een eindconcentratie van 50 microgram per milliliter op het oppervlak van het kweekmedium om de cellen te stimuleren. Voeg vervolgens bèta-glycerofosfaat toe tot een eindconcentratie van 7,5 millimolair in kweekmedium om de cellen te stimuleren. Roer voorzichtig door de kweekschaal en plaats deze gedurende zeven dagen in de incubator.Na zeven dagen incubatie, spoel de celculturen met fosfaatgebufferd zout (PBS). Voeg vijf milliliter 2% alizarin rood toe en incubeer de plaat gedurende 30 minuten om de mineralen te kleuren. Spoel drie keer met PBS.Voeg voorzichtig PBS toe aan de wand van de schaal. Probeer de mineralen niet te vernietigen. Observeer de mineralen onder een omgekeerde lichtmicroscoop.Verzamel het medium van de celculturen en spoel de cellen met PBS. Verwerk ofwel de rustende of de zeven dagen gestimuleerde cellen met 500 eenheden per milliliter collageenase-oplossing bij 37 graden gedurende drie uur. Schrob vervolgens de cellen mechanisch weg.Breng ze over naar plastic microcentrifugebuisjes. Haal ze tien keer door een spuit. Centrifugeer de monsters bij 500 g gedurende vijf minuten.Gooi het supernatant weg en suspendeer het cellenpelletje in 500 microliter synthetisch kraakbeenlymfe. Breng de hydroxyapatiet, fluorapatiet en chlorapatietpoeders van de flessen over op de UV-transilluminator met een spatel en gebruik ze als controles. Breng de cellysaten van de plastic buisjes over naar de UV-transilluminator met plastic tips en plaats ze voorzichtig op de UV-transilluminator.Suspendeer 2,5 milligram hydroxyapatiet, fluorapatiet en chlorapatietpoeders in 500 microliter gedeïoniseerd water. Incubeer gedurende een uur bij 37 graden. Neem Formvar/koolstofnikkelrooster uit de doos met antistatische pincetten en plaats het op een porseleinen multi-well plaat.Druppel 10 microliter van de hydroxyapatietsuspensie op de roosters. Doe hetzelfde voor chlorapatiet en fluorapatiet. Droog de monsters gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.Bereid rustende en gestimuleerde cellen voor op inbedding. Verzamel medium van de celculturen. Was de cellen in fysiologisch desensibilisatiemedium.Fixeer de cellen met vijf milliliter van een mengsel van 3% paraformaldehyde en 1% glutaraldehyde in 100 millimolair natriumfosfaatbuffer gedurende een uur bij kamertemperatuur onder de dampkap. Was de cellen met vijf milliliter 100 millimolair natriumfosfaatbuffer. Verwijder voorzichtig de buffer na het wassen.In de donkere kamer, postfixeer de monsters met twee milliliter 1% osmiumtetroxide in 100 millimolair natriumfosfaatbuffer. Incubeer de monsters gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur onder de dampkap. Verwijder osmiumtetroxide en gebruik het.Was de cellen met vijf milliliter 100 millimolair natriumfosfaatbuffer. Daarna, dehydrateer de monsters in vijf milliliter aliquoten van een gegradueerde ethanoloplossingserie bij kamertemperatuur, 25, 50, 75 en 90% ethanol. Gebruik ten slotte twee keer absolute ethanol en incubeer gedurende 30 minuten en 12 uur.Schrob de cellen mechanisch van de kweekschotels. Verzamel de cellen in plastic microcentrifugebuisjes. Centrifugeer de monsters bij 130 g gedurende één minuut.Verwijder de supernatanten. Suspendeer de cellen in een mengsel van LR White-hars en absolute ethanol met een volumeverhouding van één tot twee. Meng goed en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.Centrifugeer de monsters bij 130 g gedurende één minuut. Verwijder de supernatanten. Herhaal de vorige stap met een een-op-een mengsel van LR White-hars en absolute ethanol.Meng goed en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer de monsters bij 130 g gedurende één minuut. Verwijder de supernatanten.Voeg pure LR White-hars toe aan de monsters en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur in plastic buisjes. Centrifugeer de monsters bij 130 g gedurende één minuut. Verwijder de supernatanten.Voeg opnieuw pure LR White-hars toe. Plaats 500 microliter van elk monster in gelatinecapsules. Let op, de monsters worden gelabeld met een klein vel papier en een potlood, zodat de hars de labels niet vernietigt.Sluit de gelatinecapsules. Doe de capsules in plastic microcentrifugebuisjes. Centrifugeer bij 130 g gedurende één minuut in een swing-out rotor.Verwijder de capsules van de plastic buisjes met behulp van een vacuümpomp. Verplaats de monsters naar de oven en polymeriseer gedurende 48 uur bij 56 graden. Bereid de blokken voor door ze in de houder te monteren.Plaats de houder in de ultramicrotoom. Bevestig het diamantmes. Vul het met gedeïoniseerd water.Onthoud, maak het mes schoon van de incidentele luchtbelletjes. Snijd vervolgens secties met een diamantmes op het gedeïoniseerd waterbad. Zet de snippers neer met bovien ooghaar.Plaats ze vervolgens op de glanzende kant van het Formvar/koolstofnikkelrooster en droog ze. In de donkere kamer, tegenkleurt de roosters van synthetische apatieten en celmonsters met 2,5% uranylacetaat in ethanol gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur onder dampkap. Was de roosters in 50% ethanol, vervolgens in gedeïoniseerd water en droog ze bij kamertemperatuur gedurende 24 uur.Plaats tenslotte de roosters in de doos. Bereid de berylliumhouder voor voor het observer

analysis-minerals-produced-hfob-119-saos-2-cells-using-transmission

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Hier presenteren we een protocol over hoe de hoeveelheid en verdeling van metalen in een monster kan worden bepaald met behulp van synchrotron X-ray fluorescentie. We richten ons op adherante cellen en beschrijven de chemische fixatiemethode om dit monster voor te bereiden. Vervolgens beschrijven we hoe het monster kan worden gemonteerd en beeldvorming kan worden uitgevoerd met behulp van synchrotron X-stralen.

Het voorbereiden hechtende cellen voor X-stralen fluorescentie beeldvorming door Chemical Fixatie

Het gebruik van energiedispersieve röntgentomografie in de scanning transmissie elektronenmicroscoop om elementaire verdelingen binnen enkele nanodeeltjes in drie dimensies te karakteriseren wordt beschreven.

Energie-dispersieve X-stralen Tomografie voor 3D Elemental kaart brengen van individuele nanodeeltjes

Vanwege het belang en het grootschalige gebruik van palladium, goud en kobalt   metalen in high-tech apparatuur, de terugwinning en recycling vormen een belangrijk industrieel uitdaging. Het metalen recovery systeem hierin beschreven is een eenvoudige, goedkope middelen voor de effectieve opsporing, verwijdering en herstel van deze metalen uit de stedelijke mijne.

Detectie en herstel van Palladium, Goud en Cobalt metalen uit de Urban Mine via innovatieve sensoren / Adsorbentia Aangewezen met nanoschaal Wagon-wheel-vormige poriën

Het fabricageprotocol van een dipool-ondersteunde solid phase extractie microchip voor de traceerbare metalenanalyse wordt gepresenteerd.

Fabricage van een dipool-geassisteerde Solid Phase Extraction Microchip voor Trace Metal Analysis in watermonsters

Beschrijven we een procedure voor de opsporing van chemische elementen aanwezig in situ in menselijke cellen, alsmede hun kwantificering in vitro . De methode is geschikt voor elk celtype en is vooral nuttig voor de kwantitatieve chemische analyses in afzonderlijke cellen na in vitro metaaloxide nanodeeltjes blootstelling.

In Situ Detectie en eencellige kwantificering van metaaloxide nanodeeltjes met behulp van nucleaire Microprobe analyse

Hier, tonen we het gebruik van de X-ray software voor de montage van de fluorescentie, kaarten, gemaakt door Argonne National Laboratory voor de kwantificering van de fluorescentie microscopie gegevens. De gekwantificeerde gegevens die het resultaat is nuttig voor het begrijpen van de elementaire distributie en stoichiometrische verhoudingen binnen een steekproef van belang.

Kwantificeren van Röntgen fluorescentie gegevens met behulp van MAPS

Door in situ vloeistof Scanning elektronen microscopie presenteren we een procedure voor real-time beeldvorming en elementaire samenstelling analyse van böhmiet deeltjes in gedeïoniseerd water.

In Situ Karakterisering van böhmiet deeltjes in het Water met behulp van vloeibare SEM

We beschrijven de instelling van een beamline bedoeld voor het uitvoeren van snelle twee-dimensionale röntgenfoto fluorescentie en x-ray microdiffraction toewijzing van kristallen of poeder monsters met Laue (polychromatische straling) of poeder (monochromatische straling) diffractie. De resulterende kaarten geven informatie over stam, oriëntatie, fase distributie en plastische vervorming.

Synchrotron X-ray Microdiffraction en fluorescentie beeldvorming van minerale en Rock monsters

Analyse van de morfologie, samenstelling en afstand van exsolution lamellen kan essentiële informatie verschaffen om de geologische processen gerelateerd aan vulkanisme en metamorfose te begrijpen. We presenteren een nieuwe toepassing van APT voor de karakterisering van dergelijke lamellen en vergelijken deze benadering met het conventionele gebruik van elektronenmicroscopie en op FIB gebaseerde nano tomografie.

Atom probe tomografie analyse van Uitopgeloste minerale fasen

Hier is een protocol voor celkweek op siliciumnitride membranen en Plunge-bevriezing voorafgaand aan röntgenfluorescentie Imaging met een Synchrotron cryogene X-Ray nanoprobe. Wanneer alleen kamertemperatuur nano-analyse wordt verstrekt, kunnen de bevroren monsters verder gevriesdroogd worden. Dit zijn cruciale stappen om informatie te verkrijgen over de intracellulaire Elemental Composition.

Celkweek op siliciumnitride membranen en Cryopreparation voor Synchrotron X-Ray fluorescentie nano-analyse

We bieden een algemeen overzicht van kwantitatieve microanalysemethoden voor het schatten van de locatiebezetting van onzuiverheden en hun chemische toestanden door gebruik te maken van elektronengeangaliseerde verschijnselen onder incidentele elektronenstraal-schommelomstandigheden, die betrouwbaar informatie extraheren uit minderheidssoorten, lichtelementen, zuurstofvacatures en andere punt/lijn/planaire defecten.

Kwantitatieve atomaire-site analyse van functionele dopants/puntdefecten in kristallijne materialen door elektronengeankan-verbeterde microanalyse

Leer mineralisatieprofielen vergelijken in hFOB 1.19 en Saos-2 botcellijnen met TEM en EDX-microanalyse. Deze methode biedt inzicht in nucleatieprocessen voor botbiologieonderzoek.

Analyse van mineralen geproduceerd door hFOB 1.19 en Saos-2 cellen met behulp van Transmissie Electronenmicroscopie met energie dispersieve x-stralen Microanalyse (Video) | JoVE Journal

Analyse van mineralen geproduceerd door hFOB 1.19 en Saos-2 cellen met behulp van Transmissie Electronenmicroscopie met energie dispersieve x-stralen Microanalyse

Meer video's verkennen