Experimentele Protocol voor het gebruik van Drosophila als een ongewervelde modelsysteem voor toxiciteitstests in het laboratorium
10 juli 2018
In deze paper bieden wij een gedetailleerd protocol voor het blootstellen van de soort van het geslacht Drosophila aan verontreinigende stoffen, met het doel van het bestuderen van de impact van blootstelling over een scala van fenotypische resultaten op verschillende ontwikkelingsstadia en voor meer dan één generatie.
Dit protocol kan worden gebruikt om de impact van toxische stoffen op de fitheid in verschillende ontwikkelingsstadia te begrijpen en het effect van blootstelling aan verontreinigingen over generaties heen te onderzoeken. De procedure wordt gedemonstreerd door twee bachelorstudenten in mijn onderzoekslaboratorium die deel uitmaken van de gemeenschappen om actief stamcelbetrokkenheid op Colorado State University Pueblo op te bouwen, Hugh Long en Tyler Harvey. Om te beginnen met een milieuverontreiniging van belang, bepaal eerst de 50% dodelijke dosis van de verbinding Drosophilia.
Gebruik gevestigde methoden om een dosis-responscurve te maken. Bereid vervolgens het groeimedium voor met de verbinding in de gewenste concentratie. Voeg bijvoorbeeld de verbinding toe in de waterfractie bij het maken van instant medium.
Tegelijkertijd, maak controlemedium zonder de toegevoegde verbinding. Om de cultuur op te zetten waaruit experimentele dieren worden verzameld, draag de reproductieve volwassenen over naar het groeimedium met behulp van standaardmethoden. Standaardiseren het aantal vliegen per fles en vermijd overbevolking van de volwassenen.
Vervolgens, incubeer de vliegen onder standaardcondities gedurende één tot vier dagen. Na de incubatie, gooi de volwassenen weg, laat de bevruchte eieren achter om te rijpen voor testen. Plaats vervolgens de flesjes terug in de incubator.
De blootstelling kan in elke ontwikkelingsfase worden ingesteld. Bovendien kunnen experimentele onderwerpen in elke ontwikkelingsfase worden verzameld, afhankelijk van de experimentele doelen. Controleer dagelijks de zich ontwikkelende dieren om het eerste teken van de geïnteresseerde fase te identificeren, zoals rondzwervende derde instar larven.
Om de effecten van blootstelling op de rondzwervende derde instar larvenfase te testen, verzamel de larven binnen een uur na het aangaan van het licht, wanneer ze beginnen te verschijnen uit het voedselsubstraat. Giet vervolgens het water uit en verplaats de larven naar een laboratoriumdoek om voorzichtig eventueel overtollig water te verwijderen. Eenmaal gedroogd, breng de larven over naar de juiste buizen voor verzameling.
Om de effecten van blootstelling op volwassenen te testen, verzamel de pas uitgeslopen volwassenen; koolzuurverdoving is oké. Zorg ervoor dat je de vliegen verzamelt voordat ze reproductief volwassen zijn en beginnen te paren. Verdeel de vliegen in geslachtsspecifieke groepen en breng ze over naar flesjes geladen met het controle- of experimenteel besmette medium om de bestaande blootstelling te matchen.
Later, 24 uur voorafgaand aan het meten van de verontreinigingen in de volwassen vliegen, breng de volwassenen in zowel het controle- als het besmette medium over naar een flesje geladen met controlemedium om de volwassenen toe te laten om overtollig medium van hun lichaam te verwijderen. Na 24 uur van verzorging kunnen de vliegen worden getest met behulp van de juiste methode. Gedragsveranderingen kunnen bijvoorbeeld worden getest met behulp van een paringskeuzetest.
Met behulp van deze methoden zijn onderzoeken naar transgenerationele effecten van verontreinigingsblootstelling heel eenvoudig. Stel eenvoudig kruisingen op tussen blootgestelde volwassenen op het controlemedium en bestudeer de effecten van Fnot-blootstelling op hun nakomelingen. Dit protocol werd gebruikt om de accumulatie, eliminatie en sequestratie van lood binnen dezelfde generatie nakomelingen te evalueren.
Drosophila accumuleerde gemakkelijk lood in verschillende doses, ontwikkelingsstadia en evolutionaire schalen. Met behulp van een multi-generationele blootstelling werd gevonden dat ouderlijke blootstelling niet wordt overgedragen aan de eerste generatie volwassen nakomelingen. Daarom is het met behulp van dit protocol mogelijk om adaptieve reacties op verschillende evolutionaire schalen te testen, evenals transgenerationele effecten Fnot van blootstelling.
Vervolgens werden vliegen van eistadium tot volwassenheid op controle- of loodbelast medium grootgebracht en getest na 24 uur depuratie, paarvoorkeur werd getest. Vrouwtjes grootgebracht op loodbelast medium paarden bij voorkeur met lood-blootstelde mannetjes boven controle-blootstelde mannetjes. Aan de andere kant vertoonden mannetjes niet dezelfde voorkeur.
Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u Drosophila moet grootbrengen en verzamelen om verschillende vragen en toxicologie te beantwoorden. Eenmaal beheerst, kan dit protocol in één tot twee maanden worden uitgevoerd als het op de juiste manier wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om voorzichtig met de vliegen om te gaan, zodat onnodige stress wordt voorkomen.
Na dit protocol kunnen andere vragen zoals gedrags-, genetische en neurologische vragen worden getest. Vergeet niet dat het werken met verontreinigingen uiterst gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen en het bereiden van verontreinigingen in een afzuigkap, altijd moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor het blootstellen van Drosophila-soorten aan vervuilende stoffen om de effecten op fenotypische uitkomsten over verschillende ontwikkelingsstadia en generaties te bestuderen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschap
- Milieutoxicologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Drosophila dient als modelorganisme voor het bestuderen van genetische en omgevingsinteracties.
- Inzicht in de impact van verontreinigende stoffen is cruciaal voor het beoordelen van ecologische en gezondheidsrisico's.
- Onderzoek naar multigenerationele effecten kan inzicht bieden in evolutionaire adaptaties.
- Protocollen voor blootstelling aan toxicanten zijn essentieel voor de reproduceerbaarheid van onderzoek.
Doel van de studie
- Om de impact van toxicanten op de fitness tijdens verschillende ontwikkelingsstadia te onderzoeken.
- Om de effecten van blootstelling aan verontreinigende stoffen over meerdere generaties te bestuderen.
- Om een gestandaardiseerd protocol te bieden voor onderzoekers in dit vakgebied.
Gebruikte methoden
- Bepaal de 50% letale dosis van de verbinding voor Drosophila.
- Stel een dosis-responscurve op met behulp van gevestigde methoden.
- Bereid groeimedium voor met de verontreinigende stof in de gewenste concentratie.
- Voer experimenten uit met bachelorstudenten om de betrokkenheid bij onderzoek te vergroten.
Belangrijkste resultaten
- De procedure voor het blootstellen van Drosophila aan milieuverontreinigingen is gedemonstreerd.
- Inzichten zijn verschaft in de fenotypische veranderingen als gevolg van blootstelling aan verontreinigende stoffen.
- Het belang van multigenerationele studies bij het begrijpen van toxische effecten is benadrukt.
- Bachelorstudenten zijn betrokken bij praktijkgerichte onderzoekservaringen.
Conclusies
- Het protocol biedt een waardevol instrument voor onderzoekers die de milieu-impact op Drosophila bestuderen.
- De bevindingen kunnen bijdragen aan breder ecologisch en gezondheidsgerelateerd onderzoek.
- Het stimuleren van studentbetrokkenheid bevordert de toekomstige interesse in wetenschappelijk onderzoek.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het gebruik van Drosophila als ongewervelde modelorganisme stelt biofarmaceutische teams in staat om de effecten van toxicanten over ontwikkelings- en generatiegrenzen heen te onderzoeken, wat het voorspellend vertrouwen bij vroege veiligheidsbeoordelingen ondersteunt. Dit protocol faciliteert mechanistische risicoreductie door fenotypische output te koppelen aan blootstellingsvariabelen, wat bijdraagt aan de triage van portfolio's en translationele continuïteit. De integratie van eindpunten op populatieniveau en ecologisch niveau vergroot de relevantie van preklinische toxicologie voor de besluitvorming binnen bedrijfsbrede R&D.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt onderzoek mogelijk naar de impact van toxicanten op de fitness van het organisme en de ontwikkelingsstadia.
- Ondersteunt de functionele validatie van toxiciteitspaden en mechanische risicoreductie.
- Faciliteert hypothese-gestuurde beoordeling van multigenerationele en evolutionaire effecten van toxicanten.
Screening & assayontwikkeling
- Biedt een gestandaardiseerd, reproduceerbaar protocol voor dosis-responsscreening en fenotypische screening.
- Maakt kwantitatieve meting van gedragsmatige, neurologische en genetische eindpunten mogelijk.
- Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op verdere evaluatie van verbindingen en schaalbaarheid.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt toxicologische resultaten uit met ecologisch relevante en ziekte-relevante eindpunten.
- Ondersteunt de continuïteit van de ontdekkingsfase tot en met de preklinische veiligheidsbeoordeling.
- Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk op basis van multigenerationele gegevens.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol plaatst toxiciteitstesten bij Drosophila op het snijvlak van vroege ontdekking, lead-identificatie en preklinische veiligheidsworkflows.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten over toxicanteffecten op verschillende biologische niveaus en generaties.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve fenotypische resultaten voor de triage van verbindingen.
- Analytics: Maakt statistische vergelijking van dosis-responskarakteristieken en multigeneratie-uitkomsten mogelijk.
- Translationeel Onderzoek: Slaat een brug tussen ecologische en organismische eindpunten en preklinische toxicologie.
- Enterprise Hergebruik: Biedt een flexibel, schaalbaar modelsysteem dat aanpasbaar is aan diverse toxicanten en eindpunten.
Operationele en organisatorische impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in de toxicologie.
- Operationele waarde: Standaardiseert workflows en verbetert de reproduceerbaarheid tussen teams.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en vermindert biologische risico's in een laat stadium.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk op basis van robuuste, multilevel data.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de omgang met ongewervelden en toxicologische protocollen.
- Toegang tot gecontroleerde milieukamers en analytische instrumenten voor fenotypische beoordeling is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams is vereist voor dosis-responscurves en het meten van eindpunten.
- Aanpasbaar voor verschillende ontwikkelingsstadia en klassen van verontreinigende stoffen door middel van protocolwijzigingen.
- Veiligheidsvoorschriften zijn essentieel bij het omgaan met gevaarlijke verbindingen en biologische materialen.
