Name: Geautomatiseerde dia scannen en segmentatie in Fluorescently-geëtiketteerden weefsels met behulp van een analysesysteem Widefield High-inhoud (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Leer geautomatiseerde segmentatie van fluorescent gelabelde weefsels met een widefield high-content analysesysteem. Deze methode versnelt de kwantificering van eiwitten in biologische monsters voor biowetenschappelijk onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit project werd gefinancierd door een subsidie van de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek en Alberta innoveert - Health oplossingen/Alberta kanker Foundation. De auteurs willen erkennen de regeneratie in neurobiologie kern faciliteit voor het gebruik van hun apparatuur, het werk van Paula Gedraitis in het gebouw van de stichting waarop dia scannen op de WHCAS werd mogelijk gemaakt, en de maker van de producten in dit artikel genoemde, moleculaire apparaten.

Tumor specimens werden verkregen volgens het protocol goedgekeurd door de Raad van bestuur en ethiek-Commissie van de lokale institutionele beoordeling en uitgevoerd in overeenstemming met nationale regelgeving. De WHCAS en de bijbehorende software gebruikt in dit artikel worden vermeld in de Tabel van materialen.
1. importeren de dagboeken
<ol><li>De bijbehorende software niet openen.</li>
	<li>Download de dagboek suite aangegeven in de Tabel van materialen.</li>
	<li>De suite dagboek naar een geschikte map importeren door te klikken op de rubriek Journal, hoofdmenu Invoer Journal Suite...te selecteren en te klikken op importeren.</li>
</ol>2. maken instellingen voor Preview Scan overname
<ol><li>In plaat overname in het dialoogvenster Instelling , ga naar de doelstelling en Camera tab. Selecteer 4 X als de vergroting, als de camera weggooien, 1en 2 als de winst.</li>
	<li>Voer de instellingen in figuur 1A onder het tabblad plaat – Slidescanning. Opmerking: Deze instellingen zijn gemaakt om de gebruiker te bekijken en navigeren maximaal 3 dia's toe te staan. Elke dia is opgedeeld in 3 aangrenzende putten voor de eenvoudige navigatie en 'live' visualisatie van de segmenten van de weefsels of cellen.</li>
	<li>Vul de putjes gelijkmatig met de sites op het tabblad Sites te bezoeken .</li>
	<li>Klik op Plaat onder instellingen bewerken... en voer de waarden die worden weergegeven in figuur 1B.</li>
	<li>Voer de gewenste golflengte (nucleaire vlek in dit voorbeeld) voor de voorbeeldscan onder het tabblad Overname lus . Voor het beste contrast en de beeld-gebaseerde gericht, het helderste fluorescent signaal (bijvoorbeeld, vaak een nucleaire vlek) te gebruiken. Opmerking: Kleuring weefsels met een heldere vlek zoals een nucleaire vlek wordt aanbevolen, aangezien dit voorziet in een hoog contrast in vergelijking met de achtergrond. Niet alleen zal deze steun op de locatie van de steekproef, maar wanneer meer dan één fluorophore in de volgende hoge vergroting overname imaging, de helderste kleuren worden gebruikt voor de verschuiving van de beeldvorming van de andere kleuren baseren.</li>
	<li>Shading Correction inschakelen in de plaat overname modus aan beelden stik.</li>
	<li>Deze instellingen opslaan als instelling A.</li>
</ol>3. het creëren van instellingen voor dia acquisitie bij hoge vergroting
<ol><li>In plaat overname in het dialoogvenster Instelling , ga naar de doelstelling en Camera tab. Selecteer 40 X als de vergroting, 1 als het weggooien van de camera (voor de hoogste digitale resolutie) en 2 als de winst (voor de verhoging van het signaal en de helderheid van afbeeldingen). Opmerking: Een lagere instelling van objectieve vergroting kan worden gebruikt, maar de auteurs gevonden 40 X als de optimale instelling voor de analyse van menselijke microglia en macrofagen in hersenweefsel van de tumor met behulp van de module Meerdere golflengte cel scoren .</li>
	<li>Controleer alle instellingen voor de tabbladen plaat – Slidescanning en Plaat onder instellingen bewerken... dezelfde als die voor instelling A zijn (zie stap 2).</li>
	<li>Als de beelden verkregen niet knapperig, goed diepte, hoogte van de plaaten Plaat onder instellingen om aan te passen de focus wijzigen. Als er nog steeds een probleem met de focus, kies Laser met terugwinning van de afbeelding onder de sectie Opties voor de Autofocus .</li>
	<li>Voer het aantal golflengtes aanwezig in het monster onder het tabblad Overname lus . Controleer de opties inschakelen laser gebaseerde gericht en inschakelen op basis van installatiekopieën gericht (voor de terugwinning van de verwerving of laser) .</li>
	<li>Selecteer onder het tabblad Autofocus Focus op plaat en goed onder.</li>
	<li>Selecteer de opties in het tabblad tijdschriften zoals aangegeven in Figuur 2, zorgen voor dat voorkoming asynchrone hardware beweegt ook is geselecteerd.</li>
	<li>Deze instellingen opslaan als instelling B.</li>
</ol>4. het plaatsen van de dia in het analysesysteem Widefield High-inhoud
<ol><li>Druk op F4 om het Hoofdmenute krijgen. Selecteer dia scannen. Klik op Open deur-Eject dia en dia('s) en de dia-adapter (die plaats bieden aan maximaal drie dia's) in het WHCAS (figuur 3A en 3B) invoegen. Oriënteren de dia met het dekglaasje aan naar beneden en het label aan de kant van de inkeping in de dia-adapter (figuur 3A). Opmerking: De slides die gebruikt worden in dit experiment waren standaard 25 x 75 x 1 mm dia's.</li>
	<li>Klik op sluiten deur-dia laden.</li>
</ol>5. het verwerven van een voorbeeldscan
<ol><li>Onder de kop Screening Selecteer plaat acquisitie en controle... en Plaat overname Setup... en laden instelling A.</li>
	<li>Verplaats onder het tabblad Wells op bezoek naar het putje met het monster, met behulp van de rechtermuisknop knop op de muis. Onder het tabblad Sites te bezoeken naar verschillende sites met de Live -Fotolader te verplaatsen totdat de cellen bevinden. Handmatig richten op het monster of de Autofocuste gebruiken. Gebruik Snap om het beeld te leggen. Opmerking: Het monster is gemakkelijker te vinden met meer sites, en door het aanbrengen van de sites aan het putje (zie stap 2.3).</li>
	<li>Selecteer Voorvertoning dia'sop het hoofdmenu.</li>
	<li>Selecteer de optie weerspiegelt hoeveel dia's zijn gonna worden gescand in het dialoogvenster dat automatisch verschijnt. Scannen één dia tegelijk. Druk op OK. Selecteer 4 X als de vergroting. Druk op OK. Selecteer dekglaasje aan omlaag (0,17 mm) als de afdrukstand van de dia (gebruik een correctie kraag als de dikte van een verschillende dekglaasje aan wordt gebruikt). Druk op OK. Klik op Doorgaan. Nota: Als de gebruiker wenst te verwerven preview scans voor 2 of meer dia's, moet elke voorbeeldscan voorafgaand aan de overname van de bijbehorende hoge vergroting afbeelding afzonderlijk worden geopend.</li>
	<li>Onder Belasting scannen dia instellingzorgen dat de overname-instellingen en kalibraties selectievakjes zijn ingeschakeld. Druk op Annuleren. Wanneer de Instellingen van de scanner van de dia doos weer verschijnt, selecteert u Doorgaan.</li>
	<li>Wanneer het dialoogvenster Scannen dia wordt weergegeven, pas de instellingen zoals in figuur 4A-4 C. Selecteer sluiten als u klaar bent. Opmerking: Verhoging van de camera weggooien en het verminderen van de camera belichtingstijd zal leiden tot sneller scannen, zij het op een lagere digitale resolutie en dynamisch bereik, respectievelijk, vandaar verkleinen de beeldkwaliteit. Arcering correctie zal zorgen voor een uniforme intensiteit over een enkele gezichtsveld. Draaien op de Hardware en Image Autofocus zorgt de scan is in focus, maar zal vertragen het scannen. In het belang van de tijd te besparen, is het raadzaam om arcering van correctie en de Hardware en de afbeelding Autofocus uit terwijl het verwerven van de lage vergroting scan, maar om deze opties te hebben ingeschakeld voor stap 6 tijdens de hoge vergroting beeldvorming. De resolutie van de scan lage vergroting zal niet van invloed op de resolutie van de scan hoge vergroting.</li>
	<li>Selecteer een map voor de dia scannen van gegevens. Klik op OK. Voer een naam voor het bestand. Klik op OK.</li>
	<li>Het dialoogvenster Tekenen gebied verschijnt automatisch. Gebruik het gereedschap rechthoekig gebied (figuur 5A) om de hele preview scan regio zoals aangegeven in figuur 5Bte selecteren. Klik op Doorgaan.</li>
	<li>In het dialoogvenster Setup voltooid verschijnt. Selecteer Doorgaan. Opmerking: De dia voorbeeldscan zal nu beginnen.</li>
	<li>Wanneer de voorvertoning is voltooid, verschijnt het dialoogvenster Scannen compleet . Selecteer Doorgaan. Sluit het voorbeeldvenster voor de scan niet (in dit voorbeeld de DAPI scannen venster; Zie Figuur 6). Opmerking: De installatie en de lage vergroting scan acquisitie proces duurt ongeveer 20 min. De daaropvolgende hoge vergroting afbeelding Acquisitietijd zal afhangen van het aantal sites gekozen evenals de belichtingstijden voor elk kanaal.</li>
</ol>6. hoge vergroting scannen
<ol><li>Laden instellen van B.</li>
	<li>Bepalen welke wells image worden gemaakt. Verplaats onder het tabblad Wells op bezoek naar het putje met het monster, met behulp van de rechtermuisknop knop op de muis. Opmerking: De techniek is hier gedemonstreerd door imaging goed 1.</li>
	<li>Verplaats naar verschillende sites met de Live -functie totdat het cellen of weefsel bevindt onder het tabblad Sites te bezoeken . Handmatig richten op het monster of de Autofocuste gebruiken. Gebruik Snap om het beeld te leggen. Opmerking: Om te helpen bij het lokaliseren van het monster bij een hoge vergroting, gebruik het dialoogvenster plaat acquisitie en controle om de stap-grootte overal van 5 tot 100 µm te vinden van het monster als Autofocus niet kunt aanpassen.</li>
	<li>Klik onder het tabblad W1 DAPI op Auto bloot. Zorg ervoor dat de Plaat overname Snap - DAPI beeld is scherp.</li>
	<li>Onder het belangrijkste menu, klik op Journal te onthullen van de pull-down. Selecteer Run Journal....</li>
	<li>Dubbelklik op het dagboek van de Schuif regio overname Setup te starten. Wanneer het dialoogvenster Setup schuif regio verwerving wordt weergegeven, selecteert u Doorgaan.</li>
	<li>Wanneer geïnstrueerd, goed Selecteer de DAPI scannen om de lage-vergroting dia-afbeelding te selecteren. Druk op OK. Evenzo benadrukken de plaat overname Snap - DAPI gevraagd voor de plaat acquisitie module. Klik op OK.</li>
	<li>Wanneer verschijnt het maken of laden regio's , gebruik van het gereedschap rechthoekig gebied om te selecteren (a) regio('s) van de rente over de DAPI scannen (Figuur 6). Druk op blijven. Opmerking: Het maximumgebied die kan worden geselecteerd op 40 X is 45 kolommen door 35 rijen. Als er meerdere regio's van belang zijn geselecteerd, zullen de regio's worden aangepast naar het vak met de grootste oppervlakte. De vakken kunnen worden verplaatst na het vergroten/verkleinen.</li>
	<li>Selecteer Nee onder het dialoogvenster Belasting gebieden . Opmerking: Als u het Ja selecteert ladingen eerder opgeslagen regio's voor batches van dia's met dezelfde regio van belang locaties.</li>
	<li>Met het gereedschap Locator Markeer de grootste regio van belang en druk blijven onder het dialoogvenster Gebied selecteren . Als het vak inhoudsgebieden bevestigen verschijnt, selecteert u Doorgaan. Beslissen of de regio worden opgeslagen moet wanneer het dialoogvenster Gebieden opslaan verschijnt.</li>
	<li>Het volgende dialoogvenster Site afstand, kan de gebruiker kiezen naast elkaar, wat in een afbeelding met geen overlapping, of 10% overlappen resulteert. Kies een optie en klik op OK. De auteurs koos naast elkaar.</li>
	<li>Drie dialoogvensters zal nu verschijnen. Het vak Setup voltooid kan worden ontslagen door het indrukken van Doorgaan. Houd het Overname Site opzetten voor 40 X (figuur 7A) geopend voor nu, omdat het maakt duidelijk hoeveel kolommen en rijen moeten worden ingevoerd in het vak van de Plaat overname Setup (figuur 7B). WellPositions het (Figuur 7 c) dat wordt weergegeven in de linkerbenedenhoek open houden voor de duur van de beeldvorming.</li>
	<li>In het vak Plaat overname Setup onder Wells op bezoek, hetzelfde nummer van putten als regio's van belang eerder geselecteerd moet worden gemarkeerd (figuur 7D). Opmerking: De auteurs ontwikkeld dit protocol voor een maximum van negen regio's van de rente per dia. Als er meer, gewoon verhogen het aantal kolommen of rijen op het tabblad van de plaat - SlideScanning aan het aantal regio's van belang. Deze putjes vertegenwoordigen ruimtelijk niet de locatie van de regio's van belang op enigerlei wijze, maar het juiste nummer moet worden gemarkeerd (Klik met de linkermuisknop).</li>
	<li>Ga naar het tabblad Sites te bezoeken . Voer in het vak Plaat overname Setup de voorgestelde kolommen en rijen (figuur 7B). Vergeet niet te klikken op de Tile sites.</li>
	<li>Om te elimineren het giswerk van het vinden van de sites met het monster, drukt u op Verwerven plaat onder het tabblad Samenvatting het podium om bij te plaatsen de vooraf geselecteerde regio van belang. Zodra de camera over een site met cellen pannen, drukt u op Annuleren op de rechter benedenhoek te stoppen met de Beeldacquisitie. Zorgen voor de fase is nu gelegen over het monster.</li>
	<li>Optimaliseer de instellingen van de golflengte om ervoor te zorgen dat een gerichte en een hoog dynamisch bereik beeld wordt verkregen. Wanneer tevreden, klik op het tabblad Samenvatting en Verwerven plaat.</li>
</ol>7. de beeldanalyse
<ol><li>Selecteer de gewenste aangepaste module. Opmerking: De auteurs koos de module Meerdere golflengte cel scoren om aan te tonen van een automatische segmentatie van de hersenen tumor dia's.</li>
	<li>De analyse uitvoeren op alle sites. Als de analyse gebruikte parameters hetzelfde voor meerdere dia's zijn, kan de analyse worden opgenomen in het vak van de Plaat overname Setup onder het tabblad Overname van de Post .</li>
	<li>Zodra de analyse is voltooid, alle sites van slechte beeldkwaliteit om niet de resultaten bias uitsluiten. Aangezien het doel van deze analyse is te kwantificeren microglia en macrofagen in de tumor parenchym, selecteert u de regio van belang binnen de randen van de steekproef van de tumor. Bovendien sluiten de sites die worden onscherp en/of bevatten weefsel plooien of bubbels en tranen in het weefsel. Voor een demonstratie, de Vertegenwoordiger resultatente zien. Ook gebruiken de Laser focus score gegenereerd voor elke site afhankelijk van de amplitude van de reflectie van de laser als een drempel hieronder welke sites moeten worden uitgesloten (de drempel is klantgericht en afhankelijk van de parameters zoals de blootstellingstijd en de soort media gebruikt). Opmerking: De hoge vergroting beelden maken het mogelijk specifiek uitsluiten structuren, zoals de grote bloedvaten en gebieden van necrose, indien nodig. Het is ook mogelijk om alleen gebieden van belang, zoals die hypercellular. Op deze manier kunnen de specificiteit en nauwkeurigheid van de analyses worden verhoogd.</li>
</ol>

<ol><li>Hua, Y., Shun, T. Y., Strock, C. J., Johnston, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+positional+biosensor+screening+assay+for+compounds+to+prevent+or+disrupt+androgen+receptor+and+transcriptional+intermediary+factor+2+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">High-content positional biosensor screening assay for compounds to prevent or disrupt androgen receptor and transcriptional intermediary factor 2 protein-protein interactions.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (7), 395-418 (2014).</li>
<li>Rishal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WIS-NeuroMath+enables+versatile+high+throughput+analyses+of+neuronal+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">WIS-NeuroMath enables versatile high throughput analyses of neuronal processes.</a> Developmental Neurobiology. 73 (3), 247-256 (2013).</li>
<li>Kanungo, J., Lantz, S., Paule, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+and+quantitative+analysis+of+changes+in+axon+length+using+transgenic+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology+and+Teratology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging and quantitative analysis of changes in axon length using transgenic zebrafish embryos.</a> Neurotoxicology and Teratology. 33 (6), 618-623 (2011).</li>
<li>Schurmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+illumina+gene+expression+microarray+data+from+different+tissues%3A+methodological+aspects+of+data+analysis+in+the+MetaXpress+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Analyzing illumina gene expression microarray data from different tissues: methodological aspects of data analysis in the MetaXpress Consortium.</a> PLoS ONE. 7 (12), e50938(2012).</li>
<li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> Journal of Visualized Experiments. (40), e1900(2010).</li>
<li>Bravo-San Pedro, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+quantification+of+GFP-LC3%2B+dots+by+automated+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">High-throughput quantification of GFP-LC3+ dots by automated fluorescence microscopy.</a> Methods in Enzymology. , 71-86 (2017).</li>
<li>Gedraitis, P. Slide Region Acquisition Journal Suite. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&highlight=slide">http://metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&highlight=slide</a> (2013).</li>
<li>Varga, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+multichannel+fluorescent+whole+slide+imaging+and+its+application+for+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Automated multichannel fluorescent whole slide imaging and its application for cytometry.</a> Cytometry Part A. 75 (12), 1020-1030 (2009).</li>
<li>Narayan, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+fibrinogen+extravasation+into+Alzheimer%27s+disease+brain+using+high-content+screening+of+brain+tissue+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Assessing fibrinogen extravasation into Alzheimer's disease brain using high-content screening of brain tissue microarrays.</a> Journal of Neuroscience Methods. 247, 41-49 (2015).</li>
<li>Du, Y., Budman, H. M., Duever, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmentation+and+quantitative+analysis+of+apoptosis+of+Chinese+hamster+ovary+cells+from+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Segmentation and quantitative analysis of apoptosis of Chinese hamster ovary cells from fluorescence microscopy images.</a> Microscopy and Microanalysis. 23 (3), 569-583 (2017).</li>
<li>Mueller, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+segmentation+of+fluorescence+microscopy+images+of+heterogeneous+tissue%3A+application+to+the+detection+of+residual+disease+in+tumor+margins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative segmentation of fluorescence microscopy images of heterogeneous tissue: application to the detection of residual disease in tumor margins.</a> PLoS One. 8 (6), e66198(2013).</li>
<li>Donnelly, D. J., Gensel, J. C., Ankeny, D. P., van Rooijen, N., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+and+reproducible+method+for+quantifying+macrophages+in+different+experimental+models+of+central+nervous+system+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">An efficient and reproducible method for quantifying macrophages in different experimental models of central nervous system pathology.</a> Journal of Neuroscience Methods. 181 (1), 36-44 (2009).</li>
<li>Kozlowski, C., Weimer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+method+to+quantify+microglia+morphology+and+application+to+monitor+activation+state+longitudinally+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An automated method to quantify microglia morphology and application to monitor activation state longitudinally in vivo.</a> PLoS One. 7 (2), e31814(2012).</li>
<li>Fish, K. N., Sweet, R. A., Deo, A. J., Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+segmentation+methodology+for+quantifying+immunoreactive+puncta+number+and+fluorescence+intensity+in+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">An automated segmentation methodology for quantifying immunoreactive puncta number and fluorescence intensity in tissue sections.</a> Brain Research. 1240, 62-72 (2008).</li>
<li>Zock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+high+content+screening+in+life+science+research%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+Chemistry+%26+High+Throughput+Screening%22%5BJournal%5D)">Applications of high content screening in life science research.</a> Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (9), 870-876 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen financiële belangen in de producten die worden beschreven in dit manuscript en hebben niets anders te onthullen.

Een gemeenschappelijk probleem-nog steeds belemmeren de doeltreffendheid van de biologische wetenschap onderzoek is de ontwikkeling van protocollen voor de onpartijdige, nauwkeurige en precieze kwantificering van fluorescently-geëtiketteerden weefsels en hun structuren binnen. Significante hoeveelheid tijd en inspanning is gericht op het vinden van manieren om het analyseren van weefsel dia's, zodra zij hebben al beeld. Veel bestaande methoden bieden algoritmen voor gebruikers opnieuw binnen programma's12,13,14. Deze methoden zijn aanvaardbaar, maar de betekenis van dit verslag is dat het in staat de gebruiker stelt om gemakkelijk en snel een holistische Beeldacquisitie en analyse-protocol als de gebruiker toegang tot een WHCAS heeft. Testen die celtypes te differentiëren en kwantificeren van meerdere structuren en processen, celcyclus analyse en nucleaire translocatie, bijvoorbeeld, zijn reeds beschikbaar in de bijbehorende software.
De installatie bestaat uit een paar kritische stappen. Ten eerste, de ruimtelijke parameters van de dia worden gedefinieerd als ware het een plaat. Ten tweede wordt een lage vergroting overzicht scan gemaakt waaruit de regio's van belang voor hoge vergroting imaging worden geselecteerd. Tot slot, sites die van invloed zijn op de nauwkeurigheid en precisie van latere analyses zijn uitgesloten. De grootste beperking van deze techniek is dat de toepasbaarheid ervan afhangt of de gebruiker toegang tot een WHCAS heeft. Echter, met de toenemende behoefte aan hoge-inhoudsanalyse systemen, veel instellingen verschaffen om hun onderzoekers te blijven concurrerend15. Probleemoplossing nodig is meestal wanneer weefselsecties niet dezelfde dikte hoeft. Als er meerdere regio's van belang zijn geselecteerd, zullen sommigen in focus terwijl anderen niet zullen. Idealiter tijdens afdelen, zou de gebruiker verzorgen om te maken van homogene monsters. Echter, als de monsters zijn inconsistent, de focus op de nucleaire vlek golflengte (of de helderste fluorophore van de gebruiker), die wordt gebruikt om zich te concentreren, kunnen worden aangepast voor elke regio van de out-of-focus van belang en zelfs voor elke gezichtsveld. Zoals de andere golflengten gewoon verschoven ten van de golflengte van de nucleaire vlek opzichte zijn, moet alleen deze golflengte aanpassing.
In dit verslag, we in detail te beschrijven hoe om te scannen en analyseren van dia's met behulp van een WHCAS en bijbehorende software. De multi golflengte cel scoren module kan de gebruiker automatisch tellen alle nucleaire of cytoplasmatische markeringen die fluorescently worden aangeduid. Na het instellen van de focus en bepaling van de cellulaire kenmerken zoals breedte en gebied voor het aanpassen van de module aan het weefsel beeld, is er geen verdere noodzaak voor de tussenkomst van de gebruiker om de verbeelde dia's en kwantitatieve gegevens te verkrijgen. Maximaal drie dia's tegelijk kan worden beeld en meerdere regio's van belang kunnen worden gedefinieerd. Dit protocol laat WHCAS gebruikers die nodig hebben voor het analyseren van de dia's profiteren van aanpasbare, multifunctionele, geautomatiseerde werkstromen die vereisen weinig tot geen optimalisatie en kunnen worden toegepast in alle projecten in de toekomst waarbij de histologische analyse van weefsel.

De nauwkeurige en precieze kwantificatie van fluorescently-geëtiketteerden weefsels op dia's is een zeer gewilde techniek in veel wetenschappelijke gebieden. Echter, onderzoekers vaak handmatig tellen specimens of besteden aanzienlijke bedragen aan tijd aan het ontwikkelen van esoterische geautomatiseerde technieken om dit te bereiken. Hierin bieden we een protocol voor de geautomatiseerde dia scannen en kwantificatie van cellen met behulp van een WHCAS en de bijbehorende software, met aangeboren immuuncellen in bevroren menselijk brein tumor secties als voorbeeld. De bijbehorende software biedt een breed scala aan aanpasbare inbouwmodules van neurite uitgroei tellen tot differentiatie van cel typen1,2,3,4,5, 6. het doel van deze methode is om de onderzoekers te voorzien van een start-tot-einde, gemakkelijk reproduceerbaar protocol bij beelden van verwerven en kwantificeren van fluorescently-geëtiketteerden entiteiten in elke dia gemonteerde weefsels.
In dit protocol, wordt de WHCAS vooral gebruikt voor imaging-platen voor de daaropvolgende analyse van de bijbehorende software ook al een dia-adapter en de grondbeginselen aan dia scannen7 beschikbaar waren. Het was onbetaalbaar op afbeelding dia's omdat de zorgvuldige ruimtelijke kalibratie van het gebied van acquisitie, de selectie van geschikte tijdschriften, het creëren van op maat gemaakte loadouts en een liaison met vertegenwoordigers van het product nodig waren. In de bredere lichaam van literatuur, in plaats van aankoop van een specifieke dia-imaging en analyse apparatuur8, heeft een vorige technologische verslag met toegang tot deze software de Beeldacquisitie van dia's op de WHCAS in totaal9omzeild. Beeldanalyse verwerving of afbeelding uitvoeren op verschillende platformen vereist extra werk om ervoor te zorgen dat elk is compatibel met de andere.
De mogelijkheid om gebruik van de WHCAS en de bijbehorende software voor Fotolader zouden de geen onnodige complicaties van zoekt of ontwikkelen van een werkstroom vreemd deze hulpprogramma's voorkomen. In dit artikel de stappen vereist om een lage vergroting overzicht scan en de bijbehorende hoge vergroting-afbeeldingen maken door de behandeling van de dia als een plaat, en de daaropvolgende analyses met behulp van de module segmentatie multi golflengte cel scoren toestaan voor de herbestemming van de WHCAS. Dit gemakkelijk bruikbaar protocol biedt een voordeel ten opzichte van alternatieve technieken, want er geen noodzaak is om algoritmen of meerdere stappen tellen protocollen10,11 , zodra de afbeeldingen zijn verworven op de WHCAS. Dit protocol vermindert de tijd die nodig is voor het optimaliseren van een kwantificatie techniek, is nauwkeuriger12 en efficiënter dan manuele tellen en maximaliseert het gebruik van de WHCAS. Dit protocol kan worden gemakkelijk en wijd gebruikt aangezien hierdoor de beeldvorming en de analyse van elke fluorescently-geëtiketteerden weefsels op dia's.

<table><tbody><tr><td>ImageXpress MicroXLS</td><td>Molecular Devices</td><td>NA</td><td>Apparaat voor beeldacquisitie</td></tr><tr><td>MetaXpress 5.1</td><td>Molecular Devices</td><td>NA</td><td>Geassocieerde software voor ImageXpress MicroXL (draait op een pc met het Windows-besturingssysteem).</td></tr><tr><td>Slide adapter</td><td>Molecular Devices</td><td>NA</td><td>Metalen diahouder die past in ImageXpress MicroXL</td></tr><tr><td>Slide_Region_Acquisition_revA.jzp</td><td>Molecular Devices</td><td>NA</td><td>Het tijdschrift kan worden verkregen van metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&amp;highlight=slide of door contact op te nemen met een vertegenwoordiger van Molecular Devices</td></tr><tr><td>Slide_Region_Acquisition _Setup.JNL</td><td>Molecular Devices</td><td>NA</td><td>Selecteer dit tijdschrift in stap 6.6.</td></tr></tbody></table>

geautomatiseerde dia scannen en segmentatie in fluorescently-geëtiketteerden weefsels met behulp van een analysesysteem widefield high-inhoud

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Geautomatiseerd dia scannen en segmentatie van fluorescently-geëtiketteerden weefsels is de meest efficiënte manier voor het analyseren van de hele dia's of grote weefselsecties. Helaas, veel onderzoekers besteden grote hoeveelheden van tijd en middelen ontwikkelen en optimaliseren van werkstromen die alleen relevant voor hun eigen experimenten zijn. In dit artikel beschrijven we een protocol dat kan worden gebruikt door degenen met toegang tot een widefield high-inhoudsanalyse systeem (WHCAS) om het imago van elke dia gemonteerde weefsel, met opties voor aanpassing binnen voorgebouwde modules gevonden in de bijbehorende software. Niet oorspronkelijk voorgenomen voor dia scannen, maken de stappen in dit artikel beschreven het mogelijk te verwerven dia scannen afbeeldingen in de WHCAS die kunnen worden geïmporteerd in de bijbehorende software. In dit voorbeeld wordt de automatische segmentatie van hersenen tumor dia's is aangetoond, maar de automatische segmentatie van elke fluorescently-geëtiketteerden nucleaire of cytoplasmatische marker is mogelijk. Verder zijn er een verscheidenheid van andere kwantitatieve softwaremodules, met inbegrip van tests voor eiwit localisatie/translocatie, cellulaire proliferatie/levensvatbaarheid/apoptosis en angiogenese die kunnen worden uitgevoerd. Deze techniek zal onderzoekers tijd en moeite besparen en een geautomatiseerde protocol voor de analyse van de dia maken.

De beelden kunnen worden bekeken in de software van de WHCAS. Figuur 8 toont de hoge vergroting miniaturen van alle sites binnen de gedefinieerde regio van belang. Bekijk elke site ter identificatie van de degenen die worden van de analyse uitgesloten moeten (voorbeelden worden weergegeven bij lage en hoge vergroting in Figuur 8 en Figuur 9, respectievelijk). Bijvoorbeeld, Site 149 is onscherp (figuur 9A), Site-219 heeft bubbels (figuur 9B), en 54 van de Site bevat een vouw (figuur 9C) en dienen te worden uitgesloten. Het is typisch voor het uitsluiten van 10-15% van alle sites beeld. In het voorbeeld, 15,3% van de sites werden uitgesloten (25/300 had bubbels, 17/300 werden onscherp, 3/300 werden gevouwen, en 1/300 was op de rand). Figuur 10 bis is een representatief beeld gekozen voor analyse (de bijbehorende lage vergroting miniatuur wordt weergegeven in Figuur 8). Hier, de bijbehorende overlays gegenereerd door de module meerdere golflengte cel scoren tonen de resultaten van de automatische segmentatie uitgevoerd op Site 59, aangepast aan de auteurs specificaties (kernen minimale breedte = 2,5 µm, maximale breedte = 7,5 µm, en intensiteit boven lokale achtergrond = 35 graylevels; CD11b-positieve cellen minimale breedte = 4 µm, maximale breedte = 18 µm, minimale gekleurd gebied = 15 µm2, en intensiteit boven lokale achtergrond = 310 graylevels; en CD45-positieve cellen minimale breedte = 4 µm, maximale breedte = 18 µm, minimale gekleurd gebied = 15 µm2, en intensiteit boven lokale achtergrond = 50 graylevels). Na de segmentering van de kwantitatieve gegevens het aandeel van cellen kleuring positief voor iedere markeerdraad (6.2 ± 5,1% en 3,8 ± 2,1% van CD11b+ en CD45+ cellen, respectievelijk), beide markeerders (3,5 ± 2,1% CD11b+CD45+ cellen), geen markeringen (86,6 ± 9,0% CD11b-CD45- cellen; Figuur 10B), gemiddelde gekleurd gebied (40.0 ± 9.2 µm en 36.7 ± 7.6 µm van CD11b+ en CD45+ cellen, respectievelijk; Figuur 10 c), en intensiteit van de fluorescentie bedoel (408.9 ± 40,3 relatieve fluorescentie eenheden en 373.9 ± 38,1 relatieve fluorescentie eenheden van CD11b+ en CD45+ cellen, respectievelijk; Figuur 10 d) kan worden verkregen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig1.jpg"> Afbeelding 1: instellingen voor dia acquisitie bij lage vergroting. A. deze afbeelding ziet u de instellingen van de plaat. B. hier worden de instellingen van de onderste plaat weergegeven. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig2.jpg"> Figuur 2: instellingen voor dia acquisitie bij hoge vergroting. Deze figuur toont de selectie van de juiste tijdschriften. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig3.jpg"> Figuur 3: demonstratie over het laden van de dia's met behulp van de dia adapter. A. de dia is geplaatst dekglaasje aan naar beneden met het label aan de kant van de inkeping dia adapter. B. de adapter van de dia in het systeem van de hoge-inhoudsanalyse widefield is geladen. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig4.jpg"> Figuur 4: dia voorbeeldinstellingen. A. dit cijfer worden de parameters voor de verwerving weergegeven. B. hier, worden de waarden voor de Hoescht/DAPI golflengte instellingen weergegeven. C. dit beeld toont de journal-instellingen. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig5.jpg"> Figuur 5: tekening van een dia regio. A. het gereedschap rechthoekig gebied (de andere tekengereedschappen kunnen niet worden gebruikt.) wordt gebruikt voor het voorbeeldgebied scan selecteren en regio's van belang op de DAPI scan maken. B. de teal omtrek in deze afbeelding ziet u hoe het hele gebied van de dia (met inbegrip van het label) moet worden geselecteerd. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig6.jpg"> Figuur 6: het creëren van regio's van belang op de voorbeeldscan. De voorvertoning of de DAPI scan vertegenwoordigt het volledige diagebied. In dit voorbeeld zijn er drie seriële hersenen weefselsecties (het effen witte rechthoekige omtrek). Het gebied boven deze secties vertegenwoordigt de circulaire etiketten op de dia. Andere sectie regelingen zal niet beperken de daaropvolgende selectie van gebieden van belang. De regio van belang in dit specifieke voorbeeld wordt met een onderbroken witte rechthoekige omtrek weergegeven. De scalebar = 1 mm. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig7.jpg"> Figuur 7: essentiële windows voor hoge vergroting afbeelding acquisitie. A. de overname Site Setup venster zal blijken hoeveel kolommen en rijen binnen de regio('s) van belang zijn. B. zorgen voor het juiste aantal kolommen en rijen die zijn aangegeven in figuur 7A worden ingevoerd in het vak plaat overname Setup en de sites zijn betegeld. C. het is noodzakelijk het WellPositions-venster om open te houden voor de duur van de Beeldacquisitie hoewel het veld leeg is. D. het juiste aantal regio's van belang moet worden benadrukt. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig8.jpg"> Figuur 8: representatief beeld van de regio van belang. Elke site kan worden weergegeven in een samengestelde foto voor de regio van belang. De representatieve sites die zijn uitgesloten (gemarkeerd met een rode dozen) en een voorbeeld van een opgenomen site (gemarkeerd met een groene doos) wordt weergegeven bij een hogere vergroting. Het is raadzaam om te controleren elke site om ervoor te zorgen dat er van voldoende kwaliteit voor de analyse. De scalebar = 1 mm. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig9.jpg"> Figuur 9: voorbeelden van sites die worden van analyse uitgesloten moeten. A. het menselijk brein tumor secties hebben gekleurd met CD11b (groene) en CD45 (rood), markers van microglia en macrofagen. Dit beeld is onscherp en is uitgesloten van de analyse. B. bubbels zijn aanwezig in deze afbeelding die is uitgesloten van de definitieve analyse. C. Deze site was uitgesloten van de analyse vanwege de vouw in het weefsel. De schaal bars zijn 20 µm. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig9large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig10.jpg"> Figuur 10: representatieve beelden en analyse. A. elke afbeelding wordt weergegeven naast de overlays voor het resultaat van de geautomatiseerde segmentatie. De overlay, kernen worden weergegeven in wit en positief gekleurde cellen worden weergegeven in het groen voor CD11b en rood voor CD45. Na uitsluiten van de sites van ontoereikende kwaliteit van de analyse en het combineren van de resultaten van alle resterende sites, B. de gemiddelde percentages van het totale aantal cellen in elke site die gekleurd positief voor iedere markeerdraad en co gelabeld voor beide markeerders, C. de gemiddelde gekleurd gebied, en D. de gemiddelde cel-intensiteit worden grafisch weergegeven. RFU = relatieve fluorescentie eenheden. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking. De schaal bars zijn 20 µm. <a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig10large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Hier beschrijven we een protocol voor de automatische segmentatie van fluorescently geëtiketteerde weefsels op dia's met behulp van een widefield high-inhoudsanalyse systeem (WHCAS). Dit protocol heeft brede toepassingen op elk gebied waarbij de kwantificatie van fluorescente markeringen in biologische weefsels waaronder de biologische wetenschappen, medische techniek en Gezondheidswetenschappen.

Geautomatiseerde dia scannen en segmentatie in Fluorescently-geëtiketteerden weefsels met behulp van een analysesysteem Widefield High-inhoud

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

Het algemene doel van deze beeldvormings- en analysemethode is om een eenvoudige workflow te genereren voor de automatische segmentatie van elk fluorescent gelabeld glijmiddel gemonteerd weefselmonster. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het biologische wetenschappenveld te beantwoorden over hoeveel van een bepaald eiwit wordt gevonden binnen een specifiek gebied van een weefselmonster van belang. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat de tijd die wordt besteed aan het optimaliseren van protocollen voor geautomatiseerde segmentatie kan worden bespaard, waardoor deze methode kan worden toegepast op volgende fluorescent gelabelde glijmiddel gemonteerde weefselmonsters.We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we nieuwe cellen in hersenweefsel bij hoge vergroting moesten kwantificeren. Importeer de tijdschriften, open het dialoogvenster Plate Acquisition Setup en open het tabblad Objective and Camera. Zet de Vergroting op vier keer, de Camera binning op een en de Gain op twee.Open het tabblad Plate Slide Scanning en voer de juiste experimentele instellingen in. Onder het tabblad Sites to Visit, vul de putjes uniform met de sites en open het tabblad Edit Plate Bottom Settings om de juiste experimentele waarden in te voeren. Nadat u deze instellingen als Setting A hebt opgeslagen, opent u het tabblad Objective and Camera en stelt u de Vergroting in op 40 keer, de Camera binning op een en de Gain op twee.Bevestig dat alle instellingen onder de tabbladen Plate Slide Scanning en edit Plate Bottom Settings hetzelfde zijn als die voor Setting A zijn ingevoerd. En open het tabblad Acquisition Loop. Voer het aantal golflengten in dat in het monster aanwezig is en vink de opties Enable laser-based focusing en Enable image-based focusing aan. Sla deze instellingen vervolgens op als Setting B. Plaats vervolgens maximaal drie glijmiddelen, dekglas naar beneden met het label op de zijkant van de uitsparing, in de glijmiddeladapter.En druk op F4 om het hoofdmenu te openen. Selecteer Slide Scanning en klik op Open Door Eject Slide om de glijmiddeladapter in het wide field high content analysesysteem te plaatsen. Klik vervolgens op Close Door Load Slide.Om te beginnen, zorg ervoor dat de juiste golflengte is geselecteerd. Beweeg naar verschillende locaties binnen de live feature afbeelding totdat het gebied van belang is gevonden. Focus op het gebied.Als het niet in focus is, gebruik dan de knop Autofocus of pas de stapgrootte aan totdat het dat wel is. Gebruik Snap om de afbeelding vast te leggen, als u handmatig de focus aanpast door de stapgrootte te wijzigen. Om een eerdere scan in te stellen, laadt u eerst Setting A en selecteert u Preview Slides.Geef het aantal glijmiddelen aan en selecteer OK.Kies vier keer als de vergroting. Selecteer vervolgens Dekglas naar beneden en ga verder met het selecteren van uw basisinstellingen voor eerdere scannen. Zorg ervoor dat zowel Acquisition setting als Calibrations zijn aangevinkt voordat u Annuleren selecteert en op Doorgaan drukt.Onder het tabblad W1:DAPI, klik op Live en vervolgens op Auto Expose, gevolgd door Snap. Druk daarna op Sluiten. Selecteer de map en voer een naam in voor een eerdere scan.Het dialoogvenster Draw Region verschijnt automatisch. Gebruik de rechthoekige regiotool om de volledige regio van de eerdere scan te selecteren en klik op Doorgaan. Aan het einde van de eerdere scan, laadt u Setting B en opent u het tabblad Sites to Visit.Om te beginnen, zorg ervoor dat de juiste golflengte is geselecteerd. Beweeg naar verschillende locaties binnen de live feature afbeelding totdat het gebied van belang is gevonden. Focus op het gebied.Als het niet in focus is, gebruik dan de knop Autofocus of pas de stapgrootte aan totdat het dat wel is. Gebruik Snap om de afbeelding vast te leggen, als u handmatig de focus aanpast door de stapgrootte te wijzigen. Klik vervolgens onder het tabblad W1 DAPI op Auto Expose en bevestig dat de Plate Acquisitions Snap DAPI-afbeelding scherp is.Onder het hoofdmenu, klik op Journal en selecteer Run Journal in het uitklapmenu. Dubbelklik op het Slide Region Acquisition Setup Journal om te starten en klik op Doorgaan wanneer het dialoogvenster Setup Slide Region Acquisition verschijnt. Wanneer u wordt gevraagd, selecteert u de DAPI Scan om de glijmiddel afbeelding met lage vergroting te selecteren en klikt u op OK.Wanneer u wordt gevraagd naar de Plate Acquisition Snap, markeert u de Plate Acquisition Snap-DAPI en klikt u op OK.Wanneer het vak Create or Load Regions verschijnt, gebruikt u de rechthoekige regiotool om de interessegebieden op de DAPI Scan te selecteren en klikt u op Doorgaan.Gebruik de locatortool om het interessegebied te markeren en klik op Doorgaan, onder het dialoogvenster Select Region. Wanneer het bevestigingsvak voor regio's verschijnt, klikt u op Doorgaan en beslist u of de regio moet worden opgeslagen wanneer het dialoogvenster Save Regions verschijnt. Er verschijnen drie dialoogvensters.Klik op Doorgaan om het vak Setup Complete te ontdoen. Om elke gok over het vinden van een monsterlocatie te elimineren, zorg ervoor dat Display images during acquisition onder het tabblad Display Settings is aangevinkt en open het tabblad Summary om op Acquire Plate te klikken om de stage van het voorgeselecteerde interessegebied te positioneren. Wanneer de camera over een locatie met de cellen van belang pandeert, klikt u op Annuleren om de beeldacquisitie te stoppen.Wees niet bezorgd als de afbeelding niet scherp is. Deze stap is alleen om de stage van de eerste locatie in uw geselecteerde interessegebied te positioneren. Bevestig dat de stage zich boven het monster bevindt en dat u het juiste aantal locaties hebt ingevoerd.Optimaliseer de golflengte-instellingen om ervoor te zorgen dat er een afbeelding met een hoge dynamische bereik wordt verkregen. Open vervolgens het tabblad Summary opnieuw en klik op Acquire Plate. Aan het einde van de analyse, selecteert u het tabblad Display.Selecteer in het uitklapmenu Image Overlay Show well information om de sitenummers in de linkerbovenhoek weer te geven. Blader door de sites en sluit eventuele sites uit die uit focus zijn en/of weefselvouwsel, bellen en scheuren in het weefsel bevatten. In deze representatieve afbeelding worden hoge vergrotingsthumbnails van alle sites binnen het gedefinieerde interessegebied getoond.Elke site moet worden beoordeeld om de sites te identificeren die uit de analyse moeten worden uitgesloten. Bijvoorbeeld, in dit experiment was site 149 uit focus, site 219

automated-slide-scanning-segmentation-fluorescently-labeled-tissues

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Hier beschrijven we een methode om moleculaire heterogeniteit kwantificeren in histologische secties van tumor materiaal met behulp van kwantitatieve immunofluorescentie, beeldanalyse, en een statistische maatstaf voor heterogeniteit. De methode is bedoeld voor gebruik in klinische biomarker ontwikkeling en analyse.

Heterogeniteit in kaart brengen van de expressie van eiwitten in tumoren met behulp van kwantitatieve Immunofluorescentie

Complex weefsel massa, van organen tumoren, zijn samengesteld uit verschillende cellulaire elementen. We opgehelderd de bijdrage van cellulaire fenotypes binnen een weefsel met behulp van multi-gelabelde fluorescerende transgene muizen in combinatie met multiparameter immunofluorescentiekleuring gevolgd door spectrale unmixing naar cel oorsprong evenals karakteristieken van de cel op basis van eiwit expressie ontcijferen.

Kwantitatieve Multispectral Analyse Na Fluorescent Tissue Transplantatie voor Visualisatie van de Cel Origins, types en interacties

Gepresenteerd is een flexibele informatica workflow waardoor multiplex-image-based analyse van fluorescent gelabelde cellen. De workflow kwantificeert nucleaire en cytoplasmatische markers en berekent marker translocatie tussen deze compartimenten. Procedures zijn voorzien verstoring van cellen met siRNA en betrouwbare methode voor het merkerdetectie door indirecte immunofluorescentie in 96-well formaat.

Workflow voor High-inhoud, individuele cel Kwantificering van fluorescente merkers van Universal Microscoop gegevens, Ondersteund door Open Source Software

We presenteren een open source hoog gehalte analyse (HCA) instrument gebruik te maken van geautomatiseerde fluorescentie lifetime imaging (FLIM) voor het testen van eiwit interacties met behulp van Förster resonance energy transfer (FRET) op basis van uitlezingen. Data-acquisitie voor deze openFLIM-HCA instrument wordt bestuurd door software geschreven in μManager en data-analyse wordt uitgevoerd in FLIMfit.

Open Source High Content Analysis Door gebruik te maken van de automaten Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Bestuderen van tumor communicatie kan identificeren prognostische of voorspellende biomarkers voor klinische respons op immunotherapie. Hier wordt gepresenteerd, is een innovatieve methode op basis van in situ fluorescentie multispectrale imaging te analyseren en automatisch verschillende subpopulaties van CD8 tellen+ T cellen. Deze reproduceerbaar zijn en betrouwbare techniek is geschikt voor grote cohort analyses.

Multiplexed immunofluorescentie analyse en kwantificering van Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cellen

We beschrijven een snelle kleuringsmethode om multispectrale beeldvorming op bevroren weefsels uit te voeren.

Een snelle methode voor multispectrale fluorescentiebeeldvorming van bevroren weefselsecties

We hebben een weefselverwerkingstechniek ontwikkeld die gebruik maakt van een vibratoom en in agarose ingebed longweefsel om longsecties te genereren, waardoor het mogelijk wordt om beelden met een hoge resolutie van de longarchitectuur te verkrijgen. We gebruikten immunofluorescentiekleuring om ruimtelijke eiwitexpressie te observeren met behulp van specifieke structurele markers in de longen.

Geautomatiseerde vibratoomdoorsnede van in agarose ingebed longweefsel voor multiplex fluorescentiebeeldvorming

Het huidige protocol biedt een stapsgewijze procedure voor snelle en gelijktijdige optische clearing, multi-round labeling en 3D volumetrische reconstructie van tientallen postmortale menselijke hersensecties door de (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT weefseltransformatietechniek te combineren met light-sheet fluorescentiemicroscopiebeeldvorming in een routinematig high-throughput protocol.

Optische opheldering en etikettering voor lichtbladfluorescentiemicroscopie in grootschalige beeldvorming van het menselijk brein

Multiplex, cyclische immunohistochemie, maakt in situ detectie van meerdere markers tegelijk mogelijk met behulp van herhaalde antigeen-antilichaamincubatie, beeldscanning en beelduitlijning en -integratie. Hier presenteren we het operationele protocol voor het identificeren van immuuncelsubstraten met deze technologie in longkanker en gepaarde hersenmetastasemonsters.

Multiplex cyclische fluorescerende immunohistochemie

Spectral Iterative Bleaching Extend Multiplexity (IBEX) bouwt voort op de basis IBEX-techniek door heparineblokkering toe te voegen om niet-specifieke binding te minimaliseren en gebruik te maken van spectrale detectie met computationele ontmenging om autofluorescentie te onderdrukken. Deze aanpak versnelt de beeldacquisitie en vermindert tegelijkertijd achtergrondbronnen, waardoor robuuste multi-ronde, high-parameter ruimtelijke proteomische analyses mogelijk zijn.

High-plex beeldvorming met behulp van spectrale confocale microscopie om niet-specifieke weefselfluorescentie te minimaliseren

Multiplexed immunofluorescentie maakt sequentiële labeling van meerdere antilichaammarkers binnen één weefselsectie mogelijk om ruimtelijke analyse van weefselarchitectuur en celpopulaties te ondersteunen. Hier wordt een workflow gepresenteerd voor multiplexdetectie van senescentie-geassocieerde, structurele en immuunmarkers, inclusief handmatige en geautomatiseerde preparat, iteratieve beeldvorming en single-cell analyse met behulp van digitale pathologiesoftware.

Multiplexed Immunofluorescentietest voor ruimtelijke beoordeling van senescence-markers in vivo

Leer geautomatiseerde segmentatie van fluorescent gelabelde weefsels met een widefield high-content analysesysteem. Deze methode versnelt de kwantificering van eiwitten in biologische monsters voor biowetenschappelijk onderzoek.

Geautomatiseerde dia scannen en segmentatie in Fluorescently-geëtiketteerden weefsels met behulp van een analysesysteem Widefield High-inhoud (Video) | JoVE Journal

Geautomatiseerde dia scannen en segmentatie in Fluorescently-geëtiketteerden weefsels met behulp van een analysesysteem Widefield High-inhoud

Meer video's verkennen