Name: DOVO Generatie van somatische stamcellen door YAP/TAZ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Leer hoe je gedifferentieerde cellen omzet in stamcellen via YAP-expressie voor regeneratieve geneeskunde. Deze methode genereert weefsel-specifieke stamcellen uit volwassen mammacellen en alvleesklierweefsel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken F. Camargo voor de gave van tetO-YAPS127A muizen; R26-rtTAM2 muizen (voorraad #006965) werden aangekocht van het Jackson Laboratory. Wij danken Chiara Frasson en Giuseppe Basso voor hulp bij FACS procedures. Dit werk wordt ondersteund door AIRC speciale programma moleculaire klinische oncologie '' 5 promille '' en een AIRC PI-subsidie S.P en door epigenetica vlaggeschipproject CNR-Miur verleent aan S.P. Dit project heeft ontvangen financiering van de Europese Onderzoeksraad (EOR) van de Europese Unie Horizon 2020 voor onderzoek en innovatieprogramma (subsidieovereenkomst DENOVOSTEM nr. 670126).

<ol><li>Panciera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Expandable+Tissue-Specific+Stem%2FProgenitor+Cells+through+Transient+Expression+of+YAP%2FTAZ%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).</li>
<li>Bar-Nur, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+conversion+induced+by+pluripotency+factors+involves+transient+passage+through+an+iPSC+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage.</a> Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).</li>
<li>Xu, J., Du, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+reprogramming%3A+strategies%2C+mechanisms%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications.</a> Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+plasticity.+Plasticity+of+epithelial+stem+cells+in+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stem cell plasticity. Plasticity of epithelial stem cells in tissue regeneration.</a> Science. 344 (6189), 1242281(2014).</li>
<li>Bai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yes-associated+protein+regulates+the+hepatic+response+after+bile+duct+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Yes-associated protein regulates the hepatic response after bile duct ligation.</a> Hepatology. 56 (3), 1097-1107 (2012).</li>
<li>Cai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+signaling+pathway+restricts+the+oncogenic+potential+of+an+intestinal+regeneration+program%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The Hippo signaling pathway restricts the oncogenic potential of an intestinal regeneration program.</a> Genes Dev. 24 (21), 2383-2388 (2010).</li>
<li>Elbediwy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+signalling+regulates+YAP+and+TAZ+to+control+skin+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis.</a> Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).</li>
<li>Taniguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gp130-Src-YAP+module+links+inflammation+to+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gp130-Src-YAP module links inflammation to epithelial regeneration.</a> Nature. 519 (7541), 57-62 (2015).</li>
<li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downstream+of+mutant+KRAS%2C+the+transcription+regulator+YAP+is+essential+for+neoplastic+progression+to+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Downstream of mutant KRAS, the transcription regulator YAP is essential for neoplastic progression to pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Sci Signal. 7 (324), ra42(2014).</li>
<li>Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ+at+the+Roots+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ at the Roots of Cancer.</a> Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).</li>
<li>Azzolin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ+incorporation+in+the+beta-catenin+destruction+complex+orchestrates+the+Wnt+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ incorporation in the beta-catenin destruction complex orchestrates the Wnt response.</a> Cell. 158 (1), 157-170 (2014).</li>
<li>Stingl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).</li>
<li>Means, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+epithelial+plasticity+mediated+by+acinar+cell+transdifferentiation+and+generation+of+nestin-positive+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pancreatic epithelial plasticity mediated by acinar cell transdifferentiation and generation of nestin-positive intermediates.</a> Development. 132 (16), 3767-3776 (2005).</li>
<li>Shi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+acinar+cell+organization+is+critical+to+preventing+Kras-induced+acinar-ductal+metaplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Maintenance of acinar cell organization is critical to preventing Kras-induced acinar-ductal metaplasia.</a> Oncogene. 32 (15), 1950-1958 (2013).</li>
<li>Huch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> EMBO J. 32, 2708-2721 (2013).</li>
<li>Fernandez Vallone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trop2+marks+transient+gastric+fetal+epithelium+and+adult+regenerating+cells+after+epithelial+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Trop2 marks transient gastric fetal epithelium and adult regenerating cells after epithelial damage.</a> Development. 143 (9), 1452-1463 (2016).</li>
<li>Yanger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cellular+reprogramming+occurs+spontaneously+during+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Robust cellular reprogramming occurs spontaneously during liver regeneration.</a> Genes Dev. 27 (7), 719-724 (2013).</li>
<li>Yui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ-Dependent+Reprogramming+of+Colonic+Epithelium+Links+ECM+Remodeling+to+Tissue+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ-Dependent Reprogramming of Colonic Epithelium Links ECM Remodeling to Tissue Regeneration.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li>
<li>Pan, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+patterns+of+multipotentiality+in+Ptf1a-expressing+cells+during+pancreas+organogenesis+and+injury-induced+facultative+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal patterns of multipotentiality in Ptf1a-expressing cells during pancreas organogenesis and injury-induced facultative restoration.</a> Development. 140 (4), 751-764 (2013).</li>
<li>Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+YAP+and+TAZ+in+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 758-770 (2017).</li>
<li>Lentiviral production and infection. , 
 <a target="_blank" href="http://www.bio.unipd.it/piccolo/protocols/YAP_reprogramming_protocols.pdf">http://www.bio.unipd.it/piccolo/protocols/YAP_reprogramming_protocols.pdf</a> (2016).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Hier presenteren we protocollen te herprogrammeren ex vivo terminaal gedifferentieerde epitheliale cellen van de verschillende weefsels in hun overeenkomstige weefsel-specifieke voorlopercellen (of ySCs) door voorbijgaande expressie van YAP, zoals gemeld eerder1. We beschikken over twee procedures gedetailleerde: een herprogrammering van de cellen FACS-gezuiverd door middel van lentivirale vectoren en een tweede men welk vermijdt virale infectie en maakt gebruik van transgene YAP expressie toe te staan. Elk protocol presenteert een efficiënte strategie te isoleren en cultuur primaire gedifferentieerde cellen en een strategie te dwingen exogene YAP genexpressie in gedifferentieerde cellen, het genereren van DOVO somatische weefsel-specifieke uitbreidbaar stamcellen (Zie regelingen in cijfers 1A en 2A).
We laten zien dat de isolatie strategieën hier gepresenteerd effectief een zuivere bevolking van gedifferentieerde cellen isoleren, zoals blijkt uit het feit dat we nooit een uitvloeisel van negatieve controlemonsters (cijfers 1 c en 2 C ontdekt).
De lentivirale vectoren in deze studie gebruikt voor de herprogrammering van de primaire borstklier LD cellen zijn doxycycline afleidbare, het aanbieden van de mogelijkheid van een strakke controle van de transgenic expressie; Hierdoor inschakelen en uitschakelen exogene YAP uitdrukking bij zal. Bijzondere aandacht moet worden geplaatst in het vermijden van het gebruik van een overmatige virale titer, als dit kan schadelijk zijn in termen van efficiëntie te herprogrammeren. In het geval van primaire acinaire cellen overstapten we op een volledig transgene aanpak te verkrijgen een YAP-afhankelijke herprogrammering met minimale manipulaties. Deze laatste strategie is ook bijzonder geschikt voor primaire alvleesklier acini, zoals geïsoleerde acinaire clusters nauwelijks vatbaar voor lentivirale infectie en erg kwetsbaar zijn. De transgene strategie in dienst biedt hetzelfde voordeel van doxycycline-afhankelijke lentivirale vectoren voor strakke controle op de genexpressie. Bovendien draagt de transgene strategie uitgebuit met primaire alvleesklier acini het extra voordeel van een veel hogere herprogrammering efficiëntie ten opzichte van de virale-geïnduceerde herprogrammering van de borstklier LD cellen. Buiten de verschillende intrinsieke plasticiteit gekoppeld aan cellen uit verschillende weefsels verkregen materialen, zou kunnen het hogere tarief van de alvleesklier herprogrammering worden afgeleid uit de hogere efficiëntie van expressie die is gekoppeld aan uniforme en autonome YAP uitdrukkingswijze, in alle transplanteren cellen. Met name hebben wij aangetoond dat exogene YAP niet langer nodig na generatie van ySCs (yMaSC kolonies en yDucts), is zonder de capaciteit van hun zelf-vernieuwing. Dit komt omdat ySCs endogene YAP/TAZ activeren en hen voor zelf-vernieuwing gebruiken als exogene YAP1is uitgeschakeld.
We het idee dat ySCs inderdaad ontstaan van gedifferentieerde cellen door het beheersen van de cel van de oorsprong van onze herprogrammering experimenten door genetische afkomst-tracing validaties1gevalideerd.
Karakterisering van het uitgebreidevan de ySCs toont dat YAP-geïnduceerde herprogrammering normale somatische SCs1 als ik genereert) op het niveau van de transcriptomic, ySCs weer massale overlappingen met inheemse SCs; II) ySCs differentiatie potentiële weergeven en kan leiden tot een multilineage nageslacht altijd beperkt tot de identiteit van hun weefsel van oorsprong; III) ySCs zijn niet-getransformeerd en niet-tumorigene wanneer getransplanteerd in vivo.
Hier beschrijven we ook procedures om te behouden en uit te breiden in cultuur zowel yMaSCs als yDucts als organoids ingebed in 100% kelder membraan matrix hydrogels. Deze voorwaarden voorzien in de zelforganisatie van ySCs in driedimensionale organoids die zorgen voor het behoud van de eigenschappen van de stemness op lange termijn in cultuur, inschakelen om uit te breiden deze stammen risicopopulaties zal voor downstream analyses en toepassingen. Om onbekende redenen, wij verzuimd te verkrijgen yMaSC organoids door het plaatsen van besmet LD cellen rechtstreeks in organoid kweekomstandigheden 7 dagen na behandeling met doxycycline in kunststof weefselkweek plaat; met andere woorden, is de groei van de tussenliggende stap in borstklier kolonie voorwaarden essentieel. In onze handen vereisen zelfs inheemse MaSCs borstklier kolonie voorwaarden voor passaging in organoid cultuur. Bovendien, de meest efficiënte uitvloeisel van de organoid wordt verkregen wanneer we vermijden distantiëren van de primaire kolonies in afzonderlijke cellen, maar eerder Breng de intact kolonies in organoid cultuuromstandigheden.
Organoid kweekomstandigheden dragen ook het voordeel dat de mogelijkheid om te cryopreserve ySCs, mits de organoids hun matrices, vermijden van cel dissociatie vóór cryopreservatie in stikstof bad worden verhaald.
De procedure ingediend te herprogrammeren YAP kunt converteren verschillende gedifferentieerde celtypes uit verschillende volwassen weefsels verkregen met hun bijbehorende weefsel-specifieke stamcellen (we hebben getest met behulp van de borstklier, alvleesklier en neuronale cellen)1. Bij verschil van iPSCs of andere herprogrammering inspanningen, kunnen YAP/veroorzaakte SCs handhaven de herinneringen van hun weefsel van oorsprong. Van de nota, ambtshalve differentiatie van somatische cellen in cellen begiftigd met stam-achtige eigenschappen is de enige vorm van cel lot plasticiteit en herprogrammering waargenomen in vivo, bijvoorbeeld na weefselbeschadiging en ter ondersteuning van de wond genezing van5,17 , 18 , 19 , 20. het is opmerkelijk dat YAP en TAZ grotendeels overbodig voor normale homeostase zijn maar cruciaal belang voor weefselherstel in meerdere weefsels11,21. Consistent met een fysiologische functie van de herprogrammering stappen die hier worden beschreven, is YAP/TAZ onlangs gebleken intestinale regeneratie in muismodellen van colitis ulcerosa patiënten door het veroorzaken van een conversie van volwassen intestinale cellen in vereist zijn een herstellende epitheel waarin functies van de foetale gut19. YAP herprogrammering dus breidt de huidige geïnduceerde cel plasticiteit strategieën door middel van een middel voor het genereren van somatische stamcellen, een staat die tot nu toe heeft zijn uitdagend te vangen in vitro. Deze aanpak, misschien als uitgebreid tot mens-afgeleide cellen, hebben brede relevantie van toepassingen van de regeneratieve geneeskunde aan de studie van de somatische stemness staat en stammen voor uitbreiding van somatische cellen in vitro.

Weefsel-specifieke somatische stamcellen (gcv) staan kritisch tegenover voor weefsel vernieuwing en herstel na blessure. De mogelijkheid om gemakkelijk isoleren en onbeperkt uitbreiden ex vivo somatische SCs vertegenwoordigt een kritieke kwestie voor potentiële regeneratieve therapieën, evenals voor SC toepassingen in basisonderzoek en modellering van de ziekte. Vooruitgang in die richting, is echter beperkt gebleven door de moeilijkheid van het vastleggen van de toestand van de SC van verschillende epitheliale organen in vitro. Inderdaad, in verschillende volwassen weefsels resident SCs kunnen niet bestaan of niet gemakkelijk beschikbaar zijn of hun aantal en regeneratieve potentieel kunnen worden aangetast door veroudering of ziekte omstandigheden. In 2016, we begonnen te vullen deze kloof door te rapporteren die uitdrukking van een enkele transcriptionele coactivator, YAP (ja-geassocieerde proteïne) of de nauw verwante eiwit TAZ (transcriptionele activeren met een motief van PDZ), in terminaal gedifferentieerde cellen efficiënt creëert functioneel, uitbreidbaar, niet-tumorigene autologe cellen met populaties die zowel operationeel als moleculair niet te onderscheiden van hun overeenkomstige weefsel-specifieke SCs1. Een puls van aanhoudende YAP of TAZ activiteit voor paar dagen is voldoende voor het opwekken van het uiterlijk van de somatische SCs zelf te vernieuwen. Dit is een stabiele toestand, die niet langer afhankelijk van continue transgenic expressie, zoals het via cel generaties zonder verdere uitdrukking van ectopische YAP/TAZ1kan worden overgedragen. Het protocol gepresenteerd hier details de procedure gebruikt voor het genereren van DOVO epitheliale stam-/ voorlopercellen van de melkklier en alvleesklier, vanaf van gedifferentieerde cellen van deze weefsels. Deze procedure vult een zwarte doos in de huidige herprogrammering/transdifferentiatie-arena. Belangrijkste inspanningen in deze richtingen hebben tot nu toe inderdaad gecentreerd op cel overgang naar een geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) staat, gevolgd door de omzetting van deze embryonale en pluripotente SCs in meer gedifferentieerde cellen. IPSCs zijn echter tumorigene eenmaal ingevoerd in volwassen weefsels, het verhogen van de noodzaak van het ontwikkelen van protocollen voor hun volledige en efficiënte differentiatie2. Echter, deze differentiatie stap, zelfs indien mogelijk, komt ten koste van langdurige uitbreidbaarheid, zelforganisatie en orgel herbevolking potentieel. Dit zijn essentiële kenmerken voor regeneratie van het orgel dat in feite typische alleen van endogene weefsel-specifieke SCs en het momenteel beschreven YAP-geïnduceerde SCs (ySCs). Ook gedifferentieerde directe transdifferentiatie van één celtype in een ander met behulp van cocktails van verschillende transcriptie factoren ook genereren cellen dat het gebrek aan essentiële proliferatieve en stemness potentiële3.
De hier beschreven procedure maakt ook gebruik van de onlangs geïntroduceerde organoid-technologie, waarmee endogene SCs kunnen worden uitgebreid en gedifferentieerd ex vivo4. YAP-geïnduceerde SCs kunnen genereren organoid-vormende SCs zelfs in experimentele, biologische of ziekte omstandigheden waarin endogene SCs niet aanwezig zijn. Wij zou willen opmerken dat, op het verschil met andere herprogrammering procedures, het soort plasticiteit van de cel bijgebracht door YAP kan corresponderen met de enige vorm van de terugkeer naar een SC-achtige status die in levende weefsels voorkomt. Reacquisition van SC-achtige eigenschappen is geassocieerd met weefselherstel of oncogene activering5. Hoewel overbodig voor de homeostase van verschillende volwassen weefsels, zijn YAP en/of TAZ absoluut essentieel voor regeneratie, tumorgroei en uitbreiding van somatische SCs in vitro1,6,7,8 ,9,10,11,12

<table><tbody><tr><td>10 mL steriele spuiten</td><td>Rays</td><td>10LC</td><td></td></tr><tr><td>100 mm  cel zeef</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>15 mL steriele kegelbuisjes</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>24-well ultra laaghankende platen</td><td>Costar</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>40 mm cel zeefv</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>48-well multiwell platen</td><td>Corning</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>50 mL steriele kegelbuisjes</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>6-well multiwell platen</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>BPE</td><td>Gibco</td><td>13028014</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase, type I</td><td>Sigma</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>dexamethasone</td><td>Sigma</td><td>D4902 </td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>1705-041</td><td></td></tr><tr><td>Wegwaarschappen</td><td>Swann-Morton</td><td>0503</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DnaseI</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>doxycycline hyclaat</td><td>Sigma</td><td>D9891 </td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 100%</td><td>Sigma</td><td>51976</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes (met zeefdoppen)</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-muis CD326 (Ep-CAM)</td><td>BioLegend</td><td>118208</td><td></td></tr><tr><td>FUdeltaGW-rtTA </td><td>Addgene</td><td> #19780 </td><td></td></tr><tr><td>FUW-tetO-EGFP</td><td>Addgene</td><td> #84041</td><td>gebruikt als negatieve controle</td></tr><tr><td>FUW-tetO-MCS</td><td>Addgene</td><td> #84008</td><td>gebruikt als negatieve controle</td></tr><tr><td>FUW-tetO-wtYAP</td><td>Addgene</td><td> #84009</td><td></td></tr><tr><td>FUW-tetO-YAPS94A</td><td>Addgene</td><td> #84010</td><td>gebruikt als negatieve controle (transcriptioneel dode YAP mutant)</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>30721</td><td></td></tr><tr><td>heparine natriumzout</td><td>Sigma</td><td>H3149 </td><td></td></tr><tr><td>HEPES bufferoplossing (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>human R-Spondin1 (His Tag)</td><td>Sino Biological</td><td>11083-H08H-5</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase uit rundertestikels</td><td>Sigma</td><td>H3506 </td><td></td></tr><tr><td>ITS-X</td><td>Gibco</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>K-14 antilichaam</td><td>Life Technologies</td><td>Ab7800 </td><td></td></tr><tr><td>K-8 antilichaam</td><td>Life Technologies</td><td>Ab14053 </td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td> 25030081</td><td></td></tr><tr><td>Lin (allofycocyanine [APC] muis lijn antilichaam cocktail)</td><td>BD Biosciences</td><td>51-9003632</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel® Groeifactor Verminderde Basement Membrane Matrix, Fenol Rood-Vrij</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcysteïne</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>J.T.Baker</td><td>0402</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A9434 </td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>72340</td><td></td></tr><tr><td>niet-cel kleefbare 10 cm schotels (steriele polystyreen petrischaal ø 94)</td><td>ROLL</td><td>18248</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Euroclone</td><td>ECM4004XL</td><td></td></tr><tr><td>PE Hamster Anti-Muis CD61</td><td>BD Biosciences</td><td>553347</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy5 Rat Anti-Mens CD49f</td><td>BD Biosciences</td><td>551129</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-muis/rat CD29 Antilichaam</td><td>BioLegend</td><td>102222</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Rattenstaart Collageen I (coating)</td><td>Sigma</td><td>122-20</td><td></td></tr><tr><td>Rattenstaart Collageen I voor 3D cultuur</td><td>Cultrex</td><td>3447-020-01 </td><td></td></tr><tr><td>recombinant menselijk FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>recombinant menselijk Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>recombinant muis EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>recombinant muis FGF basis (bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>450-33</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Gibco</td><td>31870025</td><td></td></tr><tr><td>SBTI (Trypsine-remmer uit Glycine max)</td><td>Sigma</td><td>T6522 </td><td></td></tr><tr><td>Tris BASE </td><td>Roche</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,05%</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Waymouth medium</td><td>Gibco</td><td>31220023</td><td></td></tr></tbody></table>

dovo generatie van somatische stamcellen door yap/taz

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

Hier presenteren we protocollen voor het isoleren van primaire gedifferentieerde cellen en zet die ze in de stengel/voorlopercellen (gcv) van het zelfde geslacht door voorbijgaande uitdrukking van de transcriptiefactor YAP. Met deze methode worden luminal gedifferentieerde (LD) cellen van de melkklier muis omgezet in cellen die moleculaire en functionele eigenschappen van borstklieren SCs. YAP ook bochten volledig gedifferentieerde alvleesklier exocrine cellen in de alvleesklier buis-achtige vertonen progenitoren. Op dezelfde manier aan endogene, natuurlijke SCs, kunnen YAP-geïnduceerde stam-achtige cellen ("ySCs") worden uiteindelijk uitgebreid als organoid culturen lange termijn in vitro, zonder verdere nood van ectopische YAP/TAZ, zoals ySCs zijn begiftigd met een erfelijke zichzelf vernieuwende SC-achtige toestand.
De herprogrammering procedure hier gepresenteerd biedt de mogelijkheid om te genereren en uit te breiden van in vitro voorlopercellen van verschillende weefsel bronnen vanaf van gedifferentieerde cellen. De eenvoudige uitbreiding van somatische cellen ex vivo heeft gevolgen voor regeneratieve geneeskunde, voor het begrijpen van mechanismen van tumor inleiding en, meer in het algemeen, voor de cel en ontwikkelingsbiologie studies.

Generatie van yMaSCs Een overzicht van de experimentele strategie om te herprogrammeren primaire borstklier LD cellen door voorbijgaande expressie van YAP is in figuur 1Agepresenteerd. Primaire borstklier LD epitheliale cellen zijn gezuiverd door tl-geactiveerde cel sorteren van13. Figuur 1B vertegenwoordigt een typische sorteren procedure voor het verkrijgen van drie verschillende subpopulaties: basale cellen (EpCAMlageCD49fhogeCD61-), Luminal voorlopercellen (LP) cellen (EpCAMhogeCD49flageCD61+ ) en LD cellen (EpCAMhogeCD49flageCD61-). Voorzichtig van de drie subpopulaties gating is essentieel voor het isoleren van een zuivere voorbereiding van LD-cellen, die volledig worden gedifferentieerd en volledig groei gearresteerd toen zaadjes in de melkklier kolonievormende voorwaarden (Zie Figuur 1 c, deelvenster links). Omgekeerd, wanneer geïnduceerde uitspreken exogene YAP, LD cellen beginnen prolifererende om te vormen gemakkelijk herkenbaar dichte epitheliale kolonies in 5% kelder membraan matrix schorsing culturen (Figuur 1 c). De efficiëntie van herprogrammering, geattesteerd ongeveer 3% voor een typisch experiment, gescoord kan worden door het tellen van het aantal kolonies over het aantal afzonderlijke cellen oorspronkelijk geplaatste in kelder membraan matrix schorsing culturen (Figuur 1 d). Geherprogrammeerde luminal cellen (yMaSCs) kunnen dan worden passage in 100% kelder membraan matrix organoid kweekomstandigheden (zie schema in figuur 1A), zelf-organiserende in complexe organoid-achtige structuren die rond meerdere lumen ontwikkelen en weergeven van opmerkelijke zelf-vernieuwing vermogen zelfs in afwezigheid van doxycycline (dat wil zeggen in de afwezigheid van transgene YAP expressie) (figuur 1E). Histologisch, yMaSC afkomstige organoids weergeven een basale laag (K14 positieve), geconfronteerd met de kelder membraan matrix gereconstitueerd ECM en een luminal laag (K8 positieve), geconfronteerd met de lumen-achtige Holten binnen het organoid (figuur 1F). Deze architectuur is niet te onderscheiden van die van organoids gevormd door inheemse MaSCs (figuur 1F).
Generatie van yDucts Een overzicht van de experimentele strategie om te herprogrammeren primaire alvleesklier acini door voorbijgaande expressie van YAP wordt gepresenteerd in figuur 2A. Hele acinaire clusters zijn geïsoleerd van het merendeel van de alvleesklier weefsel door een combinatie van milde dissociatie en grootte uitsluiting door middel van filtratie. Een typische preparaat wordt gepresenteerd in figuur 2B. Na isolatie, de clusters acinaire cel moeten worden weergegeven als een schorsing van exocrine acinaire eenheden van homogene grootte, met geen besmetting door endocriene eilandjes van Langerhans of fragmenten van de alvleesklier ductaal boom en minimale dissociatie aan afzonderlijke cellen. Besmetting door endocriene eilandjes of ductaal fragmenten is een indicatie van gebrekkig selectief filtratie (stap 2.1.10), mogelijk te wijten aan ruwe behandeling; ongewenste dissociatie van acinaire clusters aan afzonderlijke cellen mogelijk als gevolg van buitensporige collagenase behandeling of niet-gebufferde activiteit van Proteolytische enzymen uitgebracht door het weefsel, die kan worden afgeremd door extra SBTI behandeling.
Een typische acinaire herprogrammering experiment wordt gepresenteerd in figuur 2C; binnen 5-7 dagen van de cultuur in 3D collageen-I gebaseerd hydrogel in aanwezigheid van doxycycline, alvleesklier acini afgeleid van R26-rtTAM2/tetO-YAPS127A muizen gemakkelijk omzetten in buis-achtige clusters (dat we met de naam yDucts), gecomponeerd door een dunne enkelgelaagde van epitheliale cellen die zich rond een groeiende centrale holte verspreiden. De herprogrammering efficiëntie, die ongeveer 70% voor een typisch experiment is, kan gemakkelijk worden gemeten door het aantal buis-achtige clusters scoren over het totale aantal geplaatste acini (figuur 2D). De negatieve controle cellen, oftewel R26-rtTAM2 / + cellen of R26-rtTAM2/tetO-YAPS127A cellen links zonder doxycycline, onveranderlijk blijven als post mitotische acinaire clusters in deze kweekomstandigheden, zoals eerder gemeld1 ,14,15. Geherprogrammeerde yDucts kan vervolgens worden gepasseerd op het niveau van één cel in voorwaarden16 van de cultuur van de Matrigel gebaseerde organoid (zie schema in figuur 2A), opmerkelijke zelf-vernieuwing vermogen zelfs in afwezigheid van doxycycline (d.w.z. weergeven in afwezigheid van transgene YAP expressie) (figuur 2E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig1.jpg"> Figuur 1: Isolatie van primaire borstklier LD cellen en inductie van borstklieren stamcellen. (A) schematische weergave van de experimentele procedure aangenomen om te herprogrammeren primaire borstklier LD cellen. (B) vertegenwoordiger FACS-verhuur van staanpaaltsen ter illustratie van een typische sorteren procedure LD cellen te zuiveren. i) gedissocieerde cellen zijn gated volgens voorwaartse en zijdelingse scatter voor levende cellen (P1, blauw); II) bevolking P1 is dan meer gated volgens haar Lin-profiel: de subpopulatie Lineage-negatieve cellen (P2; grijs) is geselecteerd, met uitzondering van geslacht-positieve hematopoietische cellen; III) bevolking P2 is wordt onderverdeeld in een EpCAMhoog (P3; geel + groen) en een EpCAMlaag (P6; rood) subpopulaties; IV) P3 en P6 zijn vervolgens meer gated volgens hun CD61/CD49f-profiel in drie subpopulaties: EpCAMlageCD49fhogeCD61- basale cellen (P7; rood), EpCAMhogeCD49flageCD61+ LP cellen (P8; geel) en EpCAMhogeCD49flageCD61- LD cellen (P9; groen). (C) afbeeldingen zijn illustratief voor de mogelijkheid van LD cellen, besmet met de aangegeven constructies, vormen borstklier kolonies 15 dagen na het zaaien in de borstklier kolonie medium. YAP-uiten cellen linksaf naar de kolonie-vormende cellen, overwegende dat negatieve controle cellen (EGFP-geïnfecteerde) blijven slechts als afzonderlijke cellen groei-gearresteerd. Schaal bar = 50 μm. (D) kwantificering van de kolonievormende vermogen van de aangegeven cellen, zoals in (C). Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde + s.d. en zijn vertegenwoordiger van vijf onafhankelijke experimenten, elk met zes technische replicatieonderzoeken. (E) representatieve afbeelding van YAP-geherprogrammeerd borstklier stamcel-achtige cellen (yMaSCs) na 12 dagen in organoid kweekomstandigheden in verse driedimensionale 100% kelder membraan matrix hydrogel in de afwezigheid van Doxycycline. Schaal bar = 100 μm. (F) beelden van het representatieve immunofluorescentietest voor de basale markering K14 (groen) en de luminal markering K8 (rood) van organoids ontleend aan de aangegeven cellen, na 12 dagen in organoid cultuuromstandigheden. Schaal bar = 10 μm. Dit cijfer is gereproduceerd van Panciera et al., 20161. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig2.jpg"> Figuur 2 : Isolatie van primaire alvleesklier acinaire cellen en alvleesklier progenitoren-inductie. (A) schematische weergave van de experimentele procedure aangenomen om te herprogrammeren primaire alvleesklier exocrine acinaire cellen. (B) representatieve afbeelding van primaire alvleesklier acini net na de isolatie procedure (stap 2.1.14). De acinaire voorbereiding moet worden weergegeven als een homogene suspensie van acinaire clusters, met minimale aanwezigheid van afzonderlijke cellen. Schaal bar = 400 μm. (C) representatieve beelden van primaire alvleesklier acini afgeleid van R26-rtTAM2 (bovenste panelen)of R26-rtTAM2; tetO-YAPS127A (lagere panelen) muizen en gekweekt in 3D-collageen ik-op basis van hydrogel voor 5 dagen met of zonder Doxycycline (doxy), zoals aangegeven. Alleen converteren primaire acini YAP-uiten naar cellen groeien als de cyste-achtige organoid na toevoeging van Doxycycline. Schaal bars = 70 μm. (D) kwantificering van het vermogen van de alvleesklier acini vormen ductaal organoids op transgene YAP overexpressie zoals in (C). Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde + s.d. en representatief zijn voor vijf onafhankelijke experimenten, uitgevoerd met vier technische replicatieonderzoeken. (E) representatieve afbeelding van YAP-reprogramed ductaal-achtige cellen (yDucts) na drie passages in verse driedimensionale 100% kelder membraan matrix hydrogel bij gebrek aan Doxycycline. Schaal bar = 130 μm. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Isolatie van primaire borstklier cellen</td>
		</tr>
<tr>
<td>CA2 + chelaat oplossing</td>
			<td>Bewaren bij 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>0,02% w/V</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Collageen ik coating oplossing</td>
		</tr>
<tr>
<td>Azijnzuur, 0.02N, pH 3,23</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Rat staart collageen (coating)</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase oplossing</td>
			<td>Bewaren bij 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Dissociatie Medium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase-stockoplossing</td>
			<td>400 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Stockoplossing collagenase ik</td>
			<td>600 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hemolytische oplossing</td>
			<td>Bewaren bij 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl oplossing</td>
			<td>1 onderdelen</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrisBase 20.6 g/L</td>
			<td>9 onderdelen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Breng pH op 7,2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS/PS</td>
			<td>Bewaren bij 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>2 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase-stockoplossing</td>
			<td>Filteren van 0,2 µm, bewaren bij 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase van boviene teelballen (poeder)</td>
			<td>2.000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriumfosfaat Buffer 1 M pH7.3</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl oplossing</td>
			<td>Bewaren bij T. amb.</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl</td>
			<td>7.1 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Breng pH op 7,65</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Sorteren van de oplossing</td>
			<td>Filteren van 0,2 µm, bewaren bij 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES pH 7</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Wassen van Medium #1</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Wassen van Medium #2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Borstklier 2D kweekmedium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
<tr>
<td>heparine</td>
			<td>4 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-Glutamine</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>lymfkliertest bFGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>lymfkliertest EGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Inductie en Passaging van yMaSCs</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Borstklier kolonie Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>heparine</td>
			<td>4 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-Glutamine</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Matrigel (Voeg onmiddellijk vóór het zaaien)</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>lymfkliertest bFGF</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>lymfkliertest EGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Borstklier Organoid Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>Geavanceerde DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>GlutaMax</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>heparine</td>
			<td>4 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>menselijke Noggin</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>lymfkliertest bEGF</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>lymfkliertest EGF</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: generatie van yMaSCs. Samenstelling van alle verschillende kweekmedia en oplossingen nodig zijn voor de isolatie van primaire borstklier LD cellen en inductie van yMaSCs (deel 1)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Isolatie van primaire alvleesklier acini</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acinaire kweekmedium</td>
		</tr>
<tr>
<td>BPE</td>
			<td>50 µg Mo/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dexamethason</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>ITS-X</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Waymouth van Medium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acinaire Wash Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>RPMI Medium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acinaire herstel Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acinaire kweekmedium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Collagenase ik oplossing A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acinaire Wash Medium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Stockoplossing collagenase ik</td>
			<td>360 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS/PS</td>
			<td>Bewaren bij 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS (Phosphate buffered saline)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Stockoplossing collagenase ik</td>
			<td>Opslag bij-20 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagenase, type ik (poeder)</td>
			<td>6.000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Passaging van de alvleesklier organoids</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Collagenase ik oplossing B</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS 1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Stockoplossing collagenase ik</td>
			<td>240 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Alvleesklier Organoid Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>Geavanceerde DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>gastrine</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>menselijke FGF10</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>menselijke Noggin</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>lymfkliertest EGF</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-Acetylcysteïne</td>
			<td>1.25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nicotinamide</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: generatie van yDucts. Samenstelling van alle verschillende kweekmedia en oplossingen nodig zijn voor de isolatie van primaire acinaire cellen en inductie en passaging van yDucts (deel 2)

Beschikbaarheid van somatische SCs is van cruciaal belang voor regeneratieve geneeskunde, ziekte modellering en inzicht te krijgen in de eigenschappen van de SC. Hier presenteren we experimentele strategieën om te herprogrammeren, in vitro, gedifferentieerde volwassen cellen in hun overeenkomstige uitbreidbaar weefsel-specifieke stam/voorlopercellen door de voorbijgaande uitdrukking van de enkele transcriptionele co activator YAP.

DOVO Generatie van somatische stamcellen door YAP/TAZ

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

Het algemene doel van deze procedure is om primaire gedifferentieerde cellen om te zetten in voorlopercellen van dezelfde afstamming door middel van tijdelijke expressie van de transcriptiefactor YAP. Deze herprogrammeringsprocedure biedt de mogelijkheid om in vitro voorlopercellen of stamcellen van verschillende weefsels te genereren, beginnend vanuit hun gedifferentieerde tegenhangers, zelfs wanneer de endogene stamcellen zeldzaam of moeilijk te identificeren zijn. De mogelijkheid hier om somatische cellen ex vivo uit te breiden heeft implicaties voor regeneratieve geneeskunde voor het begrijpen van mechanismen van cellulaire plasticiteit die ook relevant is in kanker en voor celweefsel en ontwikkeling van biologiestudies.Deze procedure vult een zwarte doos in de huidige herprogrammeringsarena, omdat we niet streven naar het maken van gespecialiseerde cellen door differentiatie van embryonale stamcellen, maar weefselspecifieke stamcellen uit gedifferentieerde cellen. Nadat 10 vrouwelijke muizen zijn geofferd volgens het protocol in de tekst, worden de borstklieren gedissected door een Y-vormige incisie langs de buikhuid te maken. Gebruik vervolgens dumont-tang om de klieren voorzichtig te scheiden van het peritoneum door voorzichtig te trekken.Plaats de gedissekteerde klieren in een niet-cellulaire adhesief schaal met 10 milliliter ijskoud HBSS+PS. Gebruik onder een weefselkweekkap 10 milliliter vers HBSS+PS om elke klier eenmaal te wassen en plaats ze in een lege niet-cellulaire adhesief schaal. Gebruik vervolgens twee steriele scalpels om de klieren fijn te snijden in fragmenten van één kubieke millimeter.Juiste snijding van de klieren is essentieel voor efficiënte celisolatie. Trek 20 klieren samen en probeer deze stap binnen drie tot vijf minuten uit te voeren voor optimale cellevensvatbaarheid. Gebruik een 25 milliliter serologische pipet en 10 milliliter dissociatiemedium om het gesneden weefsel uit elke schaal te recupereren en breng de suspensie over in een 50 milliliter conische buis door ten minste vijf keer te pipetteren om de weefselklonten te disaggregeren.Incubeer het weefsel gedurende één uur bij 37 graden Celsius met continu krachtig schudden. Draai vervolgens het gedigesteerde weefsel bij 400 keer g bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Na het weggegooien van de supernatant, gebruik drie milliliter hemolytische oplossing om het weefsel te resuspenderen en incubeer het op ijs gedurende drie minuten.Vervolgens, met 10 milliliter wasmedium nummer één, was de cellen. Na het draaien van het gedigesteerde weefsel en weggooien van de supernatant, resuspendeer de weefselpellet in 10 milliliter wasmedium nummer twee en plateer de cellen in 10 centimeter weefselkweekschalen. Incubeer vervolgens de schalen gedurende één uur bij 37 graden Celsius.Recupereer de celsuspensie in een 50 milliliter conische buis en draai de buis bij 400 keer g gedurende vijf minuten. Gebruik vervolgens 10 milliliter van de calciumchelatingoplossing om de pellet te resuspenderen. Na centrifugatie en na herhaling van de wassing, resuspendeer de pellet in vijf milliliter 0,25% trypsin-EDTA.Na het incuberen van het monster, voeg vijf milliliter dispase-oplossing toe, gesupplementeerd met één microgram per milliliter DNase één, bovenop de trypsinoplossing. Gebruik een 1 milliliter pipettetip om de klonten te disaggregeren door minstens vijf keer op en neer te pipetteren en incubeer het monster gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius met schudden om de drie minuten. Voeg 10 milliliter wasmedium nummer twee toe en filter de oplossing door een 40 micrometer celstrainer in een nieuwe 50 milliliter conische buis.Spin vervolgens de celsuspensie neer. Gebruik 200 microliter wasmedium nummer één om elke pellet te resuspenderen voor celzuivering door FACS. Voeg vervolgens 44,5 microliter antilichaammix toe, pipetteer grondig en incubeer het monster in het donker op ijs gedurende 30 minuten.Verdun de celsuspensie in 10 milliliter wasmedium nummer één en draai het monster neer. Resuspendeer de celpellet in twee milliliter sorteeroplossing en filter door een dopjestrainer FACS-buis voordat u doorgaat met FACS-scheiding van de celpopulaties. Gebruik wasoplossing nummer één om de cellen die van FACS zijn hersteld te wassen.Na het verwijderen van het supernatant, gebruik mammair 2D-kweekmedium om de celpellet te resuspenderen en plateer 500 microliter per putje op een collageen-behandelde plaat. Zeven dagen na doxycycline-inductie van lentiviraal geïnfecteerde primaire LD-cellen, voeg 150 microliter per putje van 05% trypsin-EDTA toe aan de cellen en incubeer ze gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Zodra de cellen zijn gewassen en geteld, gebruik geheugenkoloniemedium, aangevuld met twee microgram per milliliter doxycycline om ze te resuspenderen.Zaai vervolgens 1.000 cellen per putje in 24-well ultra-lage aanhechtingsplaten voor het kweken van YAP-expresserende masker-achtige kolonies. Om y-maskers te subcultiveren, verzamel elk monster en voeg een 10 tot 1 volume ijskoud HBSS toe, en incubeer de monsters gedurende één uur op ijs om de basale membraanmatrix te solubiliseren. Na het draaien van de kolonies, gebruik ijskoud HBSS om de cellen drie keer te wassen.Voeg vervolgens 05% trypsin-EDTA toe aan de kolonies en incubeer ze gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Laat de kolonies tien keer door een P1000 pipettetip gaan om een ​​enkele celsuspensie te verkrijgen. Tel vervolgens en zaai de cellen opnieuw in mammair koloniemedium zonder doxycycline in 24-well ultra-lage aanhechtingsplaten bij een colonogene dichtheid van 1.000 cellen per putje.Voor de derde passage, breng y-maskerkolonies over in organoïdkweekomstandigheden door de kolonies uit het mammaire koloniemedium te recupereren en gebruik 100% groeifactor-verminderde basale membraanmatrix om ze te resuspenderen. Na incubatie, wanneer de basale membraanmatrix is gestold, bedek de gels met 500 microliter van het mammaire organoïdmedium. Passage de culturen door elke organoïd-monster te verzamelen en ze gedurende één uur in een overmaat van

de-novo-generation-of-somatic-stem-cells-by-yaptaz

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video toont de procedure voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van induceerbare lentivirus die uitdrukken Oct4, Sox2, c-Myc en Klf4.

Het genereren van iPS Cellen van MEF door gedwongen Expressie van Sox-2, okt-4, c-Myc en Klf4

Een methode om de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) via retrovirus-gemedieerde ectopische expressie van OCT4 genereren, wordt SOX2, KLF4 en MYC beschreven. Een praktische manier om de menselijke IPSC kolonies op basis van GFP expressie te identificeren wordt ook besproken.

Herprogrammeren menselijke somatische cellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) Met behulp van retrovirale vector met GFP

Hier laten we een eenvoudige en effectieve protocol voor het genereren van menselijke iPSCs 3-4 ml van perifeer bloed met een lentivirale vector herprogrammering. Herprogrammering van direct beschikbare bloedcellen belooft om het gebruik van IPSC technologie te versnellen door het toegankelijk voor een breder onderzoeksgemeenschap.

Generatie van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed Met behulp van de STEMCCA lentivirale vector

Deze studie toont de herprogrammering van somatische cellen naar pluripotentie in vivo zonder de vorming van teratomen. We gebruikten hydrodynamische injectie in de staartader van plasmide-DNA dat codeert voor de Yamanka-factoren om de in vivo herprogrammering van volwassen hepatocyten in cellen met verbeterde pluripotentie te induceren.

In vivo herprogrammeren van volwassen lichaamscellen te Pluripotentie door overexpressie van Yamanaka Factors

Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) vormen een bron van patiënt-specifieke weefsels voor klinische toepassingen en fundamenteel onderzoek. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMNCs) die van bevroren buffy coats in viraal-vrije iPSCs met niet-integrerende episomale plasmiden herprogrammeren.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van Frozen Buffy Coats behulp van niet-integrerende Episomaal plasmiden

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor efficiënte generatie van integratievrije iPSC's uit menselijke volwassen perifere bloedcellen. Met behulp van vier oriP/EBNA-gebaseerde episomale vectoren om de herprogrammeringsfactoren, KLF4, MYC, BCL-XL, of OCT4 en SOX2 tot expressie te brengen, kunnen duizenden iPSC-kolonies worden verkregen uit 1 mL perifeer bloed.

Generatie van Integratie-free geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere mononucleaire bloedcellen behulp Episomaal Vectors

Primordiale kiemcellen (PGCs) zijn gemeenschappelijk voorlopers van zowel de zaadcellen als de eicellen. Menselijke embryonale PGCs zijn opgegeven uit pluripotente cellen van de epiblast door middel van interacties van cytokinen. Hier beschrijven we een 13-daagse protocol van het inducerende menselijke cellen transcriptomally gelijkend op PGCs aan het oppervlak van embryoid instanties van primer-pluripotent geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Generatie van menselijke primordiale geslachtscellen-achtige cellen aan de oppervlakte van Embryoid instanties van primer-pluripotent geïnduceerde pluripotente stamcellen

Dit protocol werd gegenereerd als een middel om hersenorganoïden te produceren in een vereenvoudigde, goedkope manier zonder exogene groeifactoren of kelder membraan matrix met behoud van de diversiteit van de hersenen cel types en vele kenmerken van cellulaire organisatie.

Een statische zelfsturende methode voor het genereren van hersenorganoïden uit menselijke embryonale stamcellen

We presenteren hier een methode die het gebruik van chemische epigenetische wissing combineert met mechanosensing-gerelateerde signalen om efficiënt pluripotente cellen van zoogdieren te genereren, zonder de noodzaak van gentransfectie of retrovirale vectoren. Deze strategie is daarom veelbelovend voor translationele geneeskunde en vertegenwoordigt een opmerkelijke vooruitgang in stamcelorganoïde technologie.

Een strategie in twee stappen die epigenetische modificatie en biomechanische signalen combineert om pluripotente cellen van zoogdieren te genereren

Dit artikel beschrijft een procedure om iTenocyten te produceren door iPSC-afgeleide mesenchymale stromale cellen te genereren met gecombineerde overexpressie van Scleraxis met behulp van een lentivirale vector en uniaxiale rek via een 2D-bioreactor.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide iTenocyten via gecombineerde scleraxis-overexpressie en 2D uniaxiale spanning

Leer hoe je gedifferentieerde cellen omzet in stamcellen via YAP-expressie voor regeneratieve geneeskunde. Deze methode genereert weefsel-specifieke stamcellen uit volwassen mammacellen en alvleesklierweefsel.

DOVO Generatie van somatische stamcellen door YAP/TAZ

Meer video's verkennen