Name: Image-Guided resectie van Glioblastoma en intracraniële implantatie van therapeutische stamcel-geplaatste steigers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Leer chirurgische resectie van hersentumoren bij muizen met implantatie van therapeutische stamcellen op een scaffold. Deze methode evalueert de effectiviteit van celtherapie en scaffold-gebaseerde leveringssystemen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen redactionele bijdragen van Dr. Kathryn Pietrosimone. PLA steigers werden vervaardigd door Dr. Elizabeth Loboa van lab aan de North Carolina State University. Dit werk werd gesteund door de UNC-Lineberger uitgebreide Cancer Center Universiteit Cancer Research Fund en de UNC-translationeel en klinische wetenschappen Instituut (KL2TR001109, UL1TR001111).

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van North Carolina te Chapel Hill.
Opmerking: Deze procedure is uitgevoerd bij muizen met een open craniotomy, als een gewijzigde versie van het protocol door Mostany en deur-Cailliau19 waarin het botweefsel die operatief is verwijderd is verwijderd, waardoor de hersenen toegankelijk voor vestiging en uiteindelijke resectie van GBM tumoren. Na craniotomy, tumoren worden vastgesteld via stereotactische implantatie zoals beschreven in Ozawa en James20. We implantaat 1 x 105 U87 mCh-Fl cellen op de volgende stereotactische coördinaten (in mm van bregma): (2.5, 0 -0,5).
1. de celcultuur en steigerwerk voorbereiding
Opmerking: Steigers moeten bereid zijn 48u vóór in muizen. De volgende hoeveelheden worden geleverd op basis van de per-steiger. Vermenigvuldigen hoeveelheden desgewenst voor extra steigers.
<ol><li>PLA steigers in Holte en middelgrote resectie (ongeveer 2 x 2 mm) stukken gesneden. Steigers kunnen worden gesneden met de hand met behulp van schaar of met behulp van een perforator voor herhaalbaarheid.</li>
	<li>Steriliseren door het onder te dompelen in 70% ethanol gedurende 15 minuten gevolgd door het onder te dompelen in PBS. Plaats de steiger in Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine bij de voorbereiding van de cellen voor het zaaien.</li>
	<li>Lift gekweekt MSCs met behulp van 0,05% trypsine (3-5 mL voor de kolf van een T75). Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten ervoor zorgen dat de cellen hebben opgeheven, dan 7-10 mL DMEM Voeg aan de maatkolf aan inactivering van trypsine.</li>
	<li>Inhoud van de kolf overbrengen in een centrifugebuis van 15 mL. Cellen tellen met behulp van een hemocytometer. Pellet 5 x 105 MSCs voor elke steiger via centrifugeren bij 100 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Gecombineerd uit supernatant en resuspendeer MSCs in 5 µL DMEM per 5 x 105 cellen.</li>
	<li>Voorbereiden op de steigers zaaien door klopte ze droog.<ol>
<li>Een steiger uit DMEM onderdompeling verwijderen met pincet en tijdelijk op het deksel van de 6-well plaat plaatsen. Til de steiger uit het deksel, waardoor er achter een druppel van overtollige DMEM.</li>
		<li>Plaats het schavot terug op het deksel weer op een nieuwe, droge plaats. 3 - 5 keer herhalen, dan plaatst u het gedeeltelijk gedroogde schavot in een nieuwe 6-well plaat voor het zaaien. Herhaal voor elke steiger. Opmerking: Een gedeeltelijk gedroogde steiger biedt optimale cel seeding resultaten. Als de steiger te nat is, zal cellen glijden van de steiger en voldoen aan de onderstaande goed plaat. Als de steiger te droog is, zal de druppel niet verspreid over het hele schavot, resulterend in slechte eerste cel distributie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Met behulp van een precisiepipet, meng voorzichtig de flacon van stamcellen te homogeniseren van de schorsing, zoals sommige cellen kunnen hebben geregeld naar de bodem.</li>
	<li>Langzaam Pipetteer 2.5 µL vers gemengd MSC schorsing rechtstreeks op de steiger, een kleine druppel maken over de bovenkant van de steiger.</li>
	<li>Voeg 300 µL DMEM aan de randen van elk putje. Dit voorkomt snelle verdamping van de cel druppel. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten, waardoor de cellen om te koppelen aan de steiger.</li>
	<li>Met een tang, zachtjes flipover de steigers in de goed plaat. Zaad 2.5 µL vers gemengd MSC schorsing (dit resulteert in een totaal van 5 x 105 cellen zaadjes per steiger). Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten, waardoor de cellen om te koppelen aan de steiger.</li>
	<li>Betrekking hebben op de steigers in DMEM door toevoeging van 2 mL aan elk putje van de plaat 6-well. Zachtjes til de steigers om media stromen onder hen toe te staan. Incubeer bij 37 ° C in deze staat voor 48 uur vóór de ingreep van de innesteling.</li>
	<li>Check de steigers na 24 h en toevoegen/wijzigen media als overtollige verdamping of verkleurde media als gevolg van onbalans van de pH wordt waargenomen.</li>
</ol>2. fluorescentie-geleide resectie en steiger implantatie
Opmerking: Steriliseren alle instrumenten vóór de operatie te initialiseren. Beheren profylactische analgesie zoals beschreven in uw institutionele IACUC protocol.
<ol><li>Plaats het stereotaxic frame in het werkgebied van een fluorescentie ontrafeling van de stereomicroscoop.</li>
	<li>Anesthetize de muis onder geïnhaleerde Isofluraan in een inductie-zaal. Zodra verdoofd, beveiligde de muis in het stereotaxic frame met continue geïnhaleerde verdoving levering via een Isofluraan neus adapter. Handhaven lichaamstemperatuur met een verwarming pad en/of de sonde. Opmerking: 4-5% Isofluraan is geschikt voor inductie en 2-3% is geschikt voor onderhoud, maar dit moet worden aangepast en kan worden gecontroleerd voor elke muis.</li>
	<li>Ophthalmic zalf toepassen op de ogen om te voorkomen dat het drogen van het hoornvlies. De site van de insnijding van de hoofdhuid met een reeks van drie alcohol en drie betadine doekjes te steriliseren.</li>
	<li>Teen snuifje reflex test uitvoeren op elke ledemaat en bevestigen van negatieve reactie om ervoor te zorgen de juiste afstomping. Zorgen voor een gestage respiratoire tempo ongeveer 55-65 adem/min.</li>
	<li>Met behulp van Tang, knijpen en zachtjes til de hoofdhuid. Maak een middellijn lineaire rostraal-caudal incisie met chirurgische scharen. Bevloeiing van de site van de incisie met PBS en onderhuidse vet verwijderen met een katoen-tip applicator in een cirkelmotie poetsen. Schik de huid zodat het eerder in de Gemeenschap gevestigde craniale venster volledig zichtbaar is.</li>
	<li>Voorzichtig doorprikken de dura net interieur aan de randen van de craniale venster met behulp van een naald 18-G. Herhaal totdat de incisie volledig de binnenkant van het venster traceert.</li>
	<li>Verwijder de dura door peeling weg met behulp van fijne pincet, onthullen de onderliggende parenchym en tumor.</li>
	<li>Zoek de U87 mCh-Fl tumor kamer lichten uitschakelen en de stereomicroscoop fluorescentie-modus inschakelen. Resectie voorbereiden door het laden van een 1-200 µL pipette uiteinde in het einde van de buis van een vacuümpomp.</li>
	<li>Zet de vacuümpomp. Resect de tumor door zachtjes zuigen fluorescerende weefsel totdat er geen signaal overblijft. De vacuümpomp uitschakelen en verwijderen van het uiteinde van de pipet. Draai de fluorescentie af en de kamer lichten weer op. Opmerking: Als u wilt bepalen bloeden, irrigeren met koude PBS en constante druk uitoefenen met een katoen-tip applicator. In meer ernstige gevallen, kan de resectie holte ook tijdelijk verpakt worden met een hemostatische agent, zolang het wordt verwijderd nadat het bloeden is gestopt gevolgd door een ander PBS irrigatie.</li>
	<li>Onmiddellijk voorafgaand aan de implantatie, dompel langzaam een MSC-geplaatste PLA steiger in PBS om ongewenste media en bijbehorende onderdelen te verwijderen. Implantaat de steiger in de holte van de resectie. Indien nodig, voeg 1 µL fibrinogeen (67-106 mg/mL) gevolgd door 1 µL trombine (400-625 U/mL) teneinde de steiger in plaats.</li>
	<li>Zegel met de dura verwijderd en de klep van het bot van de craniale venster reeds verwijderd, de wonde gewoon door de huid te sluiten en het toepassen van chirurgische lijm. Het dier van geïnhaleerde verdoving verwijderen en laten herstellen op een verwarmd oppervlak.</li>
	<li>Eenmaal ambulante, terugkeer muis naar kooi. Pijnstiller op IACUC-goedgekeurd schema te beheren. Herhaal de procedure voor elke muis.</li>
</ol>3. postoperatieve Imaging
<ol><li>Met behulp van de 28-G insuline spuit, injecteert muizen met D-luciferine (150 mg/kg intraperitoneaal).</li>
	<li>Wacht 10 minuten. Hierdoor zal de luciferine circuleren door het lichaam en reageert met de kankercellen luciferase-uitdrukken in de hersenen te verkrijgen van de piek expressie.</li>
	<li>Beeld onder Isofluraan verdoving (zoals eerder vermeld), muizen in een bioluminescentie imaging (BLI) systeem om te visualiseren van de tumoren. Variëren belichtingstijden als nodig (seconden tot minuten) afhankelijk van de grootte van de tumor.</li>
	<li>Herhaal imaging procedure nodig voor het bepalen van de tumor groei kinetiek. Blijven volgen van diergezondheid. Opmerking: De therapeutische MSCs zal constitutively express TRAIL, doden van kankercellen en onderdrukken van de totale tumorgroei. Imaging elke 2-5 dagen levert voor dit doel voldoende frequentie.</li>
	<li>Wanneer vooraf bepaalde eindpunten die worden beschreven in het IACUC-protocol is voldaan, offeren muizen door transcardial perfusie en verzamelen van weefsels voor analyse.</li>
</ol>

<ol><li>Adamson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+multiforme%3A+a+review+of+where+we+have+been+and+where+we+are+going%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+investigational+drugs%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma multiforme: a review of where we have been and where we are going.</a> Expert opinion on investigational drugs. 18 (8), 1061-1083 (2009).</li>
<li>Asthagiri, A. R., Pouratian, N., Sherman, J., Ahmed, G., Shaffrey, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Brain+Tumor+Surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Neurologic+Clinics%22%5BJournal%5D)">Advances in Brain Tumor Surgery.</a> Neurologic Clinics. 25 (4), 975-1003 (2007).</li>
<li>Affronti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overall+survival+of+newly+diagnosed+glioblastoma+patients+receiving+carmustine+wafers+followed+by+radiation+and+concurrent+temozolomide+plus+rotational+multiagent+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Overall survival of newly diagnosed glioblastoma patients receiving carmustine wafers followed by radiation and concurrent temozolomide plus rotational multiagent chemotherapy.</a> Cancer. 115 (15), 3501-3511 (2009).</li>
<li>Erpolat, O., Akmansu, M., Goksel, F., Bora, H., Yaman, E., Büyükberber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcome+of+newly+diagnosed+glioblastoma+patients+treated+by+radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide%3A+a+long-term+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Tumori%22%5BJournal%5D)">Outcome of newly diagnosed glioblastoma patients treated by radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide: a long-term analysis.</a> Tumori. 95 (2), 191-197 (2009).</li>
<li>Minniti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma+in+elderly+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma in elderly patients.</a> Journal of Neuro-Oncology. 88 (1), 97-103 (2008).</li>
<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> The New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).</li>
<li>Delgado-López, P., Corrales-García, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+in+glioblastoma%3A+a+review+on+the+impact+of+treatment+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities.</a> Clinical and Translational Oncology. 18 (11), 1062-1071 (2016).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticle-labeled+mesenchymal+stem+cell+tropism+to+malignant+gliomas+using+magnetic+resonance+imaging.+Laboratory+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of superparamagnetic iron oxide nanoparticle-labeled mesenchymal stem cell tropism to malignant gliomas using magnetic resonance imaging. Laboratory investigation.</a> Journal of Neurosurgery. 108 (2), 320-329 (2008).</li>
<li>Nakamizo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+the+treatment+of+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the treatment of gliomas.</a> Cancer Research. 65 (8), 3307-3318 (2005).</li>
<li>Xu, F., Shi, J., Yu, B., Ni, W., Wu, X., Gu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+mediate+mesenchymal+stem+cell+migration+toward+gliomas+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemokines mediate mesenchymal stem cell migration toward gliomas in vitro.</a> Oncology Reports. 23 (6), 1561-1567 (2010).</li>
<li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR4-transfected+human+umbilical+cord+blood-derived+mesenchymal+stem+cells+exhibit+enhanced+migratory+capacity+toward+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">CXCR4-transfected human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells exhibit enhanced migratory capacity toward gliomas.</a> International Journal of Oncology. 38 (1), 97-103 (2011).</li>
<li>Ho, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Metalloproteinase+1+Is+Necessary+for+the+Migration+of+Human+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+Toward+Human+Glioma%5BTitle%5D)+AND+%22STEM+CELLS%22%5BJournal%5D)">Matrix Metalloproteinase 1 Is Necessary for the Migration of Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Toward Human Glioma.</a> STEM CELLS. 27 (6), 1366-1375 (2009).</li>
<li>Bexell, D., Svensson, A., Bengzon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-based+therapy+for+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treatment+Reviews%22%5BJournal%5D)">Stem cell-based therapy for malignant glioma.</a> Cancer Treatment Reviews. 39 (4), (2012).</li>
<li>Nouri, F., Wang, X., Hatefi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+theranostic+mesenchymal+stem+cells+for+the+evaluation+of+the+anticancer+efficacy+of+enzyme%2Fprodrug+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered theranostic mesenchymal stem cells for the evaluation of the anticancer efficacy of enzyme/prodrug systems.</a> Journal of Controlled Release. 200, 179-187 (2015).</li>
<li>Kauer, T., Figueiredo, J. -L., Hingtgen, S., Shah, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+therapeutic+stem+cells+implanted+in+the+tumor+resection+cavity+induce+cell+death+in+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Encapsulated therapeutic stem cells implanted in the tumor resection cavity induce cell death in gliomas.</a> Nature Neuroscience. 15 (2), 197-204 (2011).</li>
<li>Bagó, J., Pegna, G., Okolie, O., Hingtgen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+matrices+enhance+the+transplant+and+efficacy+of+cytotoxic+stem+cell+therapy+for+post-surgical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Fibrin matrices enhance the transplant and efficacy of cytotoxic stem cell therapy for post-surgical cancer.</a> Biomaterials. 84, 42-53 (2016).</li>
<li>Bagó, J., Pegna, G., Okolie, O., Mohiti-Asli, M., Loboa, E., Hingtgen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanofibrous+scaffolds+increase+the+efficacy+of+stem+cell-mediated+therapy+of+surgically+resected+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanofibrous scaffolds increase the efficacy of stem cell-mediated therapy of surgically resected glioblastoma.</a> Biomaterials. 90, 116-125 (2016).</li>
<li>Loebinger, M., Eddaoudi, A., Davies, D., Janes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Stem+Cell+Delivery+of+TRAIL+Can+Eliminate+Metastatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Stem Cell Delivery of TRAIL Can Eliminate Metastatic Cancer.</a> Cancer Research. 69 (10), 4134-4142 (2009).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J. Vis. Exp. (12), e680(2008).</li>
<li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Intracranial+Brain+Tumor+Xenografts+With+Subsequent+Analysis+of+Tumor+Growth+and+Response+to+Therapy+using+Bioluminescence+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. (41), e1986(2010).</li>
</ol>

Drs. Sheets, Bagó en Hingtgen de gelijkheid in Falcon Therapeutics die aspecten van de cel van de stam en de steiger technologie van UNC Chapel Hill heeft een licentie hebben.

Chirurgie kan doorgaans worden afgerond binnen 30 min per muis, gezien het feit dat de volgende punten worden meegenomen om te maximaliseren precisie en tijdrovende valkuilen te vermijden. Controleer eerst dat de muis is goed gepositioneerd in de stereotaxic instrument voorafgaand aan de procedure te starten. Ongewenste hoofdbewegingen Beperk chirurgische nauwkeurigheid van de craniotomy, de locatie van de tumor implantatie, en de mate van resectie van de tumor. Voorafgaand aan de resectie, volledig het gedeelte van de d...

Glioblastoma (GBM) is de meest voorkomende primaire hersenenkanker in volwassenen, met een sombere mediane overleving van slechts 12-15 maanden1,2,3,4,5. Survival is niet aanzienlijk verbeterd sinds 2005, de huidige klinische standaard voor maximale chirurgische resectie gevolgd door straling en de daarmee gepaard gaande en adjuvante temozolomide chemotherapie toen6,7 aangenomen. Terwijl deze behandeling patiënten met een tijdelijke verlichting van symptomen biedt, wordt standaard van care behandeling steevast resulteert in herhaling als foci van invasieve kanker resectie onttrekken en worden beschermd tegen de systemische therapieën door de bloed - hersenbarrière (BBB). Strategieën die gericht zijn op foci van invasieve tumor terwijl het omzeilen van de BBB zijn dringend noodzakelijk om tractie tegen deze agressieve en slopende ziekte te krijgen.
Menselijke mesenchymale stamcellen (MSCs) tonen belofte als drug leverende voertuigen voor GBM als gevolg van hun oorspronkelijke tumor tropisme8,9. MSCs receptoren voor bezitten en migreren naar oplosbare factoren die tumoren, met inbegrip van stromale cel-afgeleide factor 1α afscheiden (SDF-1α), matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) en monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) o.a.10, 11 , 12 , 13. engineering MSCs te uiten en het afscheiden van cytotoxische medicatie kunnen ze worden ingezet als tumor-homing drug leverende voertuigen. Gemanipuleerde MSCs schuift naar foci van invasieve tumor en leveren van therapeutische proteïnen. Deze aanpak blijkt de haalbaarheid in een verscheidenheid van preklinische GBM modellen9,14. De overgrote meerderheid van deze modellen bevatten echter geen chirurgische resectie ondanks de klinische relevantie van dit onderdeel. Opkomende studies met nieuwe modellen van resectie geopenbaard dat chirurgische tumor verwijdering vermindert de persistentie van stamcellen die rechtstreeks worden ingespoten in de chirurgische holte15. Verlies van levensvatbaarheid resulteerde in verminderde werkzaamheid, waarschijnlijk te wijten aan de daling van de dosis en de duur van de drug geleverd aan de foci van invasieve tumor.
Ter verbetering van de levensvatbaarheid van de cellen van de stam en drug delivery, kunnen MSCs worden uitgezaaid op steigers vóór. In dit protocol, biocompatibel en resorbeerbare electrospun nanofibrous poly(lactic acid) (PLA) wordt gebruikt als de steigers voor de MSCs. PLA buigt en voldoet aan de vorm van de resectie holte op implantaat, die maximaliseert therapeutische dekking en minimaliseert de afstand MSCs moet reizen om te bereiken van tumorcellen. MSCs blijven op het schavot tijdens implantatie en vervolgens migreren uit de steiger richting tumorcellen na implantatie16,17. MSCs en de cytotoxische medicatie die ze dan dragen accumuleren in de tumor foci. Levering van cytotoxische drug aan de tumor vereist MSC levensvatbaarheid en volharding, die beide worden geholpen door implantatie op steigers.
In deze procedure lentivirale vectoren worden gebruikt voor het opwekken van stabiele uitdrukking van TL (in vitro bijhouden) en bioluminescente (in vivo bijhouden) markeringen in zowel kanker en stamcelonderzoek lijnen. De menselijke GBM lijn U87 is geïnfecteerd met mCherry en firefly luciferase (U87 mCh-Fl), en de niet-therapeutische MSCs met GFP en renilla luciferase (MSC GFP-Rluc). De therapeutische variant van MSCs express TNFα-gerelateerde apoptose inducerende ligand (MSC-TRAIL). TRAIL, een constitutively-uitgescheiden eiwitten, bindt aan nabijgelegen dood receptoren op kanker cellen en initieert caspase-gemedieerde apoptosis18.
Wij bieden hier, een protocol voor preklinische afbeelding geleide GBM chirurgische resectie en implantatie van MSC-geplaatste steigers. Kortom, krijgen naakt muizen een craniotomy drie dagen later gevolgd door stereotactische orthotopic injectie van U87 mCh-Fl om de primaire tumor. Het werk tumor groeit voor een periode van ongeveer een week. PLA steigers zijn bezaaid met MSCs 48 h voorafgaand aan de resectie operatie. De tumor is dan gereseceerd onder tl begeleiding, en de MSC-geladen steiger is geïmplanteerd in de holte van de resectie. Tumor lasten en muis overleven dan post-operatively bijgehouden met bioluminescentie imaging (BLI). Een tijdlijn van deze procedures vindt u hieronder (Figuur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57452/57452fig1.jpg"> Figuur 1: tijdlijn van procedures. Muizen ontvangen in eerste instantie een cranial venster (dag 0). Na een herstelperiode van drie dagen, tumoren zijn ingeplant (dag 3) en groeien voor ongeveer een week. Steigers zijn bezaaid met MSCs (dag 8) twee dagen voorafgaand aan de tumor resectie en implantatie procedure (dag 10). Tumor progressie en therapeutische werking worden geëvalueerd via postoperatieve imaging daarna (dag 10 +). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57452/57452fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

<table><tbody><tr><td>Alleen voor stereotactisch instrument voor muizen</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td>Houdt het hoofd tijdens de operatie stabiel gepositioneerd</td></tr><tr><td>Stereomicroscoop met fluorescentie-dissectie</td><td>Leica</td><td>M165 FC&nbsp;</td><td>Maakt real-time beeldvorming van de tumor tijdens resectie mogelijk</td></tr><tr><td>Gemotoriseerd geïntegreerd stereotactisch injectorsysteem (ISI)</td><td>Stoelting</td><td>53315</td><td>Maakt nauwkeurige injectievolumes en -snelheden van tumorcellen mogelijk</td></tr><tr><td>Vetbond weefselkleefstof</td><td>3M</td><td>1469</td><td>Chirurgische lijm om een huidwond te sluiten</td></tr><tr><td>Kunstmatige tranen</td><td>Akorn</td><td>664268</td><td>Voortkomt dat de ogen tijdens de operatie uitdrogen</td></tr><tr><td>Webcol alcoholpreps</td><td>Covidien</td><td>6818</td><td>Steriliseert de incisieplaats</td></tr><tr><td>Betadine chirurgische scrub</td><td>Purdue Fredick Company</td><td>6761815117</td><td>Steriliseert de incisieplaats</td></tr><tr><td>Wattenstaafjes</td><td>Fisherbrand</td><td>23-400-115</td><td>Chirurgisch gereedschap</td></tr><tr><td>E-vac aspiratiesysteem</td><td>Argos</td><td>EV310</td><td>Vacuumpomp die wordt gebruikt om de tumor te reseceren</td></tr><tr><td>Fibrinogeen en trombine geëxtraheerd uit TISSEEL</td><td>Baxter</td><td></td><td>Om tijdelijk het scaffold in de resectieholte te bevestigen</td></tr><tr><td>IVIS Kinetic in vivo optisch beeldvormingssysteem</td><td>Caliper Life Science</td><td></td><td>Bioluminescent Imager</td></tr><tr><td>D-Luciferine-kaliumzout</td><td>PerkinElmer</td><td>122799</td><td>In vivo beeldvormingsmiddel</td></tr></tbody></table>

image-guided resectie van glioblastoma en intracraniële implantatie van therapeutische stamcel-geplaatste steigers

Image-Guided Resection of Glioblastoma and Intracranial Implantation of Therapeutic Stem Cell-seeded Scaffolds

Glioblastoma (GBM), de meest voorkomende en agressieve primaire hersenenkanker, draagt een levensverwachting van 12-15 maanden. De korte levensverwachting is te wijten aan het onvermogen van de huidige behandeling, bestaande uit chirurgische resectie gevolgd door straling en chemotherapie, te elimineren foci van invasieve tumor. Behandeling van deze foci kan worden verbeterd met tumoricidal menselijke mesenchymale stamcellen (MSCs). MSCs Exposeren krachtige tumor tropisme en kunnen worden ontworpen om uitdrukkelijke therapeutische proteïnen die tumorcellen doden. Vooruitgang in de preklinische modellen blijkt dat chirurgische resectie induceert voorbarig MSC verlies en vermindert de therapeutische werking. Effectiviteit van MSC behandeling kan worden verbeterd door seeding MSCs op een steiger biologisch afbreekbare poly(lactic acid) (PLA). MSC levering in de holte van de chirurgische resectie op een steiger PLA herstelt cel retentie, persistentie en tumor doden. Om te bestuderen van de effecten van MSC-geplaatste PLA implantatie op GBM, is een nauwkeurige preklinische model nodig. Wij bieden hier een preklinische chirurgische protocol voor beeld-geleide tumor resectie van GBM bij immuun-deficiënte muizen gevolgd door MSC-geplaatste steiger implantatie. MSCs zijn ontworpen met lentivirale constructies te constitutively afscheiden van therapeutische TNFα-gerelateerde apoptose-inducerende ligand (TRAIL), alsmede de groen fluorescente proteïne (GFP) dat TL bijhouden. Ook zijn de tumorcellen U87 ontworpen om uitdrukkelijke mCherry en firefly luciferase, verstrekken van dubbele TL/verlichte bijhouden. Terwijl momenteel gebruikt voor het onderzoek van de stamcel gemedieerde levering van therapeutics, kan dit protocol worden gewijzigd om te onderzoeken van het effect van chirurgische resectie op andere GBM-interventies.

U87 tumorcellen werden ontworpen om uitdrukkelijke mCherry en firefly luciferase (U87 mCh-Fl) vóór injectie, en te voorzien in beeld-geleide resectie en bioluminescentie bijhouden (figuur 2A-C). Stamcellen werden ook ontworpen met diagnostische GFP-Rluc (MSC-GFP) of therapeutische GFP-proces (MSC-TRAIL) en ontpit op de PLA steigers te bevestigen van de gehechtheid en proliferatie (figuur 2D-F).</...

Tumor-zoekende therapeutische mesenchymale stamcellen (MSCs) tonen belofte als een behandeling voor invasieve glioblastoma. Optimale transplantatie gaat om levering van MSCs in de holte van de resectie tumor op steigers. Hier, preklinische technieken om te studeren MSC behandeling van glioblastoma zijn geleverd inclusief: afbeelding-geleide tumor resectie; implantatie van MSC-geplaatste steigers; en postoperatieve therapie volgen.

Image-Guided resectie van Glioblastoma en intracraniële implantatie van therapeutische stamcel-geplaatste steigers

Glioblastoma (GBM), the most common and aggressive primary brain cancer, carries a life expectancy of 12-15 months. The short life expectancy is due in ...

Het algemene doel van deze procedure is om hersenkanker bij muizen chirurgisch te resecteren en een scaffold gezaaid met op tumoren afgerichte therapeutische stamcellen in de postoperatieve resectieholte te implanteren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van celtherapie en neuro-oncologie, zoals hoe chirurgische resectie de implantatie van cellen in de chirurgische holte beïnvloedt, hoe effectief nieuwe therapeutische middelen zijn op postoperatief hersenkanker, en hoe scaffold-gebaseerde afleveringssystemen de therapeutische resultaten beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat interventies voor hersenkanker bij muizen kunnen worden bestudeerd op een manier die de klinische standaard van zorg bij menselijke patiënten nauw nabootst.Hoewel deze methode inzicht kan geven in stamceltherapie geleverd via een scaffold, kan deze ook worden toegepast op andere interventies, zoals nanodeeltjes, kleine moleculen, oncolytische virussen of andere opkomende therapieën. Bereid de scaffolds 48 uur voorafgaand aan implantatie in muizen voor door eerst PLA-scaffolds in stukken van ongeveer twee bij twee millimeter, zo groot als d

image-guided-resection-glioblastoma-intracranial-implantation

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Intracraniële implantatie van GL261 cellen in C57BL / 6 muizen produceert kwaadaardige gliomen dat veel van de kenmerken van de menselijke glioblastoma multiforme samenvatten. We gebruikten GL261 cellen die stabiel uitdrukken luciferase om ons in staat om te...

Intracraniële Implantatie met Latere 3D In Vivo Bioluminescent Imaging van Murine Gliomen

We beschrijven een geïntegreerde methode voor de exacte, stereotactische implantatie van menselijke glioblastoma multiforme cellen in de hersenen van muizen en vervolgens naakt...

Stereotactische Intracraniale Implantatie en<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescent Imaging van tumorxenograften in een Muis Model Systeem van glioblastoma multiforme

Door het combineren van een gepolijste en versterkte dunne-schedel (poorten) craniale venster en glioblastoma (GBM) cel injectie, kunnen we zien glioom initiatie en groei van geïnjecteerd GBM cellen in de hersenen van een levende muis lengterichting.

Imaging glioom Initiatie<em&gt; In Vivo</em&gt; Door middel van een gepolijst en versterkte Thin-schedel Schedel Window

This video describes the technique of seeding mesenchymal stem cells (MSCs) onto a biodegradable poly(lactic acid) (PLA) scaffold. The prepared scaffolds can be implanted into the surgical resection cavity of the brain from where they may migrate towards tumor foci. Further, these cells can be engineered to express therapeutic proteins to stimulate apoptosis in cancer cells.

MSC Seeded Scaffold Preparation: A Technique to Prepare Scaffold Seeded with Mesenchymal Stem Cells for Surgical Implantation into Murine Model

This video presents the surgical procedure for image-guided tumor resection and implantation of a bio-scaffold seeded with genetically engineered mesenchymal stem cells or MSCs expressing tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand or TRAIL. These therapeutic MSCs have the potential in treatment of brain tumors.

Fluorescence-guided Tumor Resection and MSC-seeded Scaffold Implantation in Murine Model: A Surgical Procedure to Deliver Therapeutic Mesenchymal Stem Cells into Brain Tumor Resection Cavity in Mouse Model

We hebben een corticaal orthotope glioblastoom model vastgesteld muizen intravitale twee-foton microscopie dat de biofysische beperkingen recapituleert beginsel zullen spelen tijdens de groei van de tumor. Een chronische glazen venster vervangen van de schedel boven de tumor kan de follow-up van de progressie van de tumor na verloop van tijd door twee-foton microscopie.

Een orthotope Glioblastoma Muis Model Handhaving Brain Parenchymale fysieke beperkingen en geschikt voor intravitale twee-foton microscopie

Stamcellen zijn veelbelovende therapeutische dragers om hersentumoren te behandelen als gevolg van hun intrinsieke tumor tropisme. Niet-invasieve intranasale stamcelafgifte omzeilt de bloedbreinbarrière en toont een sterk potentieel voor klinische vertaling. In dit artikel worden de basisprincipes van intranasale stamcellen in een muismodel van glioma samengevat.

Intranasale Levering van Therapeutische Stamcellen aan Glioblastoma in een Muis Model

Hier presenteren we een protocol voor de voorbereiding en het stereotaxic beheer van allogene menselijke lymfocyten in immunodeficiëntie muizen uitvoering orthotopic menselijke primaire hersentumoren. Deze studie biedt een bewijs-van-concept voor zowel de haalbaarheid en antitumorale werkzaamheid van cellulaire immuuntherapie intrabrain-geleverd.

Stereotactische adoptief overdracht van cytotoxische immuuncellen in lymfkliertest modellen van Orthotopic mens Glioblastoma Multiforme Xenografts

Dit werk beschrijft de ontwikkeling van flexibele interdigitated elektroden voor implementatie in 3D hersentumormodellen, namelijk in vitro cultuur, in ovo model en in vivo murine  model. De voorgestelde methode kan worden gebruikt om de effecten van gepulseerde elektrische velden op tumoren op verschillende niveaus van complexiteit te evalueren.

Flexibele organische elektronische apparaten voor gepulseerde elektrische veldtherapie van glioblastoom

In vivo zijn intercellulaire communicatie die ten grondslag ligt aan veel aandoeningen van het centrale zenuwstelsel, zoals glioblastoom (GBM), berucht moeilijk te meten en te karakteriseren. Hier beschrijven we procedures van cerebrale open-flow microperfusie (cOFM) die kunnen worden gebruikt om interstitiële vloeistofcomponenten te bemonsteren in een longitudinaal diermodel van GBM.

Gebruik van cerebrale open-flow microperfusie voor de longitudinale verzameling van interstitiële vloeistof in een diermodel van glioblastoom

Het doel van dit protocol is om onderzoekers een zeer reproduceerbare techniek te bieden voor intracraniële implantaties.

Stereotactische intracraniële implantatie van door de patiënt afgeleide xenograftcellijnen van de glioblastoom bij muizen

Leer chirurgische resectie van hersentumoren bij muizen met implantatie van therapeutische stamcellen op een scaffold. Deze methode evalueert de effectiviteit van celtherapie en scaffold-gebaseerde leveringssystemen.

Image-Guided resectie van Glioblastoma en intracraniële implantatie van therapeutische stamcel-geplaatste steigers

Meer video's verkennen