Geautomatiseerde dia scannen en segmentatie in Fluorescently-geëtiketteerden weefsels met behulp van een analysesysteem Widefield High-inhoud
3 mei 2018
Hier beschrijven we een protocol voor de automatische segmentatie van fluorescently geëtiketteerde weefsels op dia's met behulp van een widefield high-inhoudsanalyse systeem (WHCAS). Dit protocol heeft brede toepassingen op elk gebied waarbij de kwantificatie van fluorescente markeringen in biologische weefsels waaronder de biologische wetenschappen, medische techniek en Gezondheidswetenschappen.
Het algemene doel van deze beeldvormings- en analysemethode is om een eenvoudige workflow te genereren voor de automatische segmentatie van elk fluorescent gelabeld glijmiddel gemonteerd weefselmonster. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het biologische wetenschappenveld te beantwoorden over hoeveel van een bepaald eiwit wordt gevonden binnen een specifiek gebied van een weefselmonster van belang. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat de tijd die wordt besteed aan het optimaliseren van protocollen voor geautomatiseerde segmentatie kan worden bespaard, waardoor deze methode kan worden toegepast op volgende fluorescent gelabelde glijmiddel gemonteerde weefselmonsters.
We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we nieuwe cellen in hersenweefsel bij hoge vergroting moesten kwantificeren. Importeer de tijdschriften, open het dialoogvenster Plate Acquisition Setup en open het tabblad Objective and Camera. Zet de Vergroting op vier keer, de Camera binning op een en de Gain op twee.
Open het tabblad Plate Slide Scanning en voer de juiste experimentele instellingen in. Onder het tabblad Sites to Visit, vul de putjes uniform met de sites en open het tabblad Edit Plate Bottom Settings om de juiste experimentele waarden in te voeren. Nadat u deze instellingen als Setting A hebt opgeslagen, opent u het tabblad Objective and Camera en stelt u de Vergroting in op 40 keer, de Camera binning op een en de Gain op twee.
Bevestig dat alle instellingen onder de tabbladen Plate Slide Scanning en edit Plate Bottom Settings hetzelfde zijn als die voor Setting A zijn ingevoerd. En open het tabblad Acquisition Loop. Voer het aantal golflengten in dat in het monster aanwezig is en vink de opties Enable laser-based focusing en Enable image-based focusing aan. Sla deze instellingen vervolgens op als Setting B. Plaats vervolgens maximaal drie glijmiddelen, dekglas naar beneden met het label op de zijkant van de uitsparing, in de glijmiddeladapter.
En druk op F4 om het hoofdmenu te openen. Selecteer Slide Scanning en klik op Open Door Eject Slide om de glijmiddeladapter in het wide field high content analysesysteem te plaatsen. Klik vervolgens op Close Door Load Slide.
Om te beginnen, zorg ervoor dat de juiste golflengte is geselecteerd. Beweeg naar verschillende locaties binnen de live feature afbeelding totdat het gebied van belang is gevonden. Focus op het gebied.
Als het niet in focus is, gebruik dan de knop Autofocus of pas de stapgrootte aan totdat het dat wel is. Gebruik Snap om de afbeelding vast te leggen, als u handmatig de focus aanpast door de stapgrootte te wijzigen. Om een eerdere scan in te stellen, laadt u eerst Setting A en selecteert u Preview Slides.
Geef het aantal glijmiddelen aan en selecteer OK.Kies vier keer als de vergroting. Selecteer vervolgens Dekglas naar beneden en ga verder met het selecteren van uw basisinstellingen voor eerdere scannen. Zorg ervoor dat zowel Acquisition setting als Calibrations zijn aangevinkt voordat u Annuleren selecteert en op Doorgaan drukt.
Onder het tabblad W1:DAPI, klik op Live en vervolgens op Auto Expose, gevolgd door Snap. Druk daarna op Sluiten. Selecteer de map en voer een naam in voor een eerdere scan.
Het dialoogvenster Draw Region verschijnt automatisch. Gebruik de rechthoekige regiotool om de volledige regio van de eerdere scan te selecteren en klik op Doorgaan. Aan het einde van de eerdere scan, laadt u Setting B en opent u het tabblad Sites to Visit.
Om te beginnen, zorg ervoor dat de juiste golflengte is geselecteerd. Beweeg naar verschillende locaties binnen de live feature afbeelding totdat het gebied van belang is gevonden. Focus op het gebied.
Als het niet in focus is, gebruik dan de knop Autofocus of pas de stapgrootte aan totdat het dat wel is. Gebruik Snap om de afbeelding vast te leggen, als u handmatig de focus aanpast door de stapgrootte te wijzigen. Klik vervolgens onder het tabblad W1 DAPI op Auto Expose en bevestig dat de Plate Acquisitions Snap DAPI-afbeelding scherp is.
Onder het hoofdmenu, klik op Journal en selecteer Run Journal in het uitklapmenu. Dubbelklik op het Slide Region Acquisition Setup Journal om te starten en klik op Doorgaan wanneer het dialoogvenster Setup Slide Region Acquisition verschijnt. Wanneer u wordt gevraagd, selecteert u de DAPI Scan om de glijmiddel afbeelding met lage vergroting te selecteren en klikt u op OK.Wanneer u wordt gevraagd naar de Plate Acquisition Snap, markeert u de Plate Acquisition Snap-DAPI en klikt u op OK.Wanneer het vak Create or Load Regions verschijnt, gebruikt u de rechthoekige regiotool om de interessegebieden op de DAPI Scan te selecteren en klikt u op Doorgaan.
Gebruik de locatortool om het interessegebied te markeren en klik op Doorgaan, onder het dialoogvenster Select Region. Wanneer het bevestigingsvak voor regio's verschijnt, klikt u op Doorgaan en beslist u of de regio moet worden opgeslagen wanneer het dialoogvenster Save Regions verschijnt. Er verschijnen drie dialoogvensters.
Klik op Doorgaan om het vak Setup Complete te ontdoen. Om elke gok over het vinden van een monsterlocatie te elimineren, zorg ervoor dat Display images during acquisition onder het tabblad Display Settings is aangevinkt en open het tabblad Summary om op Acquire Plate te klikken om de stage van het voorgeselecteerde interessegebied te positioneren. Wanneer de camera over een locatie met de cellen van belang pandeert, klikt u op Annuleren om de beeldacquisitie te stoppen.
Wees niet bezorgd als de afbeelding niet scherp is. Deze stap is alleen om de stage van de eerste locatie in uw geselecteerde interessegebied te positioneren. Bevestig dat de stage zich boven het monster bevindt en dat u het juiste aantal locaties hebt ingevoerd.
Optimaliseer de golflengte-instellingen om ervoor te zorgen dat er een afbeelding met een hoge dynamische bereik wordt verkregen. Open vervolgens het tabblad Summary opnieuw en klik op Acquire Plate. Aan het einde van de analyse, selecteert u het tabblad Display.
Selecteer in het uitklapmenu Image Overlay Show well information om de sitenummers in de linkerbovenhoek weer te geven. Blader door de sites en sluit eventuele sites uit die uit focus zijn en/of weefselvouwsel, bellen en scheuren in het weefsel bevatten. In deze representatieve afbeelding worden hoge vergrotingsthumbnails van alle sites binnen het gedefinieerde interessegebied getoond.
Elke site moet worden beoordeeld om de sites te identificeren die uit de analyse moeten worden uitgesloten. Bijvoorbeeld, in dit experiment was site 149 uit focus, site 219
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor de geautomatiseerde segmentatie van fluorescentielabelde weefsels met behulp van een widefield high-content analysesysteem (WHCAS). Deze methode stroomlijnt de kwantificering van fluorescentiemarkers in biologische weefsels, wat voordelig is voor diverse vakgebieden, waaronder de biologische wetenschappen en de medische techniek.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Biologische wetenschappen
- Medische techniek
- Gezondheidswetenschappen
Achtergrond
- Geautomatiseerde segmentatie verbetert de analyse van fluorescentielabelde weefsels.
- High-content analysesystemen vergemakkelijken gedetailleerde beeldvorming van biologische monsters.
- Kwantificering van eiwitten in weefselmonsters is cruciaal voor het begrijpen van biologische processen.
- Deze methode is ontwikkeld om de uitdagingen bij het kwantificeren van nieuwe cellen in hersenweefsel aan te pakken.
Doel van de studie
- Om een efficiënte workflow te creëren voor de automatische segmentatie van weefselmonsters.
- Om de nauwkeurigheid en snelheid van de kwantificering van fluorescente markers te verbeteren.
- Om een gestandaardiseerd protocol te bieden dat toepasbaar is op diverse weefseltypen.
Gebruikte methoden
- Opzet van een widefield high-content analysesysteem voor beeldvorming.
- Configuratie van experimentele instellingen voor optimale beeldvorming.
- Gebruik van softwaretools voor beeldacquisitie en analyse.
- Implementatie van autofocus en beeldgebaseerde focusing-technieken.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle segmentatie van fluorescentie-gelabelde weefsels werd bereikt.
- Beeldbenvorming bij hoge vergroting leverde gedetailleerde weergaven van weefselmonsters op.
- Interessante regio's (regions of interest) werden nauwkeurig geïdentificeerd en geanalyseerd.
- Exclusiecriteria voor onscherpe of aangetaste beelden werden vastgesteld.
Conclusies
- Het geautomatiseerde segmentatieprotocol vermindert de analysetijd aanzienlijk.
- Deze methode kan worden toegepast op een breed scala aan biologische weefsels.
- Toekomstige toepassingen kunnen het onderzoek in diverse wetenschappelijke vakgebieden verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Geautomatiseerde slide-scanning en segmentatie met behulp van een widefield high-content analysesysteem (WHCAS) pakt de bottleneck aan bij het kwantificeren van fluorescente markers in grote weefselcoupes, waardoor reproduceerbare high-throughput analyse mogelijk wordt voor targetvalidatie en assayontwikkeling. Door workflows voor beeldacquisitie en segmentatie te standaardiseren, vermindert deze methode de variabiliteit en versnelt zij de preklinische evaluatie van weefselgebaseerde biomarkers, wat datagestuurde go/no-go-beslissingen in de vroege ontdekkingsfase ondersteunt.
Strategische toepassingen in BioPharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door eiwitexpressiepatronen in ziekterelevante weefsels te kwantificeren.
- Operationele waarde: Vermindert de tijd die nodig is voor het optimaliseren van protocollen voor individuele experimenten, waardoor snelle toepassing op meerdere fluorescentielabeldoelen mogelijk is.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanische risicoreductie door consistente, kwantitatieve uitlezingen van markerlokalisatie en expressieniveaus.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening door het genereren van gestandaardiseerde, gesegmenteerde weefselbeelden die geschikt zijn voor high-content assays.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays door geautomatiseerde regioselectie en uitsluiting van aangetaste locaties (bijv. weefsel dat buiten focus ligt, geplooid is of luchtbellen bevat).
- Schaalbaarheid: Maakt hergebruik van het platform mogelijk voor diverse markers en weefseltypen via vooraf gebouwde softwaremodules voor eiwitlokalisatie, proliferatie, viabiliteit, apoptose en angiogenese.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Handhaaft consistentie van ontdekking tot preklinische validatie door het leveren van kwantitatieve gegevens over de proporties marker-positieve cellen, het gemiddelde gekleurde oppervlak en de fluorescentie-intensiteit.
- Risico-gecorrigeerde Vooruitgang: Ondersteunt de preklinische besluitvorming door het leveren van betrouwbare, exclusie-gefilterde datasets die het werkelijke biologische signaal weerspiegelen.
- Ziekte-relevant Systeem: Aangetoonde toepasbaarheid bij de analyse van hersentumorweefsel, met uitbreidbaarheid naar elke fluorescentielabel nuclear of cytoplasmatische marker in op objectglas gemonteerde weefsels.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege ontdekking via lead-identificatie tot preklinisch onderzoek, waardoor gestandaardiseerde weefselanalyse in elke fase mogelijk wordt.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door de expressie van markers te kwantificeren in specifieke weefselregio's van belang.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via geautomatiseerde segmentatie en kwantitatieve outputs die een betrouwbare evaluatie van verbindingen over verschillende locaties mogelijk maken.
- Analytica: Genereert meetbare resultaten, waaronder het aandeel positieve cellen, het gemiddelde gekleurde oppervlak en de gemiddelde fluorescentie-intensiteit, waardoor vergelijkingen tussen condities mogelijk worden.
- Translationeel onderzoek: Legt een verbinding met preklinische continuïteit door kwantitatieve weefselgegevens te leveren die zijn afgestemd op biomarkers en geschikt zijn voor validatiestudies.
- Enterprise-hergebruik: Fungeert als een herbruikbare functionaliteit over projecten heen, waarbij gebruik wordt gemaakt van vooraf gebouwde softwaremodules en opgeslagen instellingen (Setting A en B) voor consistente slide-scanning en segmentatie.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit in weefselgebaseerde assays.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van workflows voor weefselbeeldvorming en -analyse.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie door verminderde tijd voor protocoloptimalisatie en een lager biologisch risico in een laat stadium.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van kwantitatieve, exclusie-gevalideerde weefselgegevens.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de bediening van een widefield high-content analysesysteem en navigatie in de bijbehorende software.
- Afhankelijk van instrumentatie die in staat is tot slide-scanning, multi-golflengte acquisitie en laser- en beeldgebaseerde focussering.
- Vereist standaardisatie van acquisitie-instellingen (bijv. vergroting, binning, gain) en protocollen voor de definitie van region-of-interest over verschillende teams heen.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het toepassen van de methode op verschillende weefseltypen, markerexpressies of slide-diktes.
- Bevat praktische beperkingen, zoals de noodzaak om locaties met artefacten (bijv. onscherpe beelden, weefselplooien, luchtbellen) handmatig uit te sluiten, ondanks de geautomatiseerde acquisitie.
