Preparaten en protocollen voor de hele cel Patch klem opname van Xenopus laevis Tectal neuronen
15 maart 2018
In dit artikel bespreken we drie hersenen preparaten die worden gebruikt voor het opnemen van de klem van het flard van hele cel om te studeren het retinotectal circuit van Xenopus laevis kikkervisjes. Elk preparaat, met zijn eigen specifieke voordelen, draagt bij aan de experimentele werkwillig van de Xenopus tadpole als een model om te studeren van neurale functie.
Het algemene doel van deze procedure is om elektrofysiologische opnames van hele cellen te verkrijgen van neuronen van het optische tectum van de kikkervis in om hun verbindingspatroon tijdens de ontwikkeling te leren en uiteindelijk te begrijpen hoe neurale circuits zich vormen en functioneren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in het veld van neurale ontwikkeling, zoals hoe neuronen veranderen in de loop van de ontwikkeling en hoe circuits functioneren om gedrag te veroorzaken. Het belangrijkste voordeel van deze preparaten is dat ze de elektrofysiologische registratie van optische tectum-neuronen mogelijk maken om inzicht te geven in de functie van de zich ontwikkelende neurale circuits.
Zhenyu Lui, een afgestudeerde student in mijn lab, zal de procedure demonstreren. Gebruik een wegwerp-overdrachtspijp om de verdoofde kikkervis naar een dissectie-opnamebak met externe opnameoplossing te verplaatsen. Zet de verdoofde kikkervis vast aan een ondergedompelde siliconen blok op de bodem van de dissectie-opnamebak.
Voor een duidelijk zicht op de hersenen, verwijder de huid boven de hersenen door een oppervlakkige incisie langs de middenlijn te maken met een steriele 25 gauge naald. Haal het brein langs dezelfde middenlijn uit door de naald in de neurale buis in te brengen en voorzichtig omhoog te trekken zodat het dorsale gedeelte van de buis netjes wordt doorgesneden terwijl de bodemplaat intact blijft. Om de hersenen te isoleren, gebruik eerst een 25 gauge naald om de achterhersenen door te snijden.
Voer vervolgens de naald voorzichtig onder de hersenen in een caudale naar rostrale richting om alle laterale en ventrale bindweefsel en zenuwvezels door te snijden. Bevestig vervolgens de hersenen aan een blok siliconen elastomeer door een pin door een van de reukbollen te plaatsen en een andere pin door de achterhersenen. Dit is de optimale configuratie voor opname van tectale neuronen.
Verplaats vervolgens de bak met de vastgespijkerde hele hersenen voorbereiding van de dissectiescoop naar de elektrofysiologie rig. Verwijder het ventrikelmembraan met behulp van een gebroken glazen pijpje. Om de RGC-axonen direct te activeren, laat een bipolaire stimulerende elektrode voorzichtig op het optische chiasma zakken zodat een kleine deuk in het weefsel wordt gevormd.
De bipolaire stimulerende elektrode moet rostrale en bijna grenzend zijn aan het grote middelste ventrikel waar het optische chiasma zich bevindt. De bipolaire elektrode wordt aangedreven door een pulsstimulator die de sterkte van de stimulatie nauwkeurig kan regelen. Om de horizontale hersensnede voor te bereiden, begin met de hele hersenen voorbereiding.
Gebruik vervolgens een scheermes om het meest laterale vierde deel van één kant van één optisch tectum te verwijderen. Deze snede wordt parallel aan het rostrale caudale vlak gemaakt. Herpin het brein vervolgens aan de zijkant van de siliconen elastomeer met de gesneden kant omhoog zodat de somata en neuropil direct toegankelijk zijn voor opname en de ventrikeloppervlakte van de hersenen weg van de siliconen elastomeerblok is gericht zodat een bipolaire elektrode op het optische chiasma kan worden geplaatst.
Voer vervolgens de gehele cel patch clamp of lokale veldpotentiaal opname uit. Hier is het schema dat de configuratie van een horizontale hersensnede voorbereiding toont. Merk op dat hoewel de stimulerende elektrode op het optische chiasma blijft, de opnamepijp nu is gepositioneerd om toegang te krijgen tot cellen in alle tectale lagen die worden blootgesteld door de horizontale hersensnede voorbereiding.
Dit is een RGC-geïnduceerde respons van een neuron dat zich in de oppervlakkige laag van het tectum bevindt. In deze figuur worden de opgenomen veldpotentiaal over het neuropil en de omgezette stroombrondichtheden getoond door een beeldplot. Eenmaal beheerst, kan deze techniek binnen 10 minuten worden uitgevoerd en zal deze meestal tot drie of vier uur duren.
Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een hele hersenen en horizontale hersensnede voorbereiding uitvoert voor hele cel opnames om de elektrische eigenschappen van de tectale neuronen en hun connectiviteit te kwantificeren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt whole-cell patchclamp-registratietechnieken om het retinotectale circuit in Xenopus laevis-kikkervisjes te bestuderen. Door gebruik te maken van verschillende hersenpreparaten streeft het onderzoek ernaar de connectiviteitspatronen van neuronen in het opticum van de kikkervisjes tijdens de ontwikkeling en de algemene functie van neurale circuits te begrijpen.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Elektrofysiologie
- Neurale schakelingen
Achtergrond
- Onderzoek naar hoe neurale circuits worden gevormd en functioneren in ontwikkelende organismen.
- Het retinotectale circuit is essentieel voor de visuele verwerking bij amfibieën.
- Xenopus laevis-kikkervisjes dienen als een waardevol model voor het bestuderen van neurale connectiviteit.
- Whole-cell registraties bieden gedetailleerde inzichten in de neuronale activiteit.
Doel van de studie
- Om de connectiviteitspatronen tussen neuronen in het opticum tectum te begrijpen.
- Om te analyseren hoe neuronen veranderen tijdens de ontwikkeling.
- Om te onderzoeken hoe neurale circuits bijdragen aan het gedrag.
Gebruikte methoden
- Voor de elektrofysiologische registraties werden whole-cell patchclamp-methoden gebruikt.
- Het biologische model bestond uit gedissekeerde breinen van kikkervisjes om neuronen in het opticum tectum te bestuderen.
- Er werden geen multi-omics-workflows vermeld.
- Specifieke stappen omvatten het immobiliseren van het kikkervisje, het isoleren van het brein en het uitvoeren van gerichte registraties.
- De methoden maken registratie mogelijk binnen een kritieke tijdspanne van 10 minuten, waarbij de totale duur gewoonlijk enkele uren bedraagt.
Belangrijkste resultaten
- De preparaten maakten een succesvolle registratie van de neuronale activiteit in het tectum mogelijk.
- Er werden elektrofysiologische veranderingen waargenomen die duiden op neurale connectiviteit.
- De resultaten leidden tot discussies over de functionele implicaties van het retinotectale circuit.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de ontwikkeling van neurale circuits.
Conclusies
- Dit onderzoek demonstreert effectieve methoden voor het bestuderen van neurale connectiviteit in ontwikkelende breinen van kikkervisjes.
- De studie vergroot het begrip van de functie van neurale circuits tijdens de ontwikkeling.
- De resultaten hebben bredere implicaties voor het onderzoeken van neurologische processen en gedragingen bij amfibieën.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Whole cell patch clamp-registratie in Xenopus laevis-kikkervisjes maakt hoogresolutie-onderzoek naar de vorming en functie van neurale circuits mogelijk, wat mechanistische inzichten biedt in de synaptische connectiviteit en neurale exciteerbaarheid tijdens de ontwikkeling. Deze benadering ondersteunt target-validatie in de neurowetenschappen door directe meting van neurale responsen op gedefinieerde stimuli mogelijk te maken, zoals door retinale ganglioncellen opgewekte activiteit in het opticum. De aanpasbaarheid van de methode voor in vivo, whole brain en horizontale slice-preparaten verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid voor preklinische risicoreductie van neurodevelopmentale targets.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door neuronale reacties op sensorische input te kwantificeren, waardoor de functionele connectiviteit in ontwikkelende circuits wordt verduidelijkt.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie via directe elektrofysiologische read-outs van neuronale activiteit, waardoor ambiguïteit bij target-engagement wordt verminderd.
- Voorspellende waarde: Faciliteert portfolio-triage door genetische of farmacologische perturbaties te koppelen aan meetbare veranderingen in de exciteerbaarheid en synaptische integratie van tectale neuronen.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream compound-screening door stabiele, registreerbare neuronale preparaten vast te stellen met gedefinieerde stimulus-responseigenschappen.
- Kwantitatieve output: Genereert elektrofysiologische metingen, zoals postsynaptische stromen en veldpotentialen, waardoor dosis-responsanalyse en kwantificering van compound-effecten mogelijk zijn.
- Herbruikbaarheid van het platform: De preparatie van horizontale brenhuisjes maakt registratie in alle tectale lagen mogelijk, wat de doorvoer en consistentie voor herhaalde experimentele sessies verhoogt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Modelleert neurodevelopmentele processen die relevant zijn voor stoornissen met foutieve versnijding van neurale circuits, wat de exploratie van translationele biomarkers ondersteunt.
- Preklinische continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekking en validatie door consistente registratie van de neuronale functie over verschillende ontwikkelingsmomenten mogelijk te maken.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Ondersteunt go/no-go-criteria op basis van elektrofysiologische fenotypes, waardoor het risico op falen in een late fase van neurodevelopmentale programma's wordt verminderd.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De methode wordt geïntegreerd in vroege discovery-workflows door functionele validatie van neuronale targets te bieden voorafgaand aan de lead-optimalisatie, waarbij de resultaten zowel de targetselectie als het mechanistische begrip informeren.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten en de verduidelijking van signaalpaden door het registreren van opgewekte responsen van tectale neuronen na stimulatie van axonen van retinale ganglioncellen.
- Screening: Maakt standaardisatie van assays mogelijk via reproduceerbare preparaten van de gehele hersenen en hersensnijden, wat resulteert in kwantificeerbare elektrofysiologische readouts voor het screenen van verbindingen.
- Analytics: Levert kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen, zoals stroomamplituden en latentie, wat vergelijkingen tussen experimentele condities faciliteert.
- Translationeel Onderzoek: Legt een verband met preklinische validiteit door ziekterelevante circuiteigenschappen in verschillende preparaten te behouden, wat de afstemming van biomarkers ondersteunt.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar elektrofysiologisch platform dat aanpasbaar is aan meerdere experimentele contexten, waardoor redundante methodeontwikkeling wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit te verminderen via directe neuronale registratie.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie tussen laboratoria via gedefinieerde preparatieprotocollen voor in vivo, whole brain en slice-methoden.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege detectie van ineffectieve verbindingen mogelijk te maken, waardoor investeringen in niet-levensvatbare targets worden verminderd.
- Impact op portfolio: Informeert risicogebaseerde beslissingen over verdere ontwikkeling door elektrofysiologische resultaten te koppelen aan circuitfuncties.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in elektrofysiologie en microsurgische dissectietechnieken voor een consistente hersenpreparatie.
- Afhankelijk van stabiele extracellulaire registratie-oplossingen en functionele stimulatieapparatuur voor betrouwbare opgewekte responsen.
- Vereist standaardisatie van stimulusparameters en registratie-instellingen tussen teams om de vergelijkbaarheid van gegevens te garanderen.
- Aanpassing aan verschillende modelsystemen kan aanpassingen in de dissectie- en platingmethoden vereisen, afhankelijk van de hersengrootte en toegankelijkheid.
- Praktische beperkingen omvatten operator-afhankelijke succespercentages en de stabiliteit van de preparatie tijdens langere registratiesessies.
