Name: Beoordeling van collageen en elastine druk-afhankelijke Microarchitectures in Live, menselijke weerstand slagaders door Label-vrije fluorescentie microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Leer een labelvrije fluorescentiemicroscopiemethode voor het in beeld brengen van levende menselijke resistentie-arteriën. Deze techniek analyseert de microarchitectuur van collageen en elastine onder druk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs bedanken het Deens moleculaire Biomedical Imaging Center op de faculteit of Natural Sciences, Universiteit van Zuid-Denemarken, voor het gebruik van laboratoria en microscopen. Kristoffer Rosenstand en Ulla Melchior worden erkend voor uitstekende technische bijstand met de druk myography en imaging.

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit werk vertegenwoordigt onze suggestie voor een gestandaardiseerde, gecombineerde beeldvorming en druk myography aanpak, waardevol voor gelijktijdige evaluatie van de mechanische eigenschappen van weerstand slagaders en druk-gerelateerde veranderingen in de structuur van het arterial muur over een drukbereik van 0 tot 100 mmHg. De voorgestelde aanpak werd ontwikkeld met behulp van aangepaste ingebouwde apparatuur, echter druk myograph die op een twee-foton excitatie fluorescentie Microscoop past kan worden gebruikt, wa...

De pathogene bijdrage en de gevolgen van het remodelleren van de slagader van de weerstand worden beschreven in essentiële hypertensie, diabetes en het metabool syndroom1,2,3,4,5. Ontcijferen van de relatie tussen de eigenschappen van het mechanische en microarchitectural van de microvasculaire muur is essentieel voor de ontwikkeling van wiskundige modellen van deze vereniging. Dergelijke modellen inzicht in het remodelleert proces zal verbeteren en de ontwikkeling van in silico modellen handig voor het testen van farmacologische strategieën gericht op ziekte gerelateerde remodelleren van de arteriële muur zullen steunen.
Voorafgaande studies gericht in het begrip van hoe de microarchitectuur van de arteriële muur heeft betrekking op arteriële muur mechanica door mechanische maatregelen te nemen en de microarchitectuur van de extracellulaire matrix (ECM) worden bijna uitsluitend uitgevoerd op grote , elastische conduit slagaders van muizen of varkens6,7,8,9,10,11. Beeldvorming van de microstructuren van de muur worden doorgaans uitgevoerd met behulp van niet-lineaire optische technieken, profiteren van de autofluorescence van elastine en tweede-harmonische generatie door collageen. Hierdoor Spatio beeldvorming van de twee belangrijke componenten van de extracellulaire matrix, elastine en collageen, zonder behoefte aan een kleuring. Beeldvorming van de arteriële muur in volledige dikte is een uitdaging in grote conduit slagaders als gevolg van de spreiding van het licht in de dikke tunica media. Echter, om te bepalen hoe de microarchitectuur van de structurele onderdelen van de arteriële muur zich verhouden tot de waargenomen mechanische eigenschappen, driedimensionale informatie moet worden verkregen tijdens de mechanische testen. Voor grote slagaders zoals de menselijke aorta hiervoor biaxial montage, mechanische testen en beeldvorming van gebieden van belang in 1-2 cm2 stukken van de arteriële muur7,9,10, 12. slechts een deel van de muur kan worden beeld en mechanisch getest.
Voor kleinere slagaders van elke soort (bijvoorbeeld, menselijke pericardvocht13, pulmonale14 en subcutane15 slagaders, rat mesenterische slagaders16,17,18, 19 , 20, muis cremaster, lymfklieren, cerebrale, femur en halsslagaderen21,22,23,24,25,26, 27) beeldvorming van de gehele wanddikte is mogelijk en kan gecombineerd worden met mechanische testen. Hierdoor wordt gelijktijdige opname van de mechanische eigenschappen en de structurele regelingen binnen de stadsmuur. Echter is een directe wiskundige modellering van de relatie tussen de waargenomen veranderingen in de driedimensionale structuur van de ECM en gewijzigde mechanische eigenschappen van de arteriële muur van verzet, om het beste van onze kennis alleen gemeld op recent in de menselijke weerstand slagaders13,15.
In dit werk, wordt een ex vivo voor passieve mechanische testen en gelijktijdige driedimensionale beeldvorming van de microarchitectuur van elastine en collageen in de arteriële muur van geïsoleerde menselijke weerstand slagaders beschreven. Het imaging protocol kan worden toegepast op weerstand slagaders van elke soort van belang. Beeld analyses worden beschreven voor het verkrijgen van de maatregelen van interne elastische lamina vertakkende hoeken en adventitial collageen rechtheid13 met behulp van Fiji28. Collageen en elastine volume dichtheden worden bepaald met behulp van de Ilastik software29 en ten slotte de opname van de mechanische en imaging gegevens in wiskundige modellen van de arteriële muur mechanica wordt besproken.
Het doel van het beschrijven van de beeldvorming en beeld analyses technieken in combinatie met wiskundige modellering is bedoeld als onderzoekers een planmatige aanpak om te beschrijven en te begrijpen waargenomen druk geïnduceerde veranderingen in de ECM van weerstand slagaders. De beschreven methode is gericht op het kwantificeren van de veranderingen in de ECM in een vaartuig tijdens drukregeling, door het vergelijken van de structuur van de ECM bij 20, 40 en 100 mmHg. Deze druk werden gekozen voor de bepaling van de structuur van de arteriële muur op de meer compatibele (20 mmHg), de stijf (100 mmHg) en de intermediaire (40 mmHg) status, respectievelijk. Echter kan een proces in de vasculaire muur van levende slagaders, met inbegrip van wijzigingen veroorzaakt door vasoactieve onderdelen, hysteresis en stroom, worden gekwantificeerd, afhankelijk van de onderzoek-hypothese in kwestie door de onderzoeker.
Het gebruik van twee-foton excitatie fluorescentie microscopie (TPEM) in combinatie met een druk myograph voor studeren druk (of andere) veroorzaakte veranderingen in de ECM van levende slagaders wordt benadrukt. Ten eerste, omdat hierdoor gelijktijdige overname van de totale driedimensionale structuur van de arteriële muur (diameter en muur dikte) samen met driedimensionale label-vrije verwerving van hoge kwaliteit, gedetailleerde beelden van de collageen en elastine microarchitectures als beschreven13 door te profiteren van de elastine-autofluorescence en de collageen tweede harmonische generatie signaal (SHG)30. Ten tweede, TPEM maakt gebruik van lage-energie nabij-infrarood excitatie licht, minimaliseren van photodamage van het weefsel en dus herhaalde beeldvorming op precies dezelfde positie binnen de vasculaire muur is toegestaan, executoriale herhaald-metingen analyses van waargenomen wijzigingen.
Het gebruik van een alternatieve aanpak met behulp van de confocal beeldvorming van druk vaste slagaders wordt besproken zodat gebruikers zonder toegang tot TPEM kunnen gebruiken van de beschreven methode ook. Uit twee-dimensionale analyses van weefsels gesegmenteerd in seriële, bijvoorbeeld zoals beschreven door31,32kan ook informatie over ECM structuur en volume dichtheden worden opgehaald. Als gevolg van het ontbreken van de mogelijkheid tot drie-dimensionale structurele informatie ophalen over de schalen van de lengte van de slagader en tijdens het veranderende omstandigheden met behulp van deze methode, het is echter niet raden deze aanpak voor onderzoek van druk en behandeling geïnduceerde driedimensionale veranderingen in de ECM.
De minimale eis voor de onderzoeker de hierin beschreven methode toe te passen is de toegang tot een setup voor cannulation en drukregeling van de slagaders in combinatie met een confocal of twee-foton excitatie fluorescentie Microscoop. De setup beschreven in het volgende protocol is een op maat gemaakte druk myograph met een longitudinale kracht transducer, built to fit op een aangepaste gebouwde omgekeerde twee-foton excitatie fluorescentie Microscoop.

<table><tbody><tr><td>Fine Science Tools</td><td>15401-12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine Science Tools</td><td>11251-23</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Sigma-Aldrich, Br&oslash;ndby, Denmark.</td><td>761028</td><td>voor dissectiedoeleinden</td><td></td></tr><tr><td>Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark</td><td>1.63, 2.13, 210mm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Smiths medical Intl, UK</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethicon</td><td>Ethilon 11-0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Op maat gebouwd</td><td></td><td>DK octrooinummer 201200167, Universiteit van Zuid-Denemarken, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt</td><td></td></tr><tr><td>Mettler toledo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Sigma-Aldrich, Br&oslash;ndby, Denmark.</td><td>B3259</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Sigma-Aldrich, Br&oslash;ndby, Denmark.</td><td>A7030</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Sigma-Aldrich, Br&oslash;ndby, Denmark.</td><td>C5670</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Sigma-Aldrich, Br&oslash;ndby, Denmark.</td><td>G7021</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Sigma-Aldrich, Br&oslash;ndby, Denmark.</td><td>E3889</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Merck Millipore, Hellerup, Denmark</td><td>1.00496.9010</td><td>Fosfaat gebufferde (pH 6,9) 4% formaldehyde oplossing&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Sigma-Aldrich, Br&oslash;ndby, Denmark.</td><td>H3784</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Sigma-Aldrich, Br&oslash;ndby, Denmark.</td><td>P9666</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Sigma-Aldrich, Br&oslash;ndby, Denmark.</td><td>P5655</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Sigma-Aldrich, Br&oslash;ndby, Denmark.</td><td>M2643</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Sigma-Aldrich, Br&oslash;ndby, Denmark.</td><td>S2002</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Sigma-Aldrich, Br&oslash;ndby, Denmark.</td><td>S5886</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Sigma-Aldrich, Br&oslash;ndby, Denmark.</td><td>S5761</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Sigma-Aldrich, Br&oslash;ndby, Denmark.</td><td>1.06462</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>10010015</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Sigma-Aldrich, Br&oslash;ndby, Denmark.</td><td>PHR1423</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Sigma-Aldrich, Br&oslash;ndby, Denmark.</td><td>Z370525</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Tocris Bioscience, Bristol, UK</td><td>538944</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td>Op maat gebouwd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectra Physics, Mountain View, CA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td>CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersie) NA 0.75</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu, Ballerup, Denmark</td><td>H7422P-40</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AHF analysentechnik AG (T&uuml;bingen, Germany).</td><td>ChromaET 460 nm long pass dichroic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AHF analysentechnik AG (T&uuml;bingen, Germany).</td><td>Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AHF analysentechnik AG (T&uuml;bingen, Germany).</td><td>Chroma ET402/15X&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scotch TM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>dekkingsdikte moet overeenkomen met gebruikte objectief op microscoop (#1 of #1.5), alternatief, stel aanpassingskraag in op dekglas</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

beoordeling van collageen en elastine druk-afhankelijke microarchitectures in live, menselijke weerstand slagaders door label-vrije fluorescentie microscopie

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

De pathogene bijdrage aan het remodelleren van de slagader van de weerstand wordt beschreven in essentiële hypertensie, diabetes en het metabool syndroom. Onderzoek en ontwikkeling van microstructurally gemotiveerd wiskundige modellen voor het begrijpen van de mechanische eigenschappen van menselijke weerstand slagaders in gezondheid en ziekte hebben het potentieel om te helpen begrijpen hoe ziekte en medische behandelingen invloed op de menselijke microcirculatie. Ontwikkeling van deze wiskundige modellen, is het essentieel om te ontcijferen van de relatie tussen de eigenschappen van het mechanische en microarchitectural van de microvasculaire muur. In dit werk beschrijven we een ex vivo -methode voor het passieve mechanische testen en gelijktijdige label-free driedimensionale beeldvorming van de microarchitectuur van elastine en collageen in de arteriële muur van geïsoleerde menselijke weerstand slagaders. Het imaging protocol kan worden toegepast op weerstand slagaders van elke soort van belang. Beeld analyses worden beschreven voor het kwantificeren van i) druk-geïnduceerde veranderingen in interne elastische lamina vertakkende hoeken en adventitial collageen rechtheid met behulp van Fiji en ii) collageen en elastine volume dichtheid bepaald met behulp van de Ilastik software. Bij voorkeur alle mechanische en imaging metingen worden uitgevoerd op live, geperfundeerd slagaders, is echter een alternatieve aanpak met behulp van video-microscopie standaarddruk myography in combinatie met na fixatie beeldvorming van opnieuw onder druk staande schepen besproken. Deze alternatieve methode biedt gebruikers met verschillende opties voor analyse benaderingen. De opname van de mechanische en imaging gegevens in wiskundige modellen van de arteriële muur mechanica wordt besproken, en toekomstige ontwikkeling en toevoegingen aan het protocol worden voorgesteld.

De op maat gemaakte druk myograph voor imaging gebruikt in dit werk is afgebeeld in Figuur 1. Speciale aandacht voor het ontwerp van de myograph werd besteed aan i) de kamer met een klein volume (2 mL) en ii) de mogelijkheid voor het plaatsen van de canules dicht bij en parallel met de glazen bodem (figuur 1B). De bodem van de kamer past een 50 × 24 mm #1.5 glas dekglaasje aan (vervangbare). De druk-controller werd gebouwd uit ee...

We beschrijven gelijktijdige mechanische testen en 3D-imaging van de arteriële muur van geïsoleerd levende menselijke weerstand slagaders, en Fiji en Ilastik analyses van de afbeelding voor de kwantificering van elastine en collageen ruimtelijke organisatie en volume dichtheden. We bespreken het gebruik van deze gegevens in wiskundige modellen van arteriële muur mechanica.

Beoordeling van collageen en elastine druk-afhankelijke Microarchitectures in Live, menselijke weerstand slagaders door Label-vrije fluorescentie microscopie

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

Het algemene doel van deze methodologie is om een gestandaardiseerde procedure te bieden voor het verkrijgen van beelden van levende menselijke weerstandsslagaders voor analyse van de relatie tussen de microarchitectuur van de extracellulaire matrix en de mechanica van de arteriële wand. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de vasculaire biologie en mechanica, zoals hoe druk veranderingen in de algehele geometrie veroorzaakt, evenals de microarchitectuur van de vaatwand. Het belangrijkste voordeel van de techniek is dat je je monster niet hoeft te labelen voor de beeldvorming.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de mechanica van weerstandsslagaders, kan een aangepaste versie van het protocol worden toegepast op andere buisvormige organen zoals de bronchiën of op strips van de menselijke blaas of de darmwand. Om te beginnen, verzamel weefselmonsters van belang onmiddellijk na hun excisie tijdens de operatie en bereid de vaten voor zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Breng een gecanuleerde ader onder druk tot vijf millimeter kwik.Stel vervolgens de optische baan voor de beeldvorming in door de twee-foton laser te activeren en de e

assessing-collagen-elastin-pressure-dependent-microarchitectures-live

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Cellulaire processen zoals celmigratie van oudsher bestudeerd op twee-dimensionale, stijve kunststof oppervlakken. Dit rapport beschrijft een techniek voor het direct visualiseren eiwit lokalisatie en het analyseren van eiwitten dynamiek in cellen migreren in een meer fysiologisch relevante, drie-dimensionale matrix.

Live-cell imaging van het migreren van cellen die fluorescent-gemerkte eiwitten in een drie-dimensionale Matrix

Raman spectroscopie is een geschikte techniek voor de non-contact, label-free analyse van levende cellen, weefsel-engineering constructen en cellen. Bronspecifieke spectrale vingerafdrukken worden gegenereerd en geanalyseerd met multivariate analyse.

Non-contact, Label-free monitoring van cellen en extracellulaire matrix met behulp van Raman spectroscopie

Dit artikel behandelt een methode om fluorescerend label collageen dat verder kan worden gebruikt voor zowel vaste en levende beeldvorming van 3D celculturen. Wij bieden ook een geoptimaliseerd protocol om endogene cytoskeleteiwitten van cellen gekweekt in 3D-omgevingen te visualiseren.

Het openbaren van de organisatie van het cytoskelet van invasieve kankercellen in 3D

Time-lapse microscopie- en beeldverwerkingstechnieken werden gebruikt om fibroblastgemedieerde gelverdichting en fibrinevezelherschikking in een milieuvriendelijke bioreactor gedurende een periode van 48 uur te observeren en te analyseren.

Observeren en kwantificeren van fibroblast-gemedieerde Fibrin Gel Compaction

De ziekte van Dupuytren (DD) is een fibroproliferatieve ziekte van de palm van de hand. Hier presenteren we een protocol om de cultuur resectiepreparaten van DD in een driedimensionale (3D) cultuur systeem. Een dergelijke tijdelijke kweeksysteem maakt behoud van de 3D structuur en moleculaire eigenschappen van het fibrotische weefsel.

Menselijke Dupuytren<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultuur voor de Studie van Myofibroblasten en extracellulaire matrix interacties

Vasculaire celfunctie is afhankelijk van de activiteit van intracellulaire boodschappers. Hier wordt een ex vivo twee-foton beeldvormingsmethode beschreven die de meting van intracellulaire calcium- en stikstofmonoxideniveaus mogelijk maakt in reactie op fysiologische en farmacologische stimuli in individuele endotheel- en gladde spiercellen van een geïsoleerde aorta.

Twee-foton Imaging van intracellulaire Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Behandeling en stikstofoxide productie in endotheelcellen en gladde spiercellen van een geïsoleerd Rat Aorta

Hier wordt een protocol gepresenteerd om de coronaire microcirculatie in levend murinehartweefsel te bestuderen door ex vivo monitoring van de arteriële perfusiedruk en -stroom die de druk handhaaft, evenals vasculaire boomcomponenten, waaronder de capillaire bedden en pericyten, omdat de septale slagader wordt ingeblikt en onder druk staat.

Dynamische meting en beeldvorming van haarvaten, slagaders en pericyten in muishart

We hebben een mechano-imaging pijplijn ontwikkeld om de heterogene structurele en mechanische atherosclerotische plaque-eigenschappen te bestuderen. Deze pijplijn maakt correlatie mogelijk van de lokale overheersende hoek en dispersie van collageenvezeloriëntatie, het breukgedrag en de spanningsvingerafdrukken van het vezelige plaqueweefsel.

Een methode om de correlatie tussen lokale collageenstructuur en mechanische eigenschappen van atherosclerotisch plaquevezelig weefsel te bestuderen

Hier presenteren we een protocol voor het behoud van de menselijke arteriële architectuur door weefselstabiliserende gel in het vaatlumen te infuseren voordat deze wordt doorgesneden voor moleculaire of histopathologische analyse.

In vitro Intraluminale gelinfusie: een geavanceerde benadering voor microscopische analyse van menselijke weerstandsslagaders

Het doel van deze studie was om de inheemse drie gelaagde architectuur van de vaatwand na te bootsen. Om dit te bereiken, was electrospinning in dienst met het gebruik van een 3-1 (input-output) nozzle en mengsels van polycaprolacton, elastine en collageen.

Tri-gelaagde Electrospinning Native Arteriële Architectuur met behulp van polycaprolacton, Elastine en Collageen Mimic: Een voorbereidende studie

Leer een labelvrije fluorescentiemicroscopiemethode voor het in beeld brengen van levende menselijke resistentie-arteriën. Deze techniek analyseert de microarchitectuur van collageen en elastine onder druk.

Beoordeling van collageen en elastine druk-afhankelijke Microarchitectures in Live, menselijke weerstand slagaders door Label-vrije fluorescentie microscopie (Video) | JoVE Journal

Beoordeling van collageen en elastine druk-afhankelijke Microarchitectures in Live, menselijke weerstand slagaders door Label-vrije fluorescentie microscopie

Meer video's verkennen