Evaluatie van het effect van eiwit aggregatie op cellulaire oxidatieve Stress in gist
23 juni 2018
Eiwit aggregatie lokt cellulaire oxidatieve stress. Dit protocol wordt een methode voor de controle van de intracellulaire toestanden van eiwitten van de amyloidogenic en de oxidatieve stress geassocieerd met hen, met behulp van stroom cytometry beschreven. De aanpak wordt gebruikt voor het bestuderen van het gedrag van oplosbare en aggregatie-naar voren gebogen varianten van de amyloid-β-peptide.
Het algemene doel van deze procedure is om de relatie te bepalen tussen de vorming van intracellulaire eiwitaggregaten en hun impact op cellulaire oxidatieve stress, met behulp van de bakkersgist Saccharomyces cerevisiae. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken op het gebied van eiwitmisvouwing en aggregatiesziekten, zoals neurodegeneratieve stoornissen en niet-neuropathiese amyloïdoses. Het grote voordeel van deze techniek is dat deze eenvoudig, snel is en het mogelijk maakt om de schade van oxidatieve stress in een grote gistpopulatie te kwantificeren.
Met deze methode kunnen we inzicht geven in de correlatie tussen de intracellulaire oplosbare of geaggregeerde toestand van een amyloïdogen eiwit en de oxidatieve stressniveaus in gist. Bovendien kan het ook worden toegepast op andere modelorganismen die recombinante eiwitten tot expressie brengen. De flowcytometrie analyse wordt gedemonstreerd door Manuela Costa, een technicus van de Flow Cytometry Facility aan de UAB.
In deze studie wordt de intracellulaire aggregatietoestand van verschillende A-beta-42 peptide varianten gevolgd met behulp van S.cerevisiae getransformeerd met een plasmide dat codeert voor A-beta-42 gefuseerd met GFP onder controle van een galactose-induceerbare promotor. Kies één kolonie van de getransformeerde gistcellen en inoculeer deze in 20 milliliter SC minus Ura medium met 2% glucose. Laat de cultuur onder agitatie overnacht groeien bij 30 graden Celsius.
De volgende dag, inoculeer 100 microliter van de overnachtcultuur in vijf milliliter vers SC minus Ura medium en laat de cellen groeien bij 30 graden Celsius gedurende twee tot drie uur. Wanneer de cultuur een optische dichtheid heeft bij 590 nanometer of OD 590 van 0,5, centrifugeer de cultuur gedurende vier minuten bij 3.000 keer g, gooi het supernatant weg en resuspendeer de cellen in vijf milliliter vers SC minus Ura medium met 2% rafinose. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 30 graden Celsius onder agitatie.
Na 30 minuten, centrifugeer de cellen gedurende vier minuten bij 3.000 keer g, gooi het supernatant weg en resuspendeer de cellen in vers SC minus Ura medium met 2% galactose om recombinante eiwitexpressie te induceren. Plaats de cellen terug in de incubator gedurende 16 uur. Na 16 uur, oogst de cellen door één milliliter aliquots van de cultuur over te brengen in steriele microcentrifuge buisjes en centrifugeer gedurende vier minuten bij 3.000 keer g.
Begin deze procedure door de OD 590 van de 16 uur geïnduceerde gistcellen te bepalen. Verdun vervolgens de cellen in steriele PBS tot een OD 590 van 0,1. Breng de expressiecellensuspensies over naar geschikt gelabelde ronde bodempolystyreenbuisjes en bescherm ze tegen licht.
Bereid niet-geïnduceerde cellen voor als negatieve controle voor de flowcytometrie analyse. Voeg de oxidatieve stress sonde toe aan elk monster met een eindconcentratie van vijf micromolar. Bedek de monsters met aluminiumfolie en incubeer gedurende 30 minuten bij 30 graden Celsius.
Wanneer de incubatie klaar is, centrifugeer de cellen, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in PBS. Was de cellen op deze manier drie keer met PBS. Na de derde wassing, resuspendeer de cellen in hetzelfde volume PBS.
Zorg ervoor dat niet-gekleurde cellen zijn opgenomen in de flowcytometrie analyse. Gebruik de geschikte lasers en filters om de flowcytometrie analyse uit te voeren om GFP en het fluorescerende signaal van de oxidatieve stress sonde te detecteren. Begin door te klikken op het Open New Worksheet paneel en geef het experiment een naam.
Selecteer vanuit de werkbalk het Scatter Plot Tool en maak een plot met de variabelen Side Scatter Area op de y-as versus Forward Scatter Area op een lineaire schaal op de x-as. Klik op het Scatter Plot Tool en maak een plot met de variabelen FITC Area op de x-as versus APC Area op een logaritmische schaal op de y-as. Klik op het Instrument Setting icoon en stel alle compensatieniveaus in op nul in het Compensation tab.
Klik vervolgens op het Acquisition tab en selecteer een totaal aantal van 20.000 te registreren gebeurtenissen met een lage flowsnelheid. Omdat het fluorescente emissiesignaal van één fluorofoor kan worden gedetecteerd door een andere detector, is het belangrijk om een compensatieproces uit te voeren om het minimale signaal van elk fluorofoor in alle detectoren gelijk te maken door een eenkleurige controle. Hernoem buisje 001 naar negatieve controle en klik op het Acquire tab om de niet-geïnduceerde, niet-gekleurde cellen te starten.
Pas de spanning in de Instrument Settings van de forward en side scatter aan totdat de populatie in het midden linker kwadrant is verdeeld. Klik op het Polygon icoon om een regio R1 rond de celpopulatie in te stellen, exclusief celdebris, en gebruik deze gegate populatie P1 gelijk aan R1 voor alle fluorescente dot plots en histogramrepresentaties. Om de PMT spanning van het fluorescentiesignaal aan te passen, draai de niet-gekleurde cellen in het FL1 tot FL3 dot plot, en pas de gain aan in het Instrument Setting tab totdat de cellen zijn verdeeld in het onderste linker kwadrant.
Gebruik de Scatter Plot Tool om een dot plot te maken met de variabelen FITC-A op de x-as versus FSC-A en een tweede dot plot met de variabelen APC-A op de x-as versus FSC-A. Verander vervolgens het monster naar de geïnduceerde cellen om GFP fluorescentie te meten. In het Instrument Setting tab, stel de gain in voor FSC-A versus FITC wanneer de populatie is verdeeld in het onderste rechter kwadrant.
Definieer de GFP-positieve celpopulatie met een poort. Verander het monster naar de niet-geïnduceerde gekleurde cellen. Geef oxidatieve stress weer door de fluorescentie op een FSC-A versus APC-A dot plot. Draai de gain totdat de celpopulatie in het linker bovenste kwadrant is verdeeld. Poort de positieve celpopulatie in P3. Gebruik het Histogram icoon om twee histogramplots te maken om de celfluorescentie weer te geven, één voor FITC en één voor APC fluorescentie. Maak een tabel met de gemiddelde fluorescentie-intensiteit en mediane fluorescentie met de overeenkomstige standaard fout en/of de variantiecoëfficiënt voor GFP fluorescentie en oxidatieve stressniveaus.
Klik op het Compensation tab en stel alle compensatieniveaus in op nul. Klik op het Acquisition tab en selecteer een totaal aantal van 20.000 gebeurten
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het beoordelen van de relatie tussen intracellulaire eiwitaggregatie en oxidatieve stress met behulp van flowcytometrie in Saccharomyces cerevisiae. De focus ligt op amyloïdogene eiwitten, in het bijzonder het amyloïde-β-peptide, en hun impact op de cellulaire gezondheid.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Eiwitmisvouwing
Achtergrond
- Proteïneaggregatie kan leiden tot cellulaire oxidatieve stress.
- Het begrijpen van deze relatie is cruciaal voor het bestuderen van neurodegeneratieve ziekten.
- De methode maakt analyse mogelijk van zowel oplosbare als geaggregeerde proteïnetoestanden.
- Flowcytometrie biedt een kwantitatieve benadering om oxidatieve stress in grote populaties te beoordelen.
Doel van de studie
- Om de correlatie tussen amyloïdogene proteïnetoestanden en oxidatieve stress te onderzoeken.
- Om inzicht te verschaffen in ziekten die worden veroorzaakt door misvouwen en aggregatie van eiwitten.
- Om een eenvoudige en efficiënte methode te ontwikkelen voor het bestuderen van deze fenomenen in gist en andere modelorganismen.
Gebruikte methoden
- Flowcytometrie voor het monitoren van eiwitaggregatie.
- Gebruik van Saccharomyces cerevisiae als modelorganisme.
- Kwantificering van oxidatieve stressschade.
- Analyse van amyloïd-β peptidevarianten.
Belangrijkste resultaten
- Een duidelijk verband aangetoond tussen eiwitaggregatie en niveaus van oxidatieve stress.
- Een methode geboden voor het kwantificeren van cellulaire schade in gistpopulaties.
- Inzichten die toepasbaar zijn op andere organismen die recombinante eiwitten tot expressie brengen.
- De voordelen van het gebruik van flowcytometrie in dit onderzoek belicht.
Conclusies
- De methode is effectief voor het bestuderen van proteïneaggregatie en de cellulaire effecten daarvan.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de mechanismen achter neurodegeneratieve ziekten.
- Toekomstige toepassingen kunnen worden uitgebreid naar diverse modelorganismen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Kwantitatieve beoordeling van oxidatieve stress geïnduceerd door eiwitaggregatie in gist maakt vroege risicoreductie van doelwitten en mechanismen voor neurodegeneratieve ziekten mogelijk. Deze methode biedt voorspellend inzicht in de cellulaire gevolgen van amyloïdogene eiwitvarianten, wat targetvalidatie en mechanistische triage in pipelines in de ontdekkingsfase ondersteunt. De schaalbaarheid en kwantitatieve resultaten faciliteren robuuste portfoliobeslissingen voor programma's gericht op eiwitmisfolding en aggregatie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe correlatie mogelijk tussen de aggregatietoestand van eiwitten en cellulaire oxidatieve stress voor mechanisch de-risking.
- Ondersteunt functionele validatie van amyloïdogene targets door in vivo toxiciteitssignaturen te kwantificeren.
- Faciliteert prioritering van eiwitvarianten op basis van aggregatiegevoeligheid en cellulaire impact.
Screening & assayontwikkeling
- Stelt een reproduceerbare, op flowcytometrie gebaseerde assay vast voor high-throughput evaluatie van eiwitaggregatie en stressfenotypes.
- Levert kwantitatieve read-outs op populatieniveau die geschikt zijn voor het screenen van compound-bibliotheken of genetische varianten.
- Maakt standaardisatie van oxidatieve stressmetingen mogelijk over meerdere eiwitconstructen en condities heen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Biedt een modelsysteem voor het koppelen van aggregatiefenotypes aan cellulaire stress, wat bijdraagt aan translationele biomarkerstrategieën.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking op basis van gist naar validatie van aggregatie-gestuurde toxiciteit in complexere modellen.
- Sluit aan bij preklinische inspanningen om ziekterelateerde mechanismen ten grondslag aan neurodegeneratie te karakteriseren.
Pipeline- en workflowintegratie
Deze methode integreert in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door hypothese-testen van aggregatie-geïnduceerde toxiciteit mogelijk te maken en door prioritering van lead-verbindingen op basis van cellulaire stressuitkomsten te ondersteunen.
- Ontdekkingsbiologie: Kwantificeert de impact van eiwitaggregatie op oxidatieve stress, waardoor mechanistische verbanden tussen varianteigenschappen en cellulaire fenotypes worden verduidelijkt.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve resultaten voor aggregatie en stress, wat de assay-gereedheid en reproduceerbaarheid ondersteunt.
- Analytiek: Genereert gegevens over de gemiddelde en mediane fluorescentie-intensiteit voor een robuuste statistische vergelijking van eiwitvarianten.
- Translationeel onderzoek: Biedt een platform voor het evalueren van aggregatie-gedreven toxiciteit die relevant is voor modellen van neurodegeneratieve ziekten.
- Zakelijke herbruikbaarheid: Aanpasbaar aan andere recombinante eiwitten en modelorganismen voor brede R&D-toepasbaarheid.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de selectie van targets door aggregatie te koppelen aan cellulaire stressfenotypes.
- Operationele waarde: Levert schaalbare, reproduceerbare en kwantitatieve assays voor standaardisatie over verschillende programma's heen.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door vroegtijdig mechanisch bewijs van toxiciteitsrisico te leveren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde voortgang en triage van targets voor eiwitmisfolding mogelijk.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in gistgenetica, flowcytometrie en fluorescentiegebaseerde analyse.
- Toegang tot flowcytometrie-instrumentatie en analytische software voor data-acquisitie en gating is noodzakelijk.
- Vereist een strikte standaardisatie van gating-strategieën en fluorescentiecompensatie tussen teams.
- Aanpasbaar aan andere modelsystemen die recombinante eiwitten tot expressie brengen, mits voorzien van passende controles.
- Afhankelijk van een robuuste selectie en validatie van probes voor de meting van oxidatieve stress.
