Beoordeling van collageen en elastine druk-afhankelijke Microarchitectures in Live, menselijke weerstand slagaders door Label-vrije fluorescentie microscopie
9 april 2018
We beschrijven gelijktijdige mechanische testen en 3D-imaging van de arteriële muur van geïsoleerd levende menselijke weerstand slagaders, en Fiji en Ilastik analyses van de afbeelding voor de kwantificering van elastine en collageen ruimtelijke organisatie en volume dichtheden. We bespreken het gebruik van deze gegevens in wiskundige modellen van arteriële muur mechanica.
Het algemene doel van deze methodologie is om een gestandaardiseerde procedure te bieden voor het verkrijgen van beelden van levende menselijke weerstandsslagaders voor analyse van de relatie tussen de microarchitectuur van de extracellulaire matrix en de mechanica van de arteriële wand. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de vasculaire biologie en mechanica, zoals hoe druk veranderingen in de algehele geometrie veroorzaakt, evenals de microarchitectuur van de vaatwand. Het belangrijkste voordeel van de techniek is dat je je monster niet hoeft te labelen voor de beeldvorming.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in de mechanica van weerstandsslagaders, kan een aangepaste versie van het protocol worden toegepast op andere buisvormige organen zoals de bronchiën of op strips van de menselijke blaas of de darmwand. Om te beginnen, verzamel weefselmonsters van belang onmiddellijk na hun excisie tijdens de operatie en bereid de vaten voor zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Breng een gecanuleerde ader onder druk tot vijf millimeter kwik.
Stel vervolgens de optische baan voor de beeldvorming in door de twee-foton laser te activeren en de excitatiegolflengte in te stellen op 820 nanometer. Plaats een 460 nanometer lang doorlaatbare dichroische spiegel om het emissielicht tussen de fotomultipliers te splitsen en de emissie gelijktijdig in twee kanalen te verzamelen. Gebruik 30 tot 60 nanometer brede bandpassfilters gecentreerd op 520 nanometer om de elastine autofluorescentie te verzamelen en een andere gecentreerd op 410 nanometer om het collageen tweede harmonische generatie signaal te verzamelen.
Stel nu de laser verblijftijd en pixel in op 10 microseconden. Stel de resolutie in op 512 bij 512 pixels voor 100% gezichtsveld. Schakel continu scannen in en gebruik zo laag mogelijk excitatielichtvermogen en pixel verblijftijd om fotobeschadiging van de levende ader te voorkomen.
Scan vervolgens handmatig door de ader om het vlak met de maximale diameter te vinden. Kies vervolgens een rechthoekig segment dat de breedste diameter van de ader bedekt en scan een enkele frame met een pixelgrootte van 300 nanometer per pixel of minder. Bewaar dit beeld voor analyse op een later tijdstip.
Om de lumendiameter en wanddikte te bepalen bij de maximale diameter van de ader, laad eerst het beeld in Fiji. Stel de schaal in door op het hoofdmenu te klikken en ga vervolgens naar analyse, gevolgd door schaal instellen. Voer hier de micrometer per pixel en pixelverhouding in.
Kies vervolgens het Fiji lijngereedschap en teken een lijn tussen de twee interne elastische lamina aan elke kant van het arteriële lumen. Klik vervolgens op Control M om de lengte in de resultatentabel te rapporteren. Ga door met het tekenen van meer lijnen om de dikte van elke wand te meten en sla de uiteindelijke meting op.
Verander naar een 60X objectief met een numerieke opening van een of meer. Beeld de collageen- en elastine microarchitectuur op vijf millimeter kwik af door de volledige dikte van de arteriële wand te scannen. Definieer vervolgens de start- en einddiepte van de Z stack en de Z stap afstand en pixeldichtheid.
Zorg er bij het ontwerpen van uw Z stacks voor dat uw interessegebied klein genoeg is om enige interferentie van kromming op uw latere analyse te voorkomen. Wanneer u klaar bent, stelt u in dat elk kanaal afzonderlijk moet worden opgeslagen. Ten slotte, vind een tot drie verschillende interessegebieden en verkrijg 3D beeldastacks van goede kwaliteit.
Als uw elastine autofluorescentie bleken, gebruikt u te hoge excitatielichtvermogen. Dit moet worden vermeden. Om uw lopende experiment af te ronden, kunt u een verdunde concentratie eosine toevoegen om de elastine autofluorescentie te versterken.
Wanneer u klaar bent, herhaalt u het hele proces bij drukken variërend tot 100 millimeter kwik, waarbij u de buffer in de myograafkamer vervangt door verse HBS van 37 graden Celsius na elke drukstap. Om met de beeldanalyse te beginnen, opent u de elastine beeldastack in Fiji. Ga vervolgens naar beeld, klik op stacks en selecteer Z project om de beelden te kiezen waarmee u wilt werken en kies max intensiteit voor projectietype.
Bewaar de max intensiteitsprojectie als een TIFF-afbeelding. Kies vervolgens zoveel mogelijk interne elastische lamina vezelaftakkingen en meet ze met behulp van de hoektool. Werk systematisch door elk beeld en sla de Fiji resultatenblad wanneer u klaar bent.
Om de golvendheid van het adventitiële collageen te meten, opent u de collageen beeldastack in Fiji. Ga vervolgens naar beeld, af tot stacks en selecteer Z project om beelden te kiezen om mee te werken en om de max intensiteitsprojectie in te stellen. Verander nu het beeldtype naar een acht-bits TIFF-afbeelding door op beeld, type en vervolgens acht-bits te klikken.
Bewaar de max intensiteitsprojectie als een TIFF-afbeelding. Open de Neuron J plugin door op Fiji te klikken en Neuron J te selecteren onder plugins. Open vervolgens het acht-bits TIFF bestand in Neuron J. Eenmaal geopend, klik op toevoegen traceringen en selecteer vezels om te analyseren door op het begin en het einde van elke vezel te klikken.
Ga vervolgens naar traceringen meten en kies traceringen en vertex metingen weergeven in het dialoogvenster. Om de collagevezel rechtheid te berekenen, kopieert u eerst de waarden in het Fiji traceringen venster naar Excel. De lengtewaarden in het traceringen venster zijn metingen van de volledige lengte van de geanalyseerde collageenvezels Lf. Ten tweede, kopieert u voor elk geanalyseerde collageenvezelbundel de eerste en laatste XY-coördinaten van het Fiji vertex venster naar Excel.
Bereken vervolgens de lengte van de rechte lijn die elk uiteinde van de geanalyseerde collageenvezel verbindt L0 met behulp van de stelling van Pythagoras. De rechtheid van collageenvezels wordt uiteindelijk berekend als L0/Lf. Volgens het zojuist getoonde protocol werd het breedste deel van de ader geïdentificeerd en op dit punt werd de ader gescand met label-vrije fluorescentiemicroscopie om de maximale vatdiameter en vatwanddikte te meten.
Met behulp van een hogere vergroting tot een objectief met hoge numerieke opening, kunnen niet alleen de vatdiameter en wanddikte worden gemeten, maar ook de microarchitecturen van collageen en elastine. De microarchitecturen van elastinevezelvertakkingshoeken en collage
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een gestandaardiseerde methodologie voor het beeldvormen van levende humane weerstandsslagaders om de relatie tussen de microarchitectuur van de extracellulaire matrix en de mechanica van de arteriële wand te analyseren. De techniek maakt het mogelijk om te beoordelen hoe druk de geometrie en microarchitectuur van de vaatwand beïnvloedt zonder dat er etikettering van monsters nodig is.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Vasculaire biologie
- Biomechaniek
- Extracellulaire matrix-analyse
Achtergrond
- Het begrijpen van de mechanica van de arteriële wand is cruciaal voor de vasculaire gezondheid.
- De extracellulaire matrix speelt een belangrijke rol in de vasculaire structuur en functie.
- Levend beeldvormingstechnieken kunnen inzichten geven in dynamische biologische processen.
- Drukgeïnduceerde veranderingen in de vasculaire geometrie zijn belangrijk voor het begrijpen van hart- en vaatziekten.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het beeldvormen van weerstandsslagaders zonder etikettering.
- Om de relatie tussen microarchitectuur en mechanica van de arteriële wand te onderzoeken.
- Om een protocol te bieden dat toepasbaar is op andere buisvormige organen.
Gebruikte methoden
- Verzameling van weefselmonsters onmiddellijk na chirurgische excisie.
- Voorbereiding van vaten volgens het gedetailleerde protocol.
- De canuleerde slagaders worden geperst tot vijf millimeter kwik.
- Gebruik van Fiji en Ilastik voor beeldanalyse van elastine en collageen.
Belangrijkste resultaten
- Er werd succesvol beeldvorming van levende humane weerstandsslagaders bereikt.
- Kwantificering van de ruimtelijke organisatie van elastine en collageen werd uitgevoerd.
- De verkregen gegevens kunnen worden geïntegreerd in wiskundige modellen van arteriële mechanica.
- De methode toont potentieel voor toepassing in andere orgaansystemen.
Conclusies
- De ontwikkelde methodologie verbetert het begrip van vasculaire mechanica.
- Het biedt een niet-invasieve benadering om de eigenschappen van de arteriële wand te bestuderen.
- Deze techniek kan worden aangepast voor verschillende biologische weefsels.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding pressure-induced microarchitectural changes in resistance arteries supports target validation in cardiovascular drug discovery by linking extracellular matrix remodeling to hemodynamic stress. This label-free imaging approach enables mechanistic de-risking of vascular targets through quantitative assessment of collagen and elastin reorganization under physiologically relevant pressures. The method provides predictive confidence for preclinical models by delivering reproducible, label-independent structural data that can inform mathematical models of arterial mechanics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying pressure-dependent changes in elastin fiber branching angles and collagen straightness as direct readouts of vascular wall remodeling.
- Operational Value: Provides label-free, live-tissue imaging that avoids exogenous markers, preserving native microarchitecture for accurate mechanistic assessment.
- Predictive Value: Supports preclinical model validation by generating quantitative microarchitectural parameters (e.g., collagen straightness, elastin alignment) that correlate with mechanical stiffness and disease progression.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, reproducible 3D image stacks of elastin and collagen microarchitecture that can be used to establish baseline vascular phenotypes for compound screening campaigns.
- Quantitative Output: Delivers measurable endpoints such as internal elastic lamina branching angles and collagen fiber straightness (L0/Lf) suitable for high-content analysis and dose-response modeling.
- Platform Reuse: The protocol’s adaptability to other tube-like organs (e.g., bronchi, intestinal wall) supports cross-tissue target validation and assay portability across discovery programs.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly addresses pathogenic mechanisms in hypertension, diabetes, and metabolic syndrome where resistance artery remodeling is a known contributor.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical stages by providing human-derived microarchitectural data that can be integrated into computational models to predict in vivo responses to pharmacological interventions.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on whether test compounds normalize pressure-induced microarchitectratic changes, reducing late-stage failure due to unanticipated vascular toxicity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical assessment, offering a human-relevant platform to evaluate how candidate compounds affect vascular extracellular matrix dynamics under physiological pressure conditions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling direct observation of how pressure alters elastin and collagen microarchitecture, clarifying mechanisms of vascular stiffening and remodeling.
- Screening: Generates standardized, quantitative image-based readouts (e.g., fiber straightness, branching angles) that are amenable to automation and multi-parametric analysis in screening cascades.
- Analytics: Outputs structural metrics that feed into mathematical models of arterial wall mechanics, allowing teams to correlate microarchitectural changes with functional outcomes like incremental elastic modulus.
- Translational Research: Uses live human resistance arteries to ensure disease relevance and improve predictive power when extrapolating findings to clinical vascular responses.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis workflow applicable across cardiovascular, metabolic, and fibrotic disease programs studying vascular remodeling.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence by reducing ambiguity in how vascular extracellular matrix responds to hemodynamic stress, a key factor in cardiovascular pathogenesis.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized pressure steps, imaging parameters, and validated analysis pipelines using Fiji and Ilastik.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of vascular liabilities, thereby reducing attrition in later preclinical or clinical stages.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of compounds based on their ability to mitigate pressure-induced maladaptive remodeling in human resistance arteries.
Implementation Considerations
- Requires expertise in vascular tissue handling, two-photon microscopy, and pressure myography to maintain artery viability and image quality during pressurization steps.
- Dependent on specialized instrumentation including tunable two-photon laser, high-NA objectives (60X, NA ≥1.0), dichroic mirrors, and bandpass filters for simultaneous elastin and collagen signal detection.
- Necessitates cross-team standardization between biology, imaging, and analysis teams to ensure consistent Z-stack acquisition, region-of-interest selection, and application of Neuron J and Fiji tools for fiber tracing and angle measurement.
- Adaptation to non-human or diseased tissues may require optimization of excitation power to prevent photobleaching, particularly for elastin autofluorescence, and validation of structural metrics across species or pathology states.
- Practical limitations include the technical challenge of maintaining live artery perfusion during extended imaging sessions and the need for careful pressure-step sequencing to avoid mechanical damage.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:02
Imaging of the Artery Using TPEM
2:47
Diameter and Wall Thickness Measurement
3:33
Imaging the Collagen and Elastin Microarchitecture
5:10
Image Analysis Internal Elastic Lamina Branching Angles
5:51
Image Analysis - Collagen Fiber Straightness
7:46
Results: Measurement of the Microstructural Changes in Adventitial Collagen and the Internal Elastic Lamina in Response to Vessel Pressure
8:48
Conclusion
