Name: Vergadering en zuivering van Prototype schuimend Virus Intasomes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Leer de assemblage en zuivering van prototype schuimend virus intasomen voor biochemische en structurele studies in de retrovirologie. Deze methode isoleert integratiecomplexen met hoge opbrengst.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de NIH AI099854 en de AI126742 sleutel.

1. het gloeien van vDNA
<ol><li>Combineer 1 X tien Buffer (10 X 10 voorraad: 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl, 10 mM EDTA), 10 µM Oligo 1 (5' ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG 3', 100 µM voorraad) en 10 µM Oligo 2 (5' CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA 3', 100 µM voorraad) in een eindvolume van 1,5 mL . Aliquot 25 µL in zestig 0,2 mL polymerase kettingreactie (PCR) buizen. Opmerking: Afhankelijk van de toepassing, oligomeren kunnen worden gewijzigd met fluorophores of tags aan de 5'-eind van Oligo 2 of als een interne amino-T op basis 13 van het 5'-eind van Oligo 1. Gemodificeerde oligomeren moeten gezuiverd worden door krachtige vloeibare chromatografie (HPLC) vóór het gloeien. We hebben vastgesteld dat de efficiëntie van de vergadering intasome 10-fold 5'-eind Cy3 of Cy5 fluorophore labeling van Oligo 2 vermindert. Labelen van de interne fluorophore vermindert niet vergadering efficiëntie.</li>
	<li>Anneal met behulp van een thermocycler met de volgende tijden en temperaturen: 1 cyclus op 94.0 ˚C 3 min, 99 cycli bij (94.0 ˚C 1 min, 93,6 ˚C 1 min) beide temperaturen te verlagen met 0.8 ˚C per cyclus (de laatste cyclus is 14,8 ˚C 1 min, 14.4 ˚C 1 min) , en op te slaan op 4.0 ˚C.</li>
	<li>Combineer de onthardende reacties van alle zestig buizen. Laden 500 µL aan twee 0,5 mL 3 kDa molecuulgewicht cutoff (MWCO) ultracentrifugal filter concentratie eenheden. Het concentreren van de ontharde vDNA door centrifugeren in een microcentrifuge bij 14.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT). Opmerking: Het retentate volume moet ~ 50 µL in elke concentratie-eenheid.</li>
	<li>Gooi de stroom door. Voeg 250 µL van de resterende ontharde vDNA aan elke filter eenheid. Herhaal de spin en het negeren van de stroom door. Uitwisseling in TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) van de buffer door driemaal met 450 µL TE wassen.</li>
	<li>Omkeren van de eenheid van de filter en de spin bij 1.000 x g gedurende 2 min op RT. Het volume van de laatste retentate voor elke eenheid van de filter moet ~ 50 µL. Combineer de retentates en de overdracht aan een tube van 1,5 mL schroefdop.</li>
	<li>Meet de extinctie van de 260 nm ultraviolette (UV) van de vDNA. Gebruik deze waarde voor de berekening van de uiteindelijke Molaire concentratie van DNA. De uitsterven coëfficiënt (ε260) van deze vDNA is 622,803 cm-1 M-1 en zijn moleculair gewicht is 23,972 Da. winkel bij-20 ˚C.</li>
</ol>2. Intasome vergadering
<ol><li>Uitvoeren, indien mogelijk, de vergadering van de intasome in een kleine kamer met een regelbare thermostaat. Pas de thermostaat aan ongeveer 18-22 ˚C. Opmerking: In onze ervaring, intasome vergadering op 4 ˚C is inefficiënt.</li>
	<li>Bereiden 1 L voor dialyse buffer (20 mM Bis-tris propaan, pH 7.5, 200 mM NaCl, 2 mM dithiothreitol (DTT), 25 µM ZnCl2) in een bekerglas van 2 L met een roer-balk in een bord roer. Equilibreer de buffer in de 18-22 ˚C ruimte voor ten minste 6 uur.</li>
	<li>Om de intasomes te monteren, 50 mM Bis-tris propaan, pH 7.5, 500 mM NaCl, 120 µM PFV IN en 50 µM vDNA in een totaal volume van 150 µL te combineren. Opmerking: De PFV IN moet vrij zijn van contaminerende7,8van de activiteit van de nuclease. Als de concentratie van PFV IN ook verdund voor 120 µM IN in 150 µL volume, is dan is het mogelijk om het eindvolume naar 200 µL. De kritische factoren voor deze stap zijn om de molaire IN verhouding tot het vDNA (2.4:1) en te zorgen voor genoeg complex te visualiseren tijdens chromatografie.</li>
	<li>Een ~ 10-cm lang stuk 10-mm 6-8 kDa MWCO dialyse buizen en clips met dubbel gedestilleerd water (ddH2van O), of het hoogste beschikbare zuiverheid water schoon. Bevestig één uiteinde van de buis. Opmerking: Dialyse buis moet voorzichtig behandeld worden om te voorkomen dat elke mogelijke besmetting van de lab-ruimte.</li>
	<li>Breng 15 mL dialyse buis spoelen buffer (50 mM Bis-tris propaan, pH 7.5, 500 mM NaCl). Spoel de binnenkant van de buis van de dialyse drie keer met 1-2 mL spoelen buffer. Verwijder zo veel van de buffer van de spoelen zoveel mogelijk met een pipet en dunne gel laden tip.</li>
	<li>Indien nodig, gebruik een schone scheermesje of scalpel te snijden de dialyse buizen zodat een dunne gel laden tip tot het einde van de buis oplopen.</li>
	<li>De vergadering van de intasome van stap 2.3 overbrengen aan de buis van de dialyse met een pipet en een dunne gel laden tip. Clip van het open uiteinde van de buis van de dialyse, minimaliseren van de hoeveelheid lucht die in de buis. Plaats de buis in de dialyse-buffer.</li>
	<li>Dialyze overnachting (16-20 h) met zachte roeren, zodat de slang draait maar niet in een draaikolk is. Zorg ervoor dat de dialyse-buis onder het zeeoppervlak en mobiele. Na ongeveer een uur, een zichtbare neerslag in de buis te observeren. Opmerking: Met Cy3 en Cy5 fluorescently label vDNA de neerslag is meer voor de hand. Dit geldt voor zowel einde gemarkeerd als intern gelabelde fluorescerende vDNA.</li>
</ol>3. Intasome solubilisatie
<ol><li>Twee opstellen breed droeg Pipetteer tips door het verwijderen van 2-4 mm vanaf het einde van een 200 µL-tip met een nieuwe scheermes of scalpel blad op een schoon oppervlak. Opmerking: De tips zal worden gebruikt in stap 3.3 en 3.5.</li>
	<li>Verwijder de dialyse-buis uit de dialyse-buffer. Om te voorkomen dat de verdunning van het monster intasome met dialyse buffer die aan het einde van de buis in de buurt van de clip blijven kan, gebruik een micropipet met een kleine pipet tip wilt verwijderen van alle overtollige dialyse-buffer. Verwijder de clip uit één uiteinde van de buis van de dialyse.</li>
	<li>Gebruik een breed droeg pipette uiteinde van stap 3.1 overdracht van het monster met inbegrip van de neerslag in de dialyse-buis naar een 1.5-mL-buis op ijs. Opmerking het totale volume van het teruggewonnen materiaal; het totale volume is meestal ~ 140 µL.</li>
	<li>Het monster met neerslag bedraagt 200 mM NaCl; het zout tot een eindconcentratie van 320 mM NaCl verhogen door toe te voegen het juiste volume van een stamoplossing 5 M NaCl. Bijvoorbeeld, voor een voorbeeld van 150 µL, voeg 3.9 µL 5 M NaCl en 1.1 µL ddH2O voor een eindvolume van 155 µL. overdracht ijsemmer met proeven in een koude kamer 4 ˚C.</li>
	<li>Gebruik een breed droeg pipette uiteinde van stap 3.1 resuspendeer en solubilize van de neerslag door pipetteren. Herhaal elke 20 min voor ten minste 1 h. Let op dat de meeste van de neerslag in oplossing gaan. Opmerking: Pipetting om resuspendeer de neerslag kan gestopt worden wanneer blijkt dat de neerslag langer aanzienlijk wordt verminderd tussen de tijdstippen. Wanneer vDNA is niet het label of intern heet, wordt het precipitaat verminderd met ~ 90% gebaseerd op visuele inspectie. In het geval van Cy5 einde label vDNA, is de neerslag met alleen ~ 20% verminderd; de meeste van de neerslag met fluorophore einde label vDNA zal niet solubilize. De hoeveelheid neerslag die is effectief ontbindend is variabel en empirisch bepaald moet worden.</li>
</ol>4. Intasome zuivering
<ol><li>Bereiden grootte uitsluiting chromatography (SEC) 250 mL buffer (20 mM Bis-tris propaan, pH 7.5, 320 mM NaCl, 10% glycerol) uitgevoerd. Steriel filter de buffer met een 0,2-µm filter eenheid en bewaren bij 4 ˚C. Opmerking: Alle zuivering stappen worden uitgevoerd in een koude kamer 4 ˚C.</li>
	<li>Een kolom kruislings gekoppelde agarose SEC equilibreer (diameter = 10 mm; lengte = 300 mm; bed volume = 24 mL; proeven volume = 25-500 µL; maximale druk = 1,5 MPa; uitsluiting limiet = 4 x 107 Da; scheidt molecuulgewicht tussen 5 en 5.000 kDa, zie de van de placemat erials) met de lopende buffer SEC op een debiet van 0.4 mL/min. Opmerking: Deze zuivering kan worden aangepast aan verschillende grootte uitsluiting kolommen als ze kunnen effectief scheiden 300 kDa van 44 kDa, zoals Superose 12 10/300 GL of Superose 6 verhogen. Superose 12 10/300 GL heeft lagere resolutie, wat leidt tot meer overlap van pieken. Omgekeerd, Superose 6 verhogen heeft een hogere resolutie en betere scheiding biedt.</li>
	<li>Centrifugeer het intasome monster in een microfuge bij 14.000 x g gedurende 10 minuten op 4 ˚C tot een eventueel resterende neerslag pellet. Verwijder voorzichtig het supernatant. De bovendrijvende vloeistof aan een 200 µL injectie lus (leidingen die ~ 200 μl houden kan) worden geladen. Het monster van toepassing op de SEC-kolom. Opmerking: Kleinere belasting volumes toestaan grotere resolutie door de SEC.</li>
	<li>Elueer met 25 mL SEC uitvoeren buffer en verzamelen van 95 breuken van 270 µL. ziet dat het chromatogram SEC wordt weergegeven drie A280/A260 pieken (Figuur 1). Opmerking: De eerste moet een aggregaat (~9.0 - 11,5 mL elutie), gevolgd door de PFV tetrameer intasome piek (~12.0 - 14,75 mL elutie) en PFV IN monomeer met gratis vDNA piek (~15.0 - 18,0 mL).</li>
</ol>5. integratie Strand overdracht Assay, de selectie van de breuk en opslag
<ol><li>Combineer 2 µL van elke intasome piek breuk en 50 ng 3 kb supercoiled plasmide DNA (voorraad concentratie is 50 ng/µL) in reactie buffer (10 mM Bis-tris propaan, pH 7.5, 110 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 4 µM ZnCl2, 10 mM DTT) in een uiteindelijke reactie volume van 15 µL. Incubeer bij 37 ˚C gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Omvatten een negatieve controle met geen toegevoegde PFV intasome. Stop de reactie met 0,75 µL proteïnase K (20 mg/mL stockoplossing) en 0,75 µL SDS (stockoplossing 10%). Incubeer bij 55 ˚C voor 1 h. winkel monsters zo nodig bij-20 ˚C voor latere analyses. Opmerking: Deze test is een kwalitatieve beoordeling van integratie activiteit. De molaire concentratie van intasome van elke breuk wordt niet bepaald voorafgaand aan deze test. Breuken in de integratie strand overdracht bepaling opgenomen kunnen worden opgeslagen op het ijs (inclusief overnachting opslag) tot integratie activiteit is bevestigd en geselecteerde breuken zijn aliquoted. Hier gebruiken we pMP2, een afgeleide van pUC199. We hebben ook met succes gebruikt de 5.4 kb plasmide pcDNA 3.1. Een plasmide die kan worden omgezet in cirkel, lineaire, ontspannen en supercoiled formulieren kunnen worden gebruikt als een doel voor integratie.</li>
	<li>Bereiden een 120 mL 1% gewicht per volume (w/v) agarose gel in 1 X TAE-buffer (40 mM Tris-acetaat, 1 mM EDTA) met 0,1 μg/mL ethidium bromide (EtBr, 10 mg/mL stockoplossing)10. Smelt de agarose oplossing en giet het in een lade van 15 x 10 cm gel gieten. Invoegen van een 15-well kam met 5 mm breed, 0,75 mm dik wells. Opmerking: Smaller putten levert betere band resolutie ten opzichte van 1,5 mm dikke wells.</li>
	<li>Laat de gel te stollen bij kamertemperatuur. Dompel de gel in 1 X TAE met 0,1 μg/mL EtBr.</li>
	<li>3 µL 50% glycerol aan elke integratie reactie toevoegen vanaf stap 5.2. Het laden van het volume van de hele reactie aan de gel. Laden 1 µL van 10 kb DNA grootte markering (150 ng/µL voorraad concentratie) op de rijstroken aan beide zijden van de monsters; met andere woorden, moet de DNA grootte markering flankeren de monster rijstroken.</li>
	<li>Laden in een buitenste rijstrook, 6 µL oranje G kleurstof (0,25% oranje G, 30% glycerol). Stel de gel bij constante spanning, 10 V/cm (100 V) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, of totdat de voorkant van de kleurstof oranje G bereikt het einde van de gel.</li>
	<li>Direct het imago van de agarose gel met een fluorescerende scanner ingesteld op EtBr (532 nm excitatie, 610 nm emissie filter) detecteren. Als fluorophore met het label vDNAs werden gebruikt, ook beeld met passende fluorophore instellingen. Opmerking: bijvoorbeeld, om op te sporen Cy5 label DNA, beeld met behulp van 633 nm excitatie en 670 nm emissie filters. Gecoördineerde integratie producten (CI, lineaire DNA) moeten uitvoeren trouw grootte bij ~ 3 kb, spoorverontreiniging supercoiled plasmide (SC) moet sneller (~ 2 kb) worden uitgevoerd en half-site integratie producten (HSI, ontspannen cirkel DNA) moeten langzamer (~3.5 kb) worden uitgevoerd. Spoorverontreiniging vDNA moet draaien trouw grootte op ~ 40 bp.</li>
	<li>Kwantificeren van de bands in iedere baan met imaging software7. Berekenen van de Fractie van DNA in elke rijstrook thats CI, HSI of SC; vDNA wordt niet meegenomen in deze berekening. Opmerking: Integratie efficiëntie, of de Fractie van SC geconverteerd naar een lineaire product, werd berekend door het volume van de pixel van gecoördineerde integratie producten (CI) door het volume van de totale pixel van drie bands (HSI + CI + SC). Als intasomes fluorophore met het label bent, kunnen de HSI en CI producten ook worden quantitated door fluorescentie.</li>
	<li>Selecteer breuken die het meest gecoördineerde integratie activiteiten hebben. Opmerking: In onze ervaring, de piek gecoördineerde integratie activiteit samenvalt met de piek van de eiwitten tetramere PFV intasomes genoemd. De A-280 van elk van deze gehalten meten en berekenen van de uiteindelijke intasome-concentratie. De Epsilon280 voor een tetrameer van wild type PFV IN met twee vDNAs die hier beschreven wordt 908,339 cm-1M-1 en het moleculair gewicht is 225.5 kDa. De concentraties moeten volgen hetzelfde patroon als de SEC chromatografische piek en in de bepaling van de overdracht deel.</li>
	<li>Elke fractie in 5 µL aliquots verdelen en snap bevriezen in vloeibare stikstof. Opslaan aliquots bij-80 ˚C. Breuken geselecteerd voor opslag zijn meestal tussen 200-600 nM.</li>
</ol>

<ol><li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoffin%2C+JM+%22Retroviruses%22">Retroviruses</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).</li>
<li>Valkov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+characterization+of+the+integrase+from+the+prototype+foamy+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).</li>
<li>Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, E., Engelman, A., Cherepanov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+intasome+assembly+and+inhibition+of+DNA+strand+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer.</a> Nature. 464 (7286), 232-236 (2010).</li>
<li>Li, M., Lin, S., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+domains+of+integrase+within+retroviral+intasomes+are+dispensible+for+catalysis+of+DNA+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Outer domains of integrase within retroviral intasomes are dispensible for catalysis of DNA integration.</a> Protein Sci. 25 (2), 472-478 (2016).</li>
<li>Gupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+conformations+of+prototype+foamy+virus+integrase+and+its+stable+synaptic+complex+with+U5+viral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Solution conformations of prototype foamy virus integrase and its stable synaptic complex with U5 viral DNA.</a> Structure. 20 (11), 1918-1928 (2012).</li>
<li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nat Commun. 7, 11409(2016).</li>
<li>Lopez, M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+removal+of+nuclease+contamination+during+purification+of+recombinant+prototype+foamy+virus+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase.</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+nuclease+contamination+during+purification+of+recombinant+prototype+foamy+virus+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase.</a> J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).</li>
<li>Poirier, M. G., Bussiek, M., Langowski, J., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+access+to+DNA+target+sites+in+folded+chromatin+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous access to DNA target sites in folded chromatin fibers.</a> J Mol Biol. 379 (4), 772-786 (2008).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
<li>Ballandras-Colas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+reveals+a+novel+octameric+integrase+structure+for+betaretroviral+intasome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM reveals a novel octameric integrase structure for betaretroviral intasome function.</a> Nature. 530 (7590), 358-361 (2016).</li>
<li>Ballandras-Colas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+supramolecular+assembly+mediates+lentiviral+DNA+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A supramolecular assembly mediates lentiviral DNA integration.</a> Science. 355 (6320), 93-95 (2017).</li>
<li>Passos, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structures+and+atomic+model+of+the+HIV-1+strand+transfer+complex+intasome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structures and atomic model of the HIV-1 strand transfer complex intasome.</a> Science. 355 (6320), 89-92 (2017).</li>
<li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+Rous+sarcoma+virus+intasome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the Rous sarcoma virus intasome.</a> Nature. 530 (7590), 362-366 (2016).</li>
<li>Maertens, G. N., Hare, S., Cherepanov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+retroviral+integration+from+X-ray+structures+of+its+key+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates.</a> Nature. 468 (7321), 326-329 (2010).</li>
<li>Maskell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+retroviral+integration+into+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for retroviral integration into nucleosomes.</a> Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Retrovirale INs vormen een complex met virale genomic DNA uit te voeren van de integratie en de virale levenscyclus blijven multimeric. Het aantal IN monomeren per intasome kan worden tetramers, octamers of eventueel hogere orde multimeren11,12,13,14. PFV intasomes zijn een tetrameer van recombinant met double-stranded DNA oligomeren, die virale genomic DNA na te bootsen eindigt<sup class="xref...

Integratie van het virale genoom in het genoom van de gastheer is een verplichte stap in de levenscyclus van alle retrovirussen1. Het virale enzym integrase (IN) katalyseert de covalente verbinding van elk uiteinde van het virale genoom van DNA tot de host DNA. Tijdens een cellulaire infectie, is IN onderdeel van een complex van pre integratie die integratie bemiddelt. Integratie in een doel DNA in vitro2kan ook worden uitgevoerd door recombinant IN complexvorm met dubbele gestrande DNA oligomeren nabootsen van de virale DNA-uiteinden. Een gemeenschappelijk integratie assay in vitro maakt gebruik van een supercoiled plasmide als het DNA van het doel. Integratie van beide virale DNA oligomeren (vDNA) naar de plasmide resulteert in een lineair product en gecoördineerde integratie (figuur 2A) wordt genoemd. De integratie assay in vitro kunnen ook producten opleveren met slechts één vDNA covalent toegevoegd aan de doel-plasmide resulterend in een ontspannen cirkel. Dit half-site integratie-product lijkt te zijn van een artefact van de bepaling in vitro.
Recombinant IN en vDNA mogen verrichten integratie in vitro, maar ze zijn niet ideaal reagentia voor de studie van de dynamiek of de structuur van integratie complexen als monomeer IN relevante visualisatie zou verhullen. Gezuiverde integratie complexen, of "intasomes," zijn vereist voor dynamische enkel molecuul analyse of structurele studies. PFV IN en vDNAs kunnen worden geassembleerd door dialyse uit de buffer van een relatief hoge zoutconcentratie aan een lagere zoutconcentratie3,4. Tijdens de dialyse, een neerslag vormen. Deze neerslag wordt verwijderd uit de dialyse en de zoutconcentratie wordt verhoogd. De hogere concentratie van het zout lost de overhaaste met PFV intasomes. De intasomes zijn dan gezuiverd door grootte uitsluiting chromatography (SEC). Recombinante prototype schuimend virus (PFV) IN blijkt te bestaan als een monomeer in oplossing bij concentraties tot 225 µM5. SEC fractionering scheidt effectief de PFV intasomes (225.5 kDa), waaronder een tetrameer van PFV IN en twee vDNAs, monomere PFV IN (44.4 kDa) en gratis vDNA (24.0 kDa). De PFV intasomes kunnen worden bevroren en integratie activiteit behouden gedurende ten minste zes maanden van opslag bij-80 ˚C.
Recombinante PFV intasomes kan ook worden gewijzigd om IN aminozuur vervangingen of afkappen mutaties of vDNAs voorzien van fluorophores of Biotine4,6te nemen. De gezuiverde PFV intasomes uitvoeren gemakkelijk integreren een doelwit supercoiled plasmide DNA in vitro. Bulk biochemische integratie testen met intasomes kunnen de effecten van testen IN mutaties, IN-remmers of andere chemische additieven. Biotinyleerd intasomes kan worden gebruikt om de sonde affiniteit met nucleic zuren of eiwitten. PFV intasomes zijn functioneel bij kamertemperatuur waardoor enkel molecuul microscopie p.a. door magnetische pincet voor het meten van de tijd tussen het verbinden van de twee uiteinden van de vDNA of de totale interne reflectie fluorescentie te visualiseren het intasome zoeken op doel DNA6. Daarnaast waren PFV intasomes de eerste die structureel worden gekenmerkt aanzienlijk invloed op het gebied van retrovirale integratie3.

<table><tbody><tr><td>DNA Oligomers</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>Custom DNA Oligos</td></tr><tr><td>Tris Ultra Pure</td><td>Gojira Fine Chemicals</td><td>UTS1003</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>P212121</td><td>RP-S23020</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z677094-24EA</td><td>3 kDa MWCO</td></tr><tr><td>DTT</td><td>P212121</td><td>SV-DTT</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6755-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Amresco</td><td>0662</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>G37-20</td><td></td></tr><tr><td>Gel-loading tips, 1 - 200 &mu;L</td><td>Corning</td><td>CLS4853-400EA</td><td></td></tr><tr><td>Razor blade; Single-edged; 100/Pk.; Pack of 100</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>568-0020</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis tubing clips</td><td>Spectrum Labs</td><td>132734</td><td></td></tr><tr><td>6-8 kDa 10 mm Dialysis Tubing</td><td>Spectrum Medical</td><td>132645</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17517201</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Res Standard Agarose</td><td>AGTC Bioproducts</td><td>AG500D1</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Fisher Scientific</td><td>0-267</td><td></td></tr><tr><td>Hyladder 10kb, 500 lanes</td><td>Denville Scientific</td><td>CB4225-4</td><td></td></tr></tbody></table>

vergadering en zuivering van prototype schuimend virus intasomes

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

A het definiëren van functie en noodzakelijke stap in de levenscyclus van retrovirus is de integratie van het virale genoom in het genoom van de gastheer. Alle retrovirussen coderen een integrase (IN)-enzym dat katalyseert de covalente verbinding van virale naar host DNA, die staat bekend als strand overdracht. Integratie kan worden gemodelleerd in vitro met recombinant retrovirale IN en DNA oligomeren nabootsen van de uiteinden van het virale genoom. Om te recapituleren nauwer de integratie-reactie die in vivo, integratie optreedt zijn complexen van recombinante IN en synthetische oligomeren geassembleerd door dialyse in een lagere zoutconcentratie buffer. De integratie complex, een intasome, genaamd kan worden gezuiverd door grootte uitsluiting chromatografie. In het geval van prototype schuimend virus (PFV), de intasome is een tetrameer van IN en twee DNA oligomeren en is gemakkelijk gescheiden van monomeer IN en gratis oligomeren DNA. De efficiëntie van de integratie van PFV intasomes kan worden bepaald onder verschillende experimentele omstandigheden voor een beter begrip van de dynamiek en mechanica van retrovirale integratie.

PFV intasomes zijn samengesteld uit recombinante IN en vDNA. Na montage, zijn intasomes gezuiverd door SEC (Figuur 1). Integratie activiteit van elke breuk is bepaald met een supercoiled DNA target en agarose gelelektroforese (Figuur 2). Deze gel is beeld met een fluorescerende scanner ingesteld op het detecteren van EtBr (en fluorophore, als vDNA met het fluorophore-label wordt gebruikt). Met behulp van de software van de analys...

Recombinante retrovirale integrase en DNA oligomeren nabootsen van virale DNA uiteinden kunnen een enzymatisch actieve complex bekend als een intasome vormen. Intasomes kan worden gebruikt voor biochemische, structurele en kinetische studies. Dit protocol detailleert hoe te monteren en te zuiveren van prototype schuimend virus intasomes.

Vergadering en zuivering van Prototype schuimend Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

Het algemene doel van deze procedure is om prototype foamy-virus intasomes samen te stellen en te zuiveren, die vervolgens kunnen worden gebruikt voor biochemische, structurele en kinetische studies. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het gebied van retrovirologie te beantwoorden, zoals de mechanica en dynamica van integratie. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de isolatie van integratiecomplexen mogelijk maakt in plaats van een heterogeen mengsel van soorten.Visuele demonstratie van deze methode is nuttig als een herstel en solubilisatie van integratiecomplexen zijn cruciaal om een optimale intasome-opbrengst te garanderen. Om te beginnen, combineer 1XTEN-buffer, 10 micromolar oligo-1 en 10 micromolar oligo-2 in een eindvolume van 1,5 milliliter. Deel vervolgens 25 microliter van het mengsel in 60 0,2 milliliter polymerase-veranderingsreactiebuizen.Anneel het DNA met behulp van een thermocycler met de tijden en temperaturen vermeld in het tekstprotocol. Na de reactie, combineer de annealingreacties van alle 60 buizen. Laad vervolgens 500 microliter van twee 0,5 milliliter drie kilodalton molecuulgewicht afsnijding ultracentrifugaal filterconcentratie-eenheden.Concentreer het geanneleerde virale DNA door centrifugatie in een microcentrifuge bij 14.000 keer g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Na het weggooien van de flow-through, voeg 250 microliter van de resterende geanneleerde virale DNA toe aan elke filtereenheid. Herhaal de spin tot er ongeveer 50 microliter overblijft en gooi de flow-through weg.Vervolgens wordt het monster in TE-buffer gebracht door drie keer met 450 microliter TE te wassen. Na bufferuitwisseling, draai de filtereenheid om en draai gedurende twee minuten bij 1000 keer g bij kamertemperatuur. Het uiteindelijke retenteerde volume voor elke filtereenheid moet ongeveer 50 microliter zijn. Combineer de retentates en breng over naar een 1,5 milliliter schroefkappenbuis.Ten slotte meet u de 260 nanometer ultraviolette absorbentie van het virale DNA om de DNA-concentratie te berekenen. Om de intasomes samen te stellen, combineer 50 millimolar bis-tris propaan pH 7,5, 500 millimolar natriumchloride, 120 micromolar PFV-integrase en 50 micromolar vireel DNA in een totaal volume van 150 microliter. Maak een 10 centimeter lang stuk van 10 millimeter diameter zes tot acht kilodalton molecuulgewicht afsnijding dialyseslang en de bijbehorende clips schoon met dubbel gedestilleerd water of het water van de hoogste zuiverheid dat beschikbaar is.Klep een uiteinde van de slang, spoel de binnenkant van de dialyseslang drie keer met een tot twee millimeter spoelbuffer. Verwijder zoveel mogelijk van de spoelbuffer met de pipette en dunne gel-laadtip. Breng vervolgens de intasome-samenstelling over naar de dialyseslang met de pipette en een dunne gel-laadtip.Zorg ervoor dat de samenstelling direct in de bodem van de dialyseslang wordt geexpelleerd. Klep het open uiteinde van de dialyseslang, waarbij de hoeveelheid lucht die in de slang wordt geïntroduceerd, wordt geminimaliseerd. Plaats vervolgens de slang in de dialysebuffer.Dialyseer gedurende de nacht met zachte roering zodat de slang draait maar niet in een vortex is. Zorg ervoor dat de dialyseslang ondergedompeld en mobiel is. Na ongeveer een uur zou er precipitaat zichtbaar moeten zijn in de slang.Bereid twee brede buisjespunten voor door twee tot vier milliliter van het uiteinde van een 200 microliter tip te verwijderen met een nieuw scheermes of scalpelmes op een schone oppervlakte. Verwijder de dialyseslang uit de dialysebuffer. Om verdunning van het intasome-monster te voorkomen met dialysebuffer die mogelijk aan het uiteinde van de slang bij de klem blijft, gebruik een micropipet met een kleine pipettetip om eventuele overtollige dialysebuffer te verwijderen.Verwijder de klem van dit uiteinde van de dialyseslang. Bij het herstellen van de samenstelling is het belangrijk om zoveel mogelijk van de oplossing en het precipitaat te verzamelen. Gebruik de brede buisjespropettetip om het monster, inclusief het precipitaat, binnen de dialyseslang, naar een 1,5 milliliter buisje op ijs over te brengen.Noteer het totale volume van het herstelde materiaal. Het totale volume is typisch ongeveer 140 microliter. Het monster met precipitaat is bij 200 millimolar natriumchloride.Verhoog het zout tot een uiteindelijke concentratie van 320 millimolar natriumchloride door het juiste volume van een vijf molare natriumchloride-oplossing toe te voegen. Breng het ijskast met het monster over in een koude kamer van vier graden Celsius. Gebruik de brede buisjespipettip om het precipitaat op te schorsen en te solubiliseren door te pipetteren.Herhaal elke 20 minuten gedurende minimaal een uur. Het meeste precipitaat zou in oplossing moeten gaan. Om de intasome te zuiveren, breng een gecrosslinkte, agarose grootte-uitsluitingschromatografie of SEC-kolom in evenwicht met SEC-loopbuffer met een stroomsnelheid van 0,4 milliliter per minuut.Centrifugeer het intasome-monster in een microfuge bij 14.000 keer g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius om eventueel resterend precipitaat te bezinken. Na zorgvuldig verwijderen van het supernatant laad het op een 200 microliter injectielus. Breng het monster aan op de SEC-kolom.Elueer met 25 milliliter SEC-loopbuffer en verzamel 95 fracties van 270 microliter. Observeer dat de SEC-chromatogram drie A280 en A260 pieken toont. Combineer twee microliter van elke intasome piekfractie in 50 nanogram drie kilobase supergewikkeld plasma-DNA in reactiebuffer in een eindreactievolume van 15 microliter.Voeg ook een negatieve controle toe zonder toegevoegd PFV intasome. Incubeer gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Stop de reactie met 0,75 microliter proteïnase K en 0,75 microliter SDS.Incubeer vervolgens het monster gedurende één uur bij 55 graden Celsius. Voeg vervolgens drie microliter 50 procent glycerol toe aan elke integratiereactie. Laad het volledige reactievolume naar een een procent gewicht per volume agarosegel.Laad ook één microliter van een 10 kilobase DNA-maat

assembly-and-purification-of-prototype-foamy-virus-intasomes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een eenvoudige, efficiënte en robuuste manier om de levering van meerdere virale componenten synchroniseren met plantencellen...

Eenvoudige en robuuste In vivo En In vitro Aanpak voor het bestuderen van Virus Vergadering

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

Visualizing Viral Structural Protein Assembly on Giant Unilamellar Vesicle Membranes

De bevestiging van virionen aan een oppervlak is een vereiste voor enkelvoudige virion imaging door Super-resolution fluorescentie imaging of atomic force microscopie (AFM). Hier demonstreren we een monstervoorbereidingsmethode voor gecontroleerde hechting van virionen op glasoppervlakken die geschikt zijn voor gebruik in AFM- en superresolutiefluorescentiebeeldvorming.

Monstervoorbereiding voor single virion atomic force microscopie en superresolutie fluorescentie beeldvorming

De demontage van influenza A-viruskernen tijdens het binnendringen van het virus in gastheercellen is een proces in meerdere stappen. We beschrijven een in vitro methode om de vroege stadia van virale uncoating te analyseren. In deze benadering wordt snelheidsgradientcentrifugering gebruikt om de stappen die het begin van uncoating initiëren onder gedefinieerde omstandigheden biochemisch te ontleden.

In Vitro Demontage van influenza A-virus capsiden door gradiëntcentrifugatie

Hier presenteren we een protocol voor het synthetiseren van virusachtige deeltjes met behulp van baculovirus of zoogdierlijke expressiesystemen en ultracentrifugatie zuivering. Deze zeer flexibele aanpak wordt gebruikt om virale antigenen vaccin taakstellingen op veilige en soepele wijze.

Expressie en zuivering van virusachtige deeltjes voor vaccinatie

Recombinante prototype schuimend virus integrase eiwit is het vaak besmet met een bacteriële nuclease tijdens het zuiveringsproces ongehinderd. Deze methode nuclease besmetting identificeert en verwijdert het uit de definitieve opstelling van het enzym.

Detectie en verwijdering van de Nuclease besmetting tijdens het zuiveringsproces ongehinderd van recombinante Prototype schuimend Virus Integrase

De biologische membraan fusie wordt gekatalyseert door gespecialiseerde fusie proteïnen. Het meten van de fusogenic eigenschappen van eiwitten kan worden bereikt door lipide mengen assays. We presenteren een methode voor het zuiveren van recombinant fruitvliegje atlastin, een eiwit dat bemiddelt homotypic fusie van de ER, reconstitutie aan voorgevormde liposomen, en testen voor fusie capaciteit.

Reinigingsmiddel-bijgestaan reconstitutie van recombinant fruit vliegje Atlastin in liposomen voor lipide-mengt analyses

Hier beschrijven we een enkele cel micro-aspiratie methode voor de scheiding van geïnfecteerde amoebae. Om virale subpopulaties te scheiden in Vermamoeba vermiformis geïnfecteerd door Faustovirussen en onbekende reus virussen, ontwikkelden we het protocol hieronder beschreven en toonden zijn vermogen om twee laag-overvloed roman reus virussen scheiden.

Single cell micro-aspiratie als alternatieve strategie voor de fluorescentie-geactiveerde celsortering voor scheiding van gigantische virus mengsels

Op het snijvlak van organische en waterige oplosmiddelen assembleren op maat gemaakte amfifiele elastine-achtige eiwitten zich in complexe supramoleculaire structuren zoals blaasjes, vezels en coacervaten die worden geactiveerd door omgevingsparameters. De beschreven assemblageprotocollen leveren Op eiwitmembraan gebaseerde compartimenten (PMBC's) met tunable eigenschappen, waardoor de inkapseling van verschillende lading.

Geleid Assemblage van Elastin-achtige eiwitten in gedefinieerde supramoleculaire structuren en cargo-encapsulation in vitro

Voor een diepgaande mechanistische analyse van de RNA-synthese van het respiratoire syncytiële virus (RSV) rapporteren we een protocol voor het gebruik van de chaperonnefofoproteïne (P) voor coexpressie van het RNA-vrije nucleoproteïne (N0) voor de daaropvolgende in vitro assemblage van de virusspecifieke nucleocapsiden (NCs).

Generatie en assemblage van virusspecifieke nucleocapsiden van het respiratoire syncytiële virus

In dit manuscript demonstreren we de experimentele technieken om het F-actinecytoskelet in te kapselen in gigantische unilamellaire lipideblaasjes (ook wel liposomen genoemd), en de methode om een cortex-biomimicking F-actinelaag te vormen aan de binnenste folder van het liposoommembraan.

In vitro Reconstitutie van het Actin Cytoskelet Inside Giant Unilamellar Vesicles

Leer de assemblage en zuivering van prototype schuimend virus intasomen voor biochemische en structurele studies in de retrovirologie. Deze methode isoleert integratiecomplexen met hoge opbrengst.

Vergadering en zuivering van Prototype schuimend Virus Intasomes

Meer video's verkennen