Detectie van Inflammasome-activering en Pyroptotic celdood in lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen

De algemene doelen van dit protocol zijn om de activering van inflammasomen op het niveau van enkele cellen te onderzoeken via fluorescentiemicroscopie en om de lysis tijdens pyroptose te meten door middel van een lactate dehydrogenase, of LDH-afgiftetest. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van inflammasomen, zoals hoe de activering van Caspase-1 wordt gereguleerd. Het grote voordeel van deze technieken is dat ze de gebruiker in staat stellen om meerdere stappen van de activerings- en pyroptoseroutes van het inflammasoom te onderzoeken.

Andreas den Hartigh, een onderzoekswetenschapper uit mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren. Begin door het medium van LPS-geprimede beenmerg-afgeleide macrofagen, gezaaid op glazen dekglasjes, te vervangen door 290 microliter DMEM 5-medium, aangevuld met vijf micromolar nigericine en vijf millimolar glycine, per putje. Breng de 24-wellsplaat terug in de celcultuur-incubator gedurende 60 minuten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide, en voeg na de eerste 15 minuten 10 microliter 30X FAM-YVAD-FMK toe.

Aan het einde van de incubatie, was de cellen met één milliliter koud PBS per putje, driemaal gedurende vijf minuten per wasbeurt en fixeer de cellen met 250 microliter 2% paraformaldehyde per putje gedurende 30 minuten op ijs beschermd tegen licht, en label de cellen met een geschikte fluorescentie nucleaire kleurstof gedurende de laatste vijf minuten. Aan het einde van de incubatie, was de cellen driemaal met koud PBS zoals net gedemonstreerd en laad elke dia met zeven microliter anti-fade montagemedium. Plaats een dekglas op elke dia en laat het montagemedium een nacht harden voordat u de dekglazen verzegelt met nagellak.

Om de cellen door middel van fluorescentie confocale microscopie te beeldvormen, plaats de onbehandelde controle dia op het microscoopplatform en focus handmatig op de cellen. Gebruik de microscoop look-up tabel instellingen om de offset aan te passen totdat er geen positieve sondeverkleuring wordt waargenomen in de onbehandelde cellen. Gebruik vervolgens een met nigericine behandelde monster om een veld te lokaliseren dat zowel positieve als negatieve cellen voor de sondeverkleuring bevat en pas het beeldvlak van het sondekanaal aan op het vlak dat de hoogste intensiteit van positieve kleuring heeft.

Vervolgens past u de versterking aan totdat de foci zichtbaar zijn in de cellen met gecondenseerde kernen en verkrijgt u beelden van vijf willekeurig geselecteerde velden per dia bij een totale vergroting van 100X. Voor immunofluorochemische analyse van de met nigericine behandelde cellen, was de prop-gelabelde cellen zoals net gedemonstreerd en incubeer de cellen in 250 microliter fixatie- en permeabilisatieoplossing per putje gedurende 30 minuten op ijs, beschermd tegen licht. Was de macrofagen nog drie keer met verse wasbuffer en label de cellen met 250 microliter primaire antilichaam tegen een ptose-geassocieerd, speck-achtig eiwit dat een C-terminaal caspase-rekruteringsdomein bevat, of ASC, per putje, gedurende één uur op ijs.

Was de cellen aan het einde van de incubatie en label de monsters met 250 microliter van de geschikte fluorescentie kleurstof geconjugeerde secundaire antilichaam voor nog een uur op ijs, en voeg tijdens de laatste vijf minuten vier microliter van een geschikte fluorescentie nucleaire kleurstof toe. Na het wassen van de cellen driemaal in koude wasbuffer, monteer de dekglazen op de dia's met zeven microliter anti-fade montagemedium, zoals gedemonstreerd, en beeld de macrofagen af door middel van fluorescentie confocale microscopie. Om een LDH-afgiftetest uit te voeren, voegt u 50 microliter DMEM 5-medium toe, aangevuld met 10 micromolar nigericine, aan elke experimentele put en 50 microliter DMEM 5 aan de spontane en 100% lysis controleputten gedurende 60 minuten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Na 30 minuten, voeg 10 microliter 10X lysis buffer toe aan de 100% lysis controleputten en voeg 10 microliter medium toe aan de andere putten. Aan het einde van de incubatie, centrifugeert u de plaat en brengt u 50 microliter supernatant van elke put over naar een heldere, platbodemplaat. Voeg vervolgens 50 microliter vers ontdooid en bereid substraat toe aan elke put voor een 30 minuten durende incubatie in het donker, en controleer de plaat na 15 minuten om te bevestigen dat het signaal de detectielimiet van de plaatlezer niet zal overschrijden.

Aan het einde van de incubatie, voegt u 50 microliter stopoplossing toe aan elke put en meet de OD490 op een geschikte plaatlezer om de berekening van het percentage cellyse per put mogelijk te maken. Terwijl type macrofagen die zijn blootgesteld aan nigericine de vorming van een ASC-focus in het perinucleaire gebied laten zien die ook actieve Caspase-1 bevat, wat aangeeft dat deze cellen pyroptose ondergaan, laten macrofagen van Caspase-111-deficiente muizen ook een ASC-focus ontstaan, maar deze cellen hebben geen actieve Caspase-1 geassocieerd met deze focus, zoals aangegeven door de afwezigheid van FAM-YVAD-FMK kleuring.

Ook zijn de kernen van deze cellen niet gecondenseerd, wat wijst op een afwezigheid van pyroptotische celdood. Verder ondergaat een groot percentage wild type macrofagen celdood na blootstelling aan nigericine, zoals gemeten door LDH-afgifte-analyse van hun cultuursupernaten, terwijl macrofagen die Caspase-1-deficient zijn, geen LDH in het supernatant afgeven, wat aangeeft dat de cellen intact blijven. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de vorming van inflammasomen kunt visualiseren door middel van fluorescentiemicroscopie en hoe u het niveau van cellyse kunt bepalen door middel van LDH-afgiftemetingen.

Deze procedure kan worden aangepast voor het gebruik van andere inflammasoomstimuli of interventies die de activering van inflammasomen of pyroptose veranderen.