Identificatie van Dopamine D1-Alpha Receptor binnen knaagdier Nucleus Accumbens door een innovatieve RNA In Situ de technologie van de opsporing
27 maart 2018
Identificatie van dopamine D1-alpha receptor in de nucleus accumbens is van cruciaal belang voor de verduidelijking van de D1-receptor dysfunctie tijdens een ziekte van het centrale zenuwstelsel. Wij uitgevoerd een roman RNA in situ hybridisatie assay om te visualiseren single molecules van RNA in een specifieke hersenen gebied.
Het algemene doel van deze nieuwe RNA in-situ hybridisatietest is om enkele RNA-moleculen in een specifiek hersengebied te visualiseren die cruciaal zijn voor het verduidelijken van dopaminerge disfunctie tijdens ziekten van het centrale zenuwstelsel. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de neurowetenschappen, zoals dopaminerge afwijkingen die gedragsreacties mediëren en de werkgeheugenfunctie moduleren. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het een nieuwe in-situ hybridisatietechniek biedt om disfunctie van het dopaminesysteem te onderzoeken tijdens de progressie van ziekten van het centrale zenuwstelsel.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in de algemene expressieniveaus van een doel-mRNA in een bepaald hersengebied, kan het ook worden toegepast om te bepalen hoe mRNA-transcripten worden verdeeld in de cellen van een bepaald gebied. Om met deze procedure te beginnen, dompel je de hersenen van een volwassen rat binnen vijf minuten na het verzamelen gedurende 15 seconden in vloeibare stikstof. Daarna breng je de hersenen gedurende een uur in evenwicht bij minus 20 graden Celsius in een cryostaat.
Na een uur snij je 30 micronsecties met nucleus accumbens van 2,76 millimeter tot 2,28 millimeter anterior tot bregma en bevestig je deze op de dia's. Droog vervolgens de secties gedurende 10 minuten bij minus 20 graden Celsius. Daarna dompel je de dia's een uur lang in voorgekoelde 4% paraformaldehyde bij vier graden Celsius.
Plaats vervolgens de dia's in een toenemende ethanolgradiënt op kamertemperatuur en plaats de dia's vervolgens gedurende nog eens vijf minuten in vers 100% ethanol. Plaats daarna de dia's op absorberend papier om te laten drogen. Teken met een barrièrepen een barrière rond elke sectie.
Laat de barrière een minuut volledig drogen. Om de hersensneden voor te behandelen, zet je de oven aan en stel je de temperatuur in op 40 graden Celsius. Voeg drie druppels voorbehandelingsreagens toe aan elke hersensnede.
Bewaar de secties vervolgens 30 minuten op kamertemperatuur. Dompel vervolgens de dia's gedurende een minuut in 1X PBS op kamertemperatuur en plaats de dia's in vers 1X PBS voor nog een minuut. Dia's mogen niet langer dan 15 minuten in 1X PBS blijven liggen.
Om de multiplextest uit te voeren, verwarm je de doelprobe gedurende 10 minuten op 40 graden Celsius in een waterbad en koel vervolgens af tot kamertemperatuur. Plaats het RNA-reagens op kamertemperatuur. Verwijder overtollig vocht van de dia's met absorberend papier en plaats ze terug op de dia-houder.
Voeg vervolgens drie druppels van de Drd1alpha als sonde toe aan elke monsterslice en bewaar de monsters gedurende twee uur op 40 graden Celsius. Was vervolgens de dia's twee keer gedurende twee minuten in 1X wasbuffer bij kamertemperatuur. Verwijder overtollig vocht van de dia's met absorberend papier en plaats ze terug op de dia-houder.
Laat de hersensneden niet uitdrogen tussen incubatiestappen. Voeg drie druppels AMP 1FL toe aan elke monstersnede en bewaar de monsters gedurende 30 minuten op 40 graden Celsius. Was vervolgens de dia's twee keer gedurende twee minuten in 1X wasbuffer bij kamertemperatuur.
Verwijder vervolgens overtollig vocht van de dia's met absorberend papier en plaats ze terug op de dia-houder. Voeg vervolgens drie druppels AMP 2FL toe aan elke monstersnede. Bewaar de monsters gedurende 15 minuten op 40 graden Celsius.
Dompel vervolgens de dia's twee keer gedurende twee minuten in 1X wasbuffer bij kamertemperatuur. Verwijder overtollig vocht van de dia's met absorberend papier en plaats ze terug op de dia-houder. Voeg vervolgens drie druppels AMP 3FL toe aan elke monstersnede en bewaar de monsters gedurende 30 minuten op 40 graden Celsius.
Was vervolgens de dia's twee keer gedurende twee minuten in 1X wasbuffer bij kamertemperatuur. Verwijder overtollig vocht van de dia's met absorberend papier en plaats ze terug op de dia-houder. Voeg vervolgens drie druppels AMP 4FL ALT A toe aan elke monstersnede en bewaar de monsters gedurende 15 minuten op 40 graden Celsius.
Was de dia twee keer gedurende twee minuten in 1X wasbuffer bij kamertemperatuur. Verwijder overtollig vocht van de dia's en plaats onmiddellijk twee druppels montagereagens op elke sectie. Plaats vervolgens een dekglas van 22 millimeter bij 22 millimeter over elke hersensnede.
Bewaar de dia's vervolgens in het donker bij twee tot acht graden Celsius totdat ze droog zijn. Voor beeldvorming, zet je de confocale microscoop aan en schakel je over naar een 60X objectief. Verkrijg Z-stack-beelden en maak beelden van Drd1alpha-gelabelde cellen in de nucleus accumbens-regio.
Voor beelden van de nucleus accumbens die het discrete stipjespatroon vertoonden, werd de dynamische bereik van expressie beoordeeld met behulp van een semi-kwantitatieve analyse. Elke cel werd van nul tot negen beoordeeld op basis van het aantal stippen per cel. Deze hybridisatie-signaalscoremethode kan dus de omvang en variabiliteit van Drd1alpha-expressie in afzonderlijke cellen beoordelen.
Hier zijn de representatieve confocale beelden van Drd1alpha-expressie in mannelijke en vrouwelijke ratten die het discrete stipjespatroon vertonen. Om rekening te houden met de geneste gegevensstructuur, werden gemiddelde telwaarden berekend voor elke categorie en gebruikt voor statistische analyse. Een Mann-Whitney U-test werd uitgevoerd om verschillen in mediane celtelling bij mannelijke en vrouwelijke ratten te beoordelen.
De frequentie van cellen in elke categorie wordt geanalyseerd met behulp van relatieve frequentie en cumulatieve frequentie. Vrouwelijke dieren vertoonden een significante verschuiving in de verdeling met een grotere frequentie van cellen in lagere geordende categorieën ten opzichte van mannelijke dieren. Over het algemeen suggereren de resultaten duidelijke seksuele verschillen in Drd1alpha-expressie in de
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie identificeert de dopamine D1-alpha receptor in de nucleus accumbens met behulp van een nieuwe RNA in situ hybridisatie-assay, waarmee individuele RNA-moleculen gevisualiseerd kunnen worden. Het onderzoek beoogt de dopaminerge dysfunctie geassocieerd met ziekten van het centraal zenuwstelsel te verduidelijken en onderzoekt hoe deze abnormaliteiten het gedrag en het werkgeheugen beïnvloeden.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Neurofarmacologie
- Moleculaire biologie
Achtergrond
- Dopaminereceptoren spelen een cruciale rol bij het moduleren van de neuronale functie.
- Dysfunctie van de D1-receptor is gekoppeld aan diverse aandoeningen van het centrale zenuwstelsel.
- Inzicht in de receptorverdeling kan licht werpen op gedragsmatige en cognitieve tekortkomingen.
- In situ hybridisatietechnieken zijn essentieel voor het bestuderen van mRNA-expressie in specifieke hersengebieden.
Doel van de studie
- Om de RNA-distributie in de nucleus accumbens te visualiseren.
- Om abnormaliteiten in de expressie van dopaminereceptoren te identificeren.
- Om bij te dragen aan het begrip van gedragsreacties en de functie van het werkgeheugen.
Gebruikte methoden
- Er is gebruikgemaakt van een nieuwe RNA in situ hybridisatie-assay.
- Hersenen van volwassen ratten werden geoogst en verwerkt voor de bereiding van coupes.
- De methode maakt visualisatie van de mRNA-distributie op enkelcelniveau mogelijk.
- Confocale microscopie werd ingezet voor beeldvorming om de expressiepatronen van Drd1alpha te analyseren.
Belangrijkste resultaten
- Er werden significante sekseverschillen in de expressie van Drd1alpha waargenomen in de nucleus accumbens.
- De studie toonde duidelijke patronen van RNA-distributie aan, waarbij een scoringsmethode werd gebruikt om de expressieniveaus te beoordelen.
- De bevindingen suggereren implicaties voor het begrijpen van dopaminerge dysfunctie in gedragsmatige contexten.
Conclusies
- Deze techniek maakt onderzoek met een hoge resolutie naar receptor-expressie en mRNA-distributie mogelijk.
- De bevindingen kunnen het begrip van seksegebonden verschillen in dopaminerge functies en ziekten van het centrale zenuwstelsel verbeteren.
- De implicaties zijn aanzienlijk voor zowel fundamenteel neurowetenschappelijk onderzoek als potentiële therapeutische strategieën.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze RNA in situ hybridisatietechniek maakt de visualisatie van individuele mRNA-transcripten in gedefinieerde hersenregio's mogelijk, wat doelwitvalidatie in dopaminerge pathways ondersteunt. Door sekse-specifieke expressiepatronen van Drd1alpha in de nucleus accumbens te ontrafelen, biedt het mechanistische risicoreductie voor CNS-geneesmiddelenontwikkelingsprogramma's. De methode verhoogt het voorspellende vertrouwen in preklinische modellen door receptorverdeling te koppelen aan gedragstypes.
Strategische toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door de expressie van Drd1alpha RNA in beloningscircuits in kaart te brengen.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicoreductie mogelijk door middel van een kwantitatieve beoordeling van receptorheterogeniteit.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portefeuilletriage door het identificeren van sekse-afhankelijke target-engagement.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening van dopaminerge modulatoren.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare resultaten via semi-kwantitatieve dot scoring.
- Schaalbaarheid: Faciliteert hergebruik van het platform voor diverse modellen van ziekten van het centraal zenuwstelsel die spatiële transcriptresolutie vereisen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Sluit aan bij ziekte-relevante systemen door dopaminerge dysfunctie in werkgeheugenpaden te onderzoeken.
- Operationele waarde: Waarborgt translationele continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie via consistente mRNA-detectie.
- Risicobeheersing: Informeert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door de variabiliteit in targetexpressie te verduidelijken.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode wordt geïntegreerd in vroege discovery-workflows, waarbij spatiële transcriptresolutie bijdraagt aan de betrouwbaarheid van het target vóór de leadidentificatie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothese-testen door de distributie van Drd1alpha te koppelen aan gedragsfenotypes in de NAc.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via kwantitatieve expressiemetrieken op celniveau.
- Analytiek: Genereert statistische output (Mann-Whitney U, frequentieverdelingen) voor vergelijking tussen condities.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit door het modelleren van sekse-specifieke dopaminerge responsen.
- Bedrijfsbrede Hergebruik: Functioneert als een herbruikbare capaciteit voor het in kaart brengen van elk CNS-target mRNA in gefixeerd weefsel.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen, targetvalidatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit in dopaminerge signalering.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid over hersengebieden en soorten heen.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium bij CZS-programma's.
- Impact op portfolio: Risicogecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van de getrouwheid van de targetexpressie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in histologie, RNA-behandeling en confocale beeldvorming.
- Afhankelijk van infrastructuur voor cryostaten, vloeibare stikstof en fluorescentiemicroscopie.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor het ontwerp van probes en signaalkwantificering.
- Overwegingen voor adaptatie omvatten de fixatietijd van weefsels en de efficiëntie van permeabilisatie tussen verschillende modellen.
- Praktische beperkingen omvatten het risico op RNA-degradatie door temperatuurschommelingen of uitdroging tijdens de verwerking.
