Name: De vaststelling van specificiteit uit Protease in muis weefsel extracten met behulp van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF: manipuleren van de PH veroorzaken specificiteit wijzigingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Leer protease-specificiteit bepalen in ruwe muizeweefselextracten met MALDI-TOF massaspectrometrie. Deze methode analyseert meerdere monsters tegelijk en biedt inzicht in protease-activiteit bij verschillende pH-waarden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Nihon farmaceutische Universiteit onderzoek subsidie van Nihon farmaceutische Universiteit (2016) en de MEXT KAKENHI Grant nummer JP17854179.

Dierlijke experimentele protocollen werden goedgekeurd door de Nihon farmaceutische Universiteit de ethische Commissie en uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de Nihon farmaceutische Universiteit. Het protocol is aangepast voor weefsel extracten afgeleid van ICR muizen. ICR muizen werden gekocht van Nippon SLC Ltd. (Shizuoka, Japan)
1. bereiding van het substraat Iminobiotin-label
Het substraat ondergaat solid-phase-synthese 9-fluorenylmethyloxycarbonyl groep (Fmoc)-beschermd aminozuren zoals hieronder11beschreven. Tabel 2 gebruiken om te bepalen van de Fmoc-verbinding gebruikt, afhankelijk van de gewenste aminozuur en fase van synthese.
<ol><li>Swill 0.2 g Fmoc-NH-SAL hars met 10 mL N, N-dimethylformamide (DMF) in een synthese-kolom.</li>
	<li>Voeg 5 mL van 30% piperidine in DMF. Rock de oplossing voor 10 min te klieven van de Fmoc-groep.</li>
	<li>
Controleer Fmoc met het trinitrobenzenesulfonic zuur (TNBS) splijten test12: Voeg 10 µL van 1% TNBS in DMF en 10 µL van diisopropylethylamine (DIPEA) naar een 10 x 75 mm2 glazen buis en een kleine hoeveelheid hars overdracht aan het glas tube. De Fmoc-gekloofd hars moet ontwikkelen een oranje kleur.
	<ol>
<li>Herhaal stap 1.2-1.3 als dit resultaat negatief is.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wassen van de hars driemaal met 5 mL DMF.</li>
	<li>
Voeg toe 5 mL DMF met 0.3 mmol van de Fmoc-samengestelde vermeld in tabel 2 (te beginnen met de stof gebruikt in fase 1), 0.3 mmol van O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorfosfaat (HCTU), 0.3 mmol van 1- Hydroxy-1H-benzotriazole monohydraat (HOBt) en 0,6 mmol van diisopropylethylamine (DIPEA). De oplossing voor 30 min aan het echtpaar met de hars rock.
	<ol>
<li>Controleer deze stap met de TNBS test. Als het resultaat positief is, betekent dit de reactie niet voldoende vooruitgang geboekt en deze stap moet worden herhaald.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wassen van de hars driemaal met 5 mL DMF.</li>
	<li>Herhaal de rek reactie door stappen te herhalen 1.2-1.6, wijzigen van de Fmoc-compound gebruikt in stap 1.5 volgens tabel 2.</li>
	<li>Voeg 1 mL 2,5% water, 1% triisopropylsilane (TIS), en 2,5% ethanedithiol (EDT) in trifluorazijnzuur te klieven van peptiden uit de groepen hars en bescherming. Rock de oplossing voor 60 min.</li>
	<li>Filteren, en Vang filtraat op in een 50 mL-buis.</li>
	<li>Voeg 40 mL koude diethyl ethanol en winkel 's nachts bij-20 ° C.</li>
	<li>Centrifuge 4000 x g bij-20 ° C gedurende 30 minuten verzamelen de pellet.</li>
	<li>Gebruik een exsiccator gedurende 3 uur te verwijderen van de diethylether.</li>
	<li>Voeg 1 mL acetonitril 50% aan water en los van de ruwe peptiden. Lyophilize de oplossing Schakel trifluorazijnzuur. Herhaal deze stap meerdere keren.</li>
	<li>
Zuiveren de peptiden een C18 cartridge kolom gebruiken.
	<ol>
<li>Activeer de hars in de C18 cartridge kolom met behulp van 3 mL acetonitril (ACN).</li>
		<li>Equilibreer met 5 mL 5% ACN, 0,1% TFA in H2O.</li>
		<li>De ruwe synthetische peptiden in de kolom C18 cartridge laden.</li>
		<li>Wassen met 10 mL 5% ACN, 0,1% TFA in H2O.</li>
		<li>Elueer de monsters met 3 mL 60% ACN, 0,1% TFA in H2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Controleer de peptiden door het meten van hun molecuulgewicht met behulp van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF.
	<ol>
<li>Pipetteer 1 µL van eluens op een doel-plaat. Onmiddellijk toevoegen verzadigde α-cyano-4-hydroxycinnamic zuur (CHCA) oplossing in 50% acetonitril in 0,1% trifluorazijnzuur</li>
		<li>Kristalliseren het mengsel door droging.</li>
		<li>Verwerven van massaspectra van monsters volgens protocol van de fabrikant van het instrument.<ol>
<li>Handmatig in te stellen de MALDI-TOF massa spectrometer op een positieve wijze weerspiegelen.</li>
			<li>Kalibreren van de massaspectrometer met behulp van CHCA, bradykinine fragment 1-7 (exacte moleculaire gewicht = 756.3997 Da), en angiotensine II (exacte moleculaire gewicht = 1,045.5423 Da).</li>
			<li>Verwerven van de massaspectra van synthetische peptides, en dan beoordelen door het te vergelijken met de theoretische molecuulgewicht.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. bereiding van extracten van weefsel
<ol><li>Anesthetize mannelijke ICR muizen in een zaal van Isofluraan inademing en controleer of anesthesie diepte via teen snuifje. De muizen door cervicale dislocatie euthanaseren.</li>
	<li>Met behulp van schaar, maken een middellijn abdominale incisie via de huid uit te breiden tot de xiphoid process.</li>
	<li>Het middenrif doorsnijden en het verzamelen van alle longweefsel. Het weefsel wordt in kleine stukjes gesneden.</li>
	<li>Het wassen van het weefsel driemaal met ijskoude 50 mM Tris-gebufferde zoutoplossing (pH 7.4).</li>
	<li>Weeg de weefsels en de overdracht ongeveer 100 mg van weefsels aan een 12 x 75 mm2 glazen buis.</li>
	<li>Voeg 0.3 mL van de extractie-buffer (50 mM Tris-buffer, pH 7.4, met 0,1% poly (oxyethylene) octylphenyl ether).</li>
	<li>
Meng het Long weefselmonsters met behulp van een mengen homogenizer.
	<ol>
<li>Koel de monsters op ijs.</li>
		<li>Meng de monsters op 20.000 rpm voor 30 s in een blender. Herhaal deze stap totdat de monsters volledig homogeen zijn. Opmerking: Het niet meng gedurende meer dan 1 minuut continu, om te voorkomen dat een stijging van de temperatuur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.000 µL van het homogenaat overbrengen in een tube 1,5 mL en Centrifugeer gedurende 5 min bij 10.000 x g bij 4 ° C.</li>
	<li>500 µL van het supernatans overbrengen in een nieuwe 1,5 mL plastic buis.</li>
	<li>Gebruik 10 µL van het monster te bepalen eiwitconcentratie, met methoden, zoals de bicinchoninic zuur (BCA) of de methode Coomassie briljant blauw (CBB).</li>
	<li>Om te voorkomen dat bevriezing, 80% glycerol aan de monsters voor een eindconcentratie van 50% glycerol te toevoegen.</li>
	<li>Het bewaren van de monsters bij-80 ° C tot verder gebruik.</li>
</ol>3. vertering van substraten in Model Protease en weefsel extracten
<ol><li>
Voeg 10 µL van 0,1 µg/µL van N-tosyl-L-fenylalanine chloormethyl keton (TPCK)-trypsine, 0,1 µg/µL van Staphylococcus aureus V8 protease of 10 µg/µL van weefsel extracten in 890 µL van een buffer van de spijsvertering.
	<ol>
<li>Gebruiken om te verduidelijken het verschil in protease specificiteit afhankelijk van de pH, buffers aangepast aan de pH 3, 5, 7 en 9. De samenstelling van de spijsvertering-buffer wordt weergegeven in tabel 3.</li>
		<li>Verrichten van een negatieve controle met behulp van inactieve protease in weefsel extracten, bereid door incubatie in kokend water (of verwarming bij 100 ° C) gedurende 10 minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg 10 µL van iminobiotin-label substraten (ontbonden in dimethylsulfoxide (DMSO), eindconcentratie = 100 pmol/10 µL).</li>
	<li>Incubeer gedurende 3 uur bij 37 ° C te verteren iminobiotin-geëtiketteerden substraten.</li>
	<li>Na incubatie, stoppen met de vertering van substraten met kokend water (of door verwarming bij 100 ° C) gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Centrifugeer het verteerd substraten voor 5 min bij 10.000 x g bij 4 ° C.</li>
	<li>Breng de bovendrijvende substantie in een nieuwe 1,5 mL-buis.</li>
</ol>4. zuivering van het Iminobiotin-label substraat
<ol><li>
Voeg 50 µL van 50% streptavidine sepharose kralen in 1 M Tris-buffer (pH 9) met 0,1% poly(oxyethyleen) octylphenyl ether.
	<ol>
<li>PH test papier gebruiken om ervoor te zorgen dat de oplossing ongeveer pH 9 is. Als de pH van de oplossing laag is, deze aanpassen aan ongeveer pH 9 door toevoeging van 1 M Tris-buffer (pH 9) met 0,1% poly(oxyethyleen) octylphenyl ether. Deze stap is belangrijk, als het gaat om de binding van het iminobiotin-label substraat naar daar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Na een nacht bebroeden bij 4 ° C met continue Zacht mengen op een rotator wiel de iminobiotin-geëtiketteerden substraten binden aan de streptavidine. De kralen moeten blijven geschorst tijdens de incubatie.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 10.000 x g bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.</li>
	<li>
Wassen de kralen vijfmaal als volgt:
	<ol>
<li>Voeg 1.000 µL van een wash-buffer (50 mM Tris-buffer, pH 9) aan de kralen.</li>
		<li>Wassen gedurende 10 minuten bij 4 ° C met continue Zacht mengen op een rotator-wiel. De kralen moeten blijven geschorst tijdens de incubatie.</li>
		<li>Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 10.000 x g bij 4 ° C en verwijder de bovendrijvende substantie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voeg 100 µL van 0,2% trifluorazijnzuur aan de kralen.
	<ol>
<li>PH test papier gebruiken om ervoor te zorgen dat de oplossing lager dan pH 2 is. Als de pH van de oplossing hoog is, breng de pH op hieronder 2 door toevoeging van 1% trifluorazijnzuur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met continue Zacht mengen op een rotator-wiel.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 10.000 x g bij 4 ° C, dan het supernatans naar een nieuwe 1,5 mL-buis.</li>
</ol>5. voorbereiding en Laser Matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie Time-of-Flight massaspectrometrie (MALDI-TOF massa spectrometrie) proeven
Opmerking: Alle oplossingen in de volgende stappen moeten worden bereid met hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC)-rang of aminozuur sequencing-grade water.
<ol><li>Pipetteer 500 µL van acetonitril op een C18-hars om het te activeren. Verwijder de gebruikte acetonitril. Herhaal deze stap drie keer.</li>
	<li>Equilibreer de C18-hars met 100 µL van 0,1% trifluorazijnzuur. Verwijder de elutievloeistof. Herhaal deze stap drie keer.</li>
	<li>Voor het laden van de monsters, de monsters aan de hars met behulp van een precisiepipet te binden.</li>
	<li>Wassen van de hars met 20 µL van 0,1% trifluorazijnzuur. Herhaal deze stap vijf keer.</li>
	<li>Elueer de monsters met 3 µL van 60% acetonitril in 0,1% trifluorazijnzuur. Pipetteer het eluent op een doel-plaat voor MALDI-TOF massa spectrometrie. Onmiddellijk vergroten met verzadigde α-cyano-4-hydroxycinnamic zuur (CHCA) oplossing in 50% acetonitril in 0,1% trifluorazijnzuur.</li>
	<li>Kristalliseren het mengsel door droging.</li>
	<li>
Verwerven van massaspectra van monsters volgens protocol van de fabrikant van het instrument.
	<ol>
<li>Handmatig in te stellen de MALDI-TOF massa spectrometer op een positieve wijze weerspiegelen.</li>
		<li>Kalibreren van de massaspectrometer met behulp van CHCA, bradykinine fragment 1-7 (exacte moleculaire gewicht = 756.3997 Da), en angiotensine II (exacte moleculaire gewicht = 1,045.5423 Da).</li>
		<li>Het verwerven van de massaspectra van monsters, veel aandacht aan de massaspectra van 700 tot 900 Da voor het gekloofd formulier van de substraten Biotine-label.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het identificeren van de gedetecteerde pieken met behulp van tabel 1. Opsporing van de desbetreffende moleculair gewicht geeft aan decollete in de C-terminus van de relevante aminozuur.</li>
</ol>

<ol><li>Neurath, H., Walsh, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+proteolytic+enzymes+in+biological+regulation+%28a+review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).</li>
<li>Surinov, B. P., Manoilov, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+activity+of+proteolytic+enzymes+by+means+of+azocasein%5BTitle%5D)+AND+%22Vopr+Med+Khim%22%5BJournal%5D)">Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein.</a> Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).</li>
<li>Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection+of+casein+zymography+of+matrix+metalloproteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases.</a> Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).</li>
<li>Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preparation+and+properties+of+two+new+chromogenic+substrates+of+trypsin%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin.</a> Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).</li>
<li>Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+photometric+or+fluorometric+assay+of+proteinases+using+substrates+containing+7-amino-4-trifluoromethylcoumarin%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin.</a> Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).</li>
<li>Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescende+determination+of+carboxypeptidase+A+activity+based+on+electronic+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer.</a> Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).</li>
<li>Timmer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+constitutive+proteolytic+events+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Profiling constitutive proteolytic events in vivo.</a> Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).</li>
<li>Biniossek, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protease+specificity+by+combining+proteome-derived+peptide+libraries+and+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).</li>
<li>Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protease+specificity+using+biotin-labeled+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates.</a> Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).</li>
<li>Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iminobiotin+affinity+columns+and+their+application+to+retrieval+of+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).</li>
<li>Merrifield, R. B. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja00897a025">Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide.</a> J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).</li>
<li>Hancock, W. S., Battersby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+micro-test+for+the+detection+of+incomplete+coupling+reactions+in+solid-phase+peptide+synthesis+using+2%2C4%2C6-trinitrobenzenesulphonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid.</a> Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).</li>
<li>Marttila, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+NeutraLite+avidin%3A+A+non-glycosylated%2C+acidic+mutant+of+chicken+avidin+that+exhibits+high+affinity+for+biotin+and+low+non-specific+binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties.</a> FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).</li>
<li>Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+human+liver+propionyl-CoA+carboxylase+by+carbon+tetrachloride+extraction+and+monomeric+avidin+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography.</a> Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dit protocol gebruikt van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF om te identificeren protease specificiteit in ruwe monsters afgeleid van extracten van weefsel en gemakkelijk voor meerdere monster verwerking kan worden opgeschaald. In het bijzonder, we gemanipuleerd pH om te veroorzaken een verandering in de specificiteit van het substraat.
De avidin-Biotine complexe (ABC) methode, die wijd verbeid in de biochemie vanwege haar bindende specificiteit gebruikt is, werd gebruikt in ons pr...

Proteasen reguleren fysiologische processen door het splijten van eiwitten, en de inleiding van protease-activiteit op bepaalde tijdstippen en locaties is gereglementeerde1. Het is daarom belangrijk om te identificeren van de expressie en de activiteit van weefsels die lokaal worden geregeld, en een nieuwe methode voor het detecteren van proteasen te ontwikkelen. De methode voorgesteld deze studie wil identificeren protease specificiteit parallel aan het opsporen van proteasen.
Er zijn enkele methoden voor het opsporen van protease specificiteit. De azocasein methode is bekend om het gebruik ervan in de opsporing van proteasen2 maar is beperkt in zijn vermogen om verdere informatie te verkrijgen. Zymography is een andere uitgebreide protease-detectiemethode die kan worden gebruikt om te bepalen van het molecuulgewicht van proteasen3, maar het kan niet worden gebruikt voor het onderzoeken van substraat specificiteit. Protease specificiteit kan worden bepaald door spectrometrische assays, gebruik van substraten zoals p-nitroanilide4, en fluorimetrische vitrotests, met behulp van cumarine substraten5 of fluorescentie Resonance Energy Transfer (FRET) testen6. Deze methoden inschakelen single-specificiteit detectie van substraten die zijn opgenomen in een enkele goed. In de huidige studie, wordt de protease-specificiteit van extracten van weefsel onderzocht onder verschillende omstandigheden, zoals deze extracten meerdere proteasen bevatten. Protease-activiteit wordt geregeld door verschillende factoren, inclusief pH, coënzymen en prosthetic groepen ion sterkte. Onlangs, proteomics gebaseerde methoden zijn gebruikt voor het identificeren van protease specificiteit; bijvoorbeeld de methode gerapporteerd door Biniossek et al. 7 de Proteoom gebruikt om te bepalen van substraat specificiteit zelfs in grove extracten en nauwkeurige bepaling van de activiteit van de splitsing van proteasen die meerdere aminozuur sequenties8 herkentstaat. Deze methode is echter niet geschikt voor de analyse van de talloze voorbeelden. Daarentegen onze methode maakt de gelijktijdige verwerking van meerdere monsters, en het gebruik van de Matrix-Assisted Laser desorptie/ionisatie Time-of-Flight (MALDI-TOF) massaspectrometrie voor analyse van monster vergemakkelijkt een snelle en gemakkelijke opsporing van de gekloofd substraten.
Dit document schetst een methode om te evalueren van protease specificiteit met behulp van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF voor het meten van het molecuulgewicht van unieke substraten. De moleculaire vormen van gekloofd substraten, samen met hun theoretische molecuulgewichten, worden weergegeven in Figuur 1 en tabel 1. Eerdere studies hebben gebruik gemaakt van substraten met polyglycine spacers en biotine9; echter zijn deze substraten gebrekkig omdat de volgorde van de polyglycine kan worden cleaved door enzymen die de glycine-volgorde herkent. Daarnaast is de hoge affiniteit tussen avidin en biotine kan leiden tot een lage opbrengst. Om op deze nadelen, in deze studie we gesynthetiseerd een uniek substraat, die bestond van polyethyleenglycol (PEG), iminobiotin en een aminozuur dat de breukzijde (Figuur 1 identificeren kon). Om te discrimineren tussen aminozuren gelijkaardige molecuulgewichten, werd D-serine toegevoegd tussen de pin spacer en het aminozuur op de gekloofd site.
De N-terminal van het substraat werd aangeduid met iminobiotin, waarmee de zuivering van de affiniteit van ruwe monsters. Het gebruik van iminobiotin in plaats van Biotine is van cruciaal belang; Biotine heeft een sterke affiniteit met avidin, wat in terugwinning van de lage tarieven van biotine-geëtiketteerden substraten uit avidin hars, resulteert terwijl iminobiotin de affiniteit voor avidin kan worden gewijzigd door pH. Iminobiotin-geëtiketteerden substraten zal binden aan de avidin in omstandigheden boven pH 9, terwijl avidin releases iminobiotin-geëtiketteerden substraten in voorwaarden hieronder pH 4. Daarom werd iminobiotin gebruikt voor affiniteit zuivering10. In samenvatting beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het opsporen van protease specificiteit met behulp van unieke substraten.

<table><tbody><tr><td>Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyfenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl) aminomethyl]fenoxyhars)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00102</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimethylformamide (DMF)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00185</td><td></td></tr><tr><td>piperidine</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00176</td><td></td></tr><tr><td>trinitrobenzeensulfonzuur (TNBS)</td><td>WAKO Chemical</td><td>209-1483</td><td></td></tr><tr><td>O-(6-Chloor-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorofosfaat (HCTU)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00067</td><td></td></tr><tr><td>1-Hydroxy-1H-benzotriazool,monohydraat (HOBt)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00014</td><td></td></tr><tr><td>diisopropylethylamine (DIPEA)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00030</td><td></td></tr><tr><td>triisopropylsilaan (TIS)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00170</td><td></td></tr><tr><td>ethaandithiol (EDT)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00057</td><td></td></tr><tr><td>trifluorazijnzuur (TFA)</td><td>Millipore</td><td>S6612278 403</td><td></td></tr><tr><td>acetonitril</td><td>Kokusan Chemical</td><td>2153025</td><td></td></tr><tr><td>C18 cartridgekolom</td><td>Waters</td><td>WAT051910</td><td></td></tr><tr><td>poly(oxyethyleen) octylfenyleether</td><td>WAKO Chemical</td><td>168-11805</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>menghomogenisator</td><td>Kinematica</td><td>PT3100</td><td>polytron homogenisator</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250</td><td>Nakarai Chemical</td><td>094-09</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Nakarai Chemical</td><td>170-18</td><td></td></tr><tr><td>N-tosyl-L-fenylalanine chloormetketon (TPCK)-trypsine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>WAKO Chemical</td><td>043-07216</td><td></td></tr><tr><td>streptavidine sefarose</td><td>GE Healthcare</td><td>17-511-01</td><td></td></tr><tr><td>ZipTipC18</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-cyano-4-hydroxycinnaminezuur (CHCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2020</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF massaspectrometrie</td><td>Bruker Daltonics, Duitsland</td><td>autoflex</td><td></td></tr><tr><td>2-iminobiotine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4632</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-aminozuren</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

de vaststelling van specificiteit uit protease in muis weefsel extracten met behulp van de spectrometrie van de massa van de maldi-tof: manipuleren van de ph veroorzaken specificiteit wijzigingen

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Proteasen zijn verschillende biologische functies, met inbegrip van eiwit activeren/inactiveren en voedsel spijsvertering. Identificeren van protease specificiteit is belangrijk voor het openbaren van protease-functie. De methode voorgesteld in deze studie bepaalt protease specificiteit door het meten van het molecuulgewicht van unieke substraten met behulp van de Matrix-bijgewoonde Laser desorptie/ionisatie massaspectrometrie Time-of-Flight (MALDI-TOF). De substraten bevatten iminobiotin, terwijl de gekloofd site uit aminozuren bestaat en de spacer uit polyethyleen glycol bestaat. Het gekloofd substraat genereert een unieke molecuulgewicht met behulp van een gekloofd aminozuur. Een van de verdiensten van deze methode is dat het kan worden uitgevoerd in een pot met behulp van de ruwe monsters, en het is ook geschikt voor de beoordeling van meerdere monsters. In dit artikel beschrijven we een eenvoudige experimentele methode geoptimaliseerd met monsters muis longweefsel, met inbegrip van weefsel extractie, plaatsing van spijsvertering substraten in monsters, zuivering van spijsvertering substraten onder verschillende pH-omstandigheden is onttrokken. , en de meting van de substraten molecuulgewicht met behulp van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF. Kortom, deze techniek maakt het mogelijk voor de identificatie van protease specificiteit in ruwe monsters afgeleid van extracten van weefsel met behulp van MALDI-TOF massa spectrometrie, die gemakkelijk kan worden opgeschaald voor meerdere monster verwerking.

Evaluatie van de methode voor de identificatie van protease specificiteit door model protease
De efficiëntie van dit systeem werd geëvalueerd aan de hand van TPCK-trypsine en V8 protease, waarvan substraat specifieke kenmerken werden verkregen. TPCK-trypsine en V8 protease werden geschat op het klieven van het aminozuur-reeks in de C-terminal van de lysine en arginine residuen, en aan de zijkant van de carboxy het asparaginezuur en...

Hier presenteren we een protocol bij het bepalen van protease specificiteit in ruwe muis weefsel extracten met behulp van spectrometrie van de MALDI-TOF.

De vaststelling van specificiteit uit Protease in muis weefsel extracten met behulp van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF: manipuleren van de PH veroorzaken specificiteit wijzigingen

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Het algemene doel van dit experiment is om de proteasespecificiteit in meerdere ruwe extracten te bepalen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden om de proteasespecificiteit te bepalen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de proteasespecificiteit van meerdere monsters kan identificeren in één keer.Koel longweefselmonsters verkregen van mannelijke ICR-muizen op ijs. Homogeniseer de monsters gedurende 30 seconden bij 20.000 RMP in een blender. Herhaal deze stap totdat de monsters volledig homogeen zijn.Homogeniseer niet langer dan één minuut continu om een temperaatstijging te voorkomen. Breng 1.000 microliter van het homogenaat over naar een 1,5 milliliter buis en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 10.000 keer G bij vier graden Celsius. Breng 500 microliter van de supernatant over naar een nieuwe 1,5 milliliter plastic buis.Gebruik 10 microliter van het monster om de eiwitconcentratie te bepalen. Gebruik hiervoor methoden zoals de bicinchoninic zuur assay of de Bradford assay. Om bevriezing te voorkomen, voeg 80% glycerol toe aan de monsters voor een eindconcentratie van 50% glycerol.Om het verschil in proteasespecificiteit afhankelijk van de

the-determination-protease-specificity-mouse-tissue-extracts-maldi

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Capture Verbindingen zijn trifunctionele kleine moleculen om de complexiteit van het proteoom te verminderen door functionele omkeerbare klein molecuul-eiwit interacties, gevolgd door foto-crosslinking en zuivering. Hier gebruiken we een Capture Compound...

Profilering van methyl-en andere S-Adenosyl- L-Homocysteine-bindende eiwitten door Capture Compound-massaspectrometrie (CCMS)

Stabiele Isotopen Normen en Capture door Anti-peptide antilichamen (SISCAPA) paren affiniteit verrijking van peptiden met stabiele isotoop verdunning massaspectrometrie (MRM-MS) voor kwantitatieve meting van peptiden te bieden als surrogaat voor hun respectievelijke eiwitten. Hier beschrijven we het protocol met behulp van magnetische deeltjes in een deels geautomatiseerde formaat.

Kwantificering van eiwitten met behulp van immuno-peptide Verrijking gekoppeld aan massaspectrometrie

Proteoom analyse van de cochleaire sensorische epitheel kan een uitdaging vanwege zijn kleine formaat en omdat membraaneiwitten zijn moeilijk te isoleren en te identificeren. Zowel membraan en oplosbare eiwitten kunnen worden geïdentificeerd door meerdere preparatieve methoden en scheidingstechnieken gecombineerd met hoge-resolutie massaspectrometrie.

Bottom-up en Shotgun Proteomics een uitgebreide Cochlear Proteome Identificeer

De alomtegenwoordige tweede boodschapper c-di-GMP controleert de groei en het gedrag van veel bacteriën. We hebben een nieuwe Capture Compound Mass Spectrometry-gebaseerde technologie ontwikkeld om c-di-GMP-bindende eiwitten biochemisch te identificeren en te karakteriseren in vrijwel elke bacteriesoort.

Capture Compound Massaspectrometrie - een krachtig hulpmiddel om het identificeren van nieuwe c-di-GMP effectoreiwitten

Peptidarrays gesynthetiseerd door de SPOT-methode kunnen worden gebruikt om de substraatspecificiteit van proteïne lysine methyltransferases (PKMTs) te analyseren en om het substraatspectrum van PKMTs te definiëren om hun biologische rol te begrijpen. Dit protocol beschrijft hoe peptidearrays te synthetiseren, ze te methyleren met PKMTs en de resultaten te analyseren.

Specificiteit analyse van eiwit-lysine methyltransferases Met behulp van SPOT Peptide Arrays

Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van Polysoom profilering op het hart van de geïsoleerde geperfundeerd muis. We worden methoden beschreven voor perfusie van het hart, Polysoom, profilering en analyse van de fracties van de Polysoom met betrekking tot mRNAs, miRNAs en de Polysoom Proteoom.

Dynamische Proteomic en miRNA analyse van Polysomes van geïsoleerde muis hart na Langendorff perfusie

We presenteren een methode voor de zuivering, detectie en identificatie van diGly peptiden die afkomstig zijn van ubiquitinated eiwitten uit complexe biologische monsters. De gepresenteerde methode is reproduceerbaar, robuust en presteert beter dan gepubliceerde methoden met betrekking tot het diepteniveau van de ubiquitinomenanalyse.

Detectie van eiwitubiquitinatiesites door peptideverrijking en massaspectrometrie

Deze workflow beschrijft de prestaties van tijd- en kostenefficiënte verrijking van meerdere eiwitposttranslationele modificaties (PTM's) tegelijkertijd voor kwantitatieve wereldwijde proteomische analyse. Het protocol maakt gebruik van peptide-niveau PTM verrijking met meerdere geconjugeerde antilichamen, gevolgd door data-onafhankelijke acquisitie massaspectrometrie analyse om biologische inzichten te krijgen in PTM crosstalk.

Gelijktijdige affiniteitsverrijking van twee posttranslationele wijzigingen voor kwantificering en sitelokalisatie

Hier presenteren we een protocol voor de verrijking van endogene fosfoproteïnefosfatasen en hun interagerende eiwitten uit cellen en weefsels en hun identificatie en kwantificering door op massaspectrometrie gebaseerde proteomica.

Een op massaspectrometrie gebaseerde benadering om fosfoproteïnefosfatasen en hun interactoren te identificeren

We presenteren een protocol voor het identificeren en kwantificeren van de componenten in mengsels van soorten met vergelijkbare eiwitten. Massaspectrometrie detecteert peptiden voor identificatie en geeft relatieve kwantificering door middel van piekoppervlakteratio's. Als hulpmiddel voor voedsel om fraude te detecteren, kan de methode 1% paard detecteren in rundvlees.

Soorten Bepaling en kwantificering in mengsels met behulp van MRM Massaspectrometrie van peptiden Applied to Meat Authentication

Leer protease-specificiteit bepalen in ruwe muizeweefselextracten met MALDI-TOF massaspectrometrie. Deze methode analyseert meerdere monsters tegelijk en biedt inzicht in protease-activiteit bij verschillende pH-waarden.

De vaststelling van specificiteit uit Protease in muis weefsel extracten met behulp van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF: manipuleren van de PH veroorzaken specificiteit wijzigingen (Video) | JoVE Journal

De vaststelling van specificiteit uit Protease in muis weefsel extracten met behulp van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF: manipuleren van de PH veroorzaken specificiteit wijzigingen

Meer video's verkennen