De vaststelling van specificiteit uit Protease in muis weefsel extracten met behulp van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF: manipuleren van de PH veroorzaken specificiteit wijzigingen

Het algemene doel van dit experiment is om de proteasespecificiteit in meerdere ruwe extracten te bepalen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden om de proteasespecificiteit te bepalen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de proteasespecificiteit van meerdere monsters kan identificeren in één keer.

Koel longweefselmonsters verkregen van mannelijke ICR-muizen op ijs. Homogeniseer de monsters gedurende 30 seconden bij 20.000 RMP in een blender. Herhaal deze stap totdat de monsters volledig homogeen zijn.

Homogeniseer niet langer dan één minuut continu om een temperaatstijging te voorkomen. Breng 1.000 microliter van het homogenaat over naar een 1,5 milliliter buis en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 10.000 keer G bij vier graden Celsius. Breng 500 microliter van de supernatant over naar een nieuwe 1,5 milliliter plastic buis.

Gebruik 10 microliter van het monster om de eiwitconcentratie te bepalen. Gebruik hiervoor methoden zoals de bicinchoninic zuur assay of de Bradford assay. Om bevriezing te voorkomen, voeg 80% glycerol toe aan de monsters voor een eindconcentratie van 50% glycerol.

Om het verschil in proteasespecificiteit afhankelijk van de pH te verduidelijken, gebruik verteringsbuffers aangepast naar pH drie, vijf, zeven en negen. Voeg in 890 microliter van een verteringsbuffer 10 microliter van 0,1 microgram per microliter of TPCK trypsine, 0,1 microgram per microliter van staphylococcus aureus V8 protease, of 10 microgram per microliter van weefselextracten toe. Bereid negatieve controles voor door de protease in weefselextracten te inactiveren door incubatie en kokend water gedurende 10 minuten.

Voeg vervolgens 10 microliter van MNO biotin label substraten toe aan de monsters en incubeer gedurende drie uur bij 37 graden Celsius om te verteren. Stop de vertering van substraten na incubatie met kokend water gedurende 10 minuten. Centrifugeer de verteerde substraten gedurende vijf minuten bij 10.000 keer G bij vier graden Celsius.

Breng het supernatant over naar een nieuwe 1,5 milliliter buis. Voeg 50 milliliter van 50% streptavidin sepharose bead toe in een eenmolaire tris buffer, bevattende 0,1% polyoxyethyleen octyl fenyl ether. Gebruik pH-testpapier om ervoor te zorgen dat de oplossing rond pH negen is.

Het is belangrijk om de juiste pH aan te passen naar negen of meer. Amino biotin kan een bead niet bijten tenzij het pH negen of hoger is. Als de pH van de oplossing laag is, pas deze dan aan naar ongeveer pH negen door meer buffer toe te voegen.

Bovendien kan een molaire tris buffer worden toegevoegd om de pH te verhogen indien nodig. Incubeer de suspensie een nacht bij vier graden Celsius met voortdurend zacht mengen op een roterende wiel om de MNO biotin gelabelde substraten aan de streptavidin te binden. De beads moeten tijdens de incubatie gesuspendeerd blijven.

Centrifugeer de volgende dag de monsters gedurende één minuut bij 10.000 keer G bij vier graden Celsius. Na het verwijderen van het supernatant, was de beads door 1.000 microliter van een wasbuffer toe te voegen. Incubeer vervolgens gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius met voortdurend zacht mengen op een roterende wiel.

Centrifugeer de beads gedurende één minuut bij 10.000 keer G bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant en herhaal deze wassing vier keer. Voeg vervolgens 100 microliter van 0,2% trifluorazijnzuur toe aan de beads.

Gebruik pH-testpapier om ervoor te zorgen dat de oplossing onder pH twee is. Als de pH van de oplossing hoog is, pas de pH dan aan naar onder twee door 1% trifluorazijnzuur toe te voegen. Incubeer de suspensie gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met voortdurend zacht mengen op een roterende wiel.

Na het centrifugeren van de beads zoals eerder, breng het supernatant over naar een nieuwe 1,5 milliliter buis. Pipetteer 20 microliter acetonitril op een C18-resin om deze te activeren. Verwijder het gebruikte acetonitril en herhaal deze activeringsstap drie keer.

Equillibreer vervolgens de C18-resin met 20 microliter van 0,1% trifluorazijnzuur. Verwijder het eluaat en herhaal deze gelijkmakingsstap drie keer. om de monsters te laden, bind ze aan de resin met behulp van een pipet.

Was de resin met 20 microliter van 0,1% trifluorazijnzuur. Herhaal deze stap vijf keer. Elueer de monsters met drie microliter van 60% acetonitril in 0,1% trifluorazijnzuur.

Pipetteer het eluaat op een doelplaat voor MALDI-TOF massa spectrometrie. Voeg onmiddellijk CHCA-oplossing toe, verzadigd in 50% acetonitril in 0,1% trifluorazijnzuur. Laat het mengsel kristalliseren door het aan de lucht te drogen.

Verzamel massaspectra van monsters, volgens het protocol van de instrumentfabrikant, met bijzondere aandacht voor de massaspectra van 700 tot 900 dalton voor de gesplitste vorm van de biotin labels substraten. Massaspectra van synthetische substraten worden hier getoond. Pieken die overeenkomen met het molecuulgewicht van de precursor werden gedetecteerd tussen 850 en 1.050.

De gesplitste fragmenten worden gedetecteerd in het bereik van 700 tot 850. Hier getoond zijn de spectra voor MNO biotin gelabelde substraten behandeld met TPCK trypsine. De pieken van 839,81 dalton en 796,76 dalton komen overeen met de fragmenten die zijn afgesplitst van het C-uiteinde van lysine en arginine respectievelijk.

Hier getoond zijn de massaspectra van synthetische substraten verteerd met V8 protease. De pieken van 769,78 dalton en 755,62 dalton komen overeen met de fragmenten die zijn afgesplitst van het C-uiteinde van glutaminezuur en asparaginezuur respectievelijk. De spectra voor MNO biotin labels substraten behandeld met een longweefselextract bij verschillende pH-condities worden hier getoond.

Bij zure omstandigheden, bij pH vijf, was het molecuulgewicht van een gesplitst fragment 770,13 dalton en 826,66 dalton, wat aangeeft dat splitsing plaatsvond bij het C-uiteinde van glutaminezuur en tryptofaan.