Name: Retrospectieve MicroRNA Sequencing: CDNA Bibliotheek voorbereiding Protocol met behulp van formaline-vaste paraffine-ingebedde RNA Specimens (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Leer een betrouwbaar cDNA-bibliotheekprotocol voor microRNA-sequencing uit formaline-vaste paraffine-ingebedde weefsels tot 35 jaar oud. Deze methode ondersteunt biomarkeronderzoek in gearchiveerde monsters.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr. Thomas Tuschl, hoofd van het laboratorium voor moleculaire biologie van RNA, en ook familieleden van zijn laboratorium voor hun steun en voor het delen van de technologie, ontwikkeld in zijn laboratorium en toegang bieden tot de pijpleiding van de RNAworld. Wij danken ook Dr. Markus Hafner voor zijn protocol voor het delen en het verstrekken van gedetailleerde beschrijvingen over alle biochemische en enzymatische stappen in zijn eerste procedure gebruikt.

<ol><li>Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+stability+of+microRNAs+in+tissue+samples+of+compromised+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows.+Arch%22%5BJournal%5D)">High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality.</a> Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).</li>
<li>Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excavation+of+a+buried+treasure--DNA%2C+mRNA%2C+miRNA+and+protein+analysis+in+formalin+fixed%2C+paraffin+embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues.</a> Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).</li>
<li>Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+Stability+in+Postmortem+FFPE+Tissues%3A+Quantitative+Analysis+Using+Autoptic+Samples+from+Acute+Myocardial+Infarction+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients.</a> PLoS One. 10 (6), e0129338(2015).</li>
<li>Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsa-miR-375+is+differentially+expressed+during+breast+lobular+neoplasia+and+promotes+loss+of+mammary+acinar+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity.</a> J. Pathol. 226, 108-119 (2012).</li>
<li>Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+global+micro-RNA+profiling+with+formalin-fixed+paraffin-embedded+breast+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues.</a> Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).</li>
<li>Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+array-based+analysis+of+microRNA+expression+comparing+matched+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples.</a> J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).</li>
<li>Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-platform+analysis+of+microRNA+expression+measurements+in+RNA+from+fresh+frozen+and+FFPE+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues.</a> PLoS One. 8, e52517(2013).</li>
<li>Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microRNA+deep+sequencing+of+matched+formalin-fixed+paraffin-embedded+and+fresh+frozen+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues.</a> PLoS One. 8 (5), e64393(2013).</li>
<li>Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiling+outperforms+mRNA+expression+profiling+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Clin.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).</li>
<li>Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+in+formalin-fixed+paraffin+embedded+tissue+using+real+time+quantitative+PCR%3A+the+strengths+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls.</a> J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).</li>
<li>Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissues+from+routine+pathology+archives+are+suitable+for+microRNA+analyses+by+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR.</a> J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).</li>
<li>Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+miRNA+expression+analysis+using+fluidigm+microfluidics+dynamic+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays.</a> BMC Genomics. 12, 144(2011).</li>
<li>Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+microRNA+quantification+in+total+RNA+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples.</a> Methods. 50 (4), S6-S9 (2010).</li>
<li>Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+and+microarray-based+interrogation+of+microRNAs+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%3A+preliminary+assessment+of+cross-platform+concordance%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance.</a> Genomics. 102, 8-14 (2013).</li>
<li>Visone, R., Croce, C. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2671346/">MiRNAs and cancer.</a> Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).</li>
<li>Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li>
<li>Cho, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+potential+biomarkers+for+cancer+diagnosis%2C+prognosis+and+targets+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).</li>
<li>Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-RNAs+as+diagnostic+or+prognostic+markers+in+human+epithelial+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies.</a> BMC Cancer. 11, 500(2011).</li>
<li>Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+global+microRNA+expression+profiling+using+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies.</a> Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).</li>
<li>Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Adaptation+of+a+Laboratory+Based+cDNA+Library+Preparation+Protocol+for+Retrospective+Sequencing+of+Archived+MicroRNAs+from+up+to+35-Year-Old+Clinical+FFPE+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens.</a> Int J Mol Sci. 18, e627(2017).</li>
<li>Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+DNA%2FRNA+co-extraction+for+analysis+of+microRNAs%2C+mRNAs%2C+and+genomic+DNA+from+formalin-fixed+paraffin-embedded+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens.</a> PLoS One. 7 (4), e34683(2012).</li>
<li>Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailović, A., Pena, J. T., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoded+cDNA+library+preparation+for+small+RNA+profiling+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing.</a> Methods. 58 (2), 164-170 (2012).</li>
<li>Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illumina+whole-genome+complementary+DNA-mediated+annealing%2C+selection%2C+extension+and+ligation+platform%3A+assessing+its+performance+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+samples+and+identifying+invasion+pattern-related+genes+in+oral+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma.</a> Hum. Pathol. 42 (12), 1911-1922 (2011).</li>
</ol>

De auteurs wilt doorgeven dat een publicatie met enkele van de gegevens in dit manuscript werd gepubliceerd in de International Journal of Molecular Sciences door Loudig et al. 21.

Een zeer reproduceerbaar en robuuste cDNA Bibliotheek voorbereiding protocol voor NGS van kleine RNAs gearchiveerd in FFPE RNA specimens is gepresenteerd in dit protocol, dat een aangepaste en geoptimaliseerde versie van de procedure beschreven door Hafner et al. is 22
Alle stappen van dit protocol zijn geoptimaliseerd voor gebruik met oudere gearchiveerde en gecompromitteerde totaal RNA verhaald van FFPE exemplaren. De belangrijkste stap van dit protocol, voor...

miRNAs zijn opmerkelijk goed bewaard in formaline-vaste paraffine-ingebedde (FFPE) exemplaren1,2,3. Vorige werk heeft aangetoond dat de uitdrukking van deze korte regelgevende niet-coderende één gestrande molecules van RNA met succes kan worden geëvalueerd met behulp van totaal RNA van FFPE monsters en relevante gen expressie gegevens in vergelijking met de originele fresh weefsels4,5,6,7,8. In vergelijking met grote messenger RNAs, die hebben aangetoond dat kritisch worden beïnvloed door FFPE weefsel verwerking (formaldehyde, hitte, uitdroging, enz.), endogene RNases, en de leeftijd van de specimens, de geringe omvang van miRNAs (~ 18-24 nucleotiden) verschijnt ze resistent tegen afbraak en veerkrachtig voor langere termijn opgeslagen, ook aangetoond door miRNA expressie studies die beter te presteren dan high-throughput mRNA studies in gearchiveerde exemplaren9te maken. miRNA expressie studies met behulp van gearchiveerde klinische monsters, die meestal in kleinschalige analyses zijn uitgevoerd, hebben aangetoond dat één of multiplexed kwantitatieve PCR-testen, verschillende soorten technologieën van microarray, en meest recent NGS kan worden gebruikt ter beoordeling van de expressie van bewaarde miRNAs na optimalisering van deze testen10,11,12,13,14.
Gezien het feit dat disregulatie van miRNA expressie geassocieerd met de ontwikkeling van een verscheidenheid van menselijke maligniteiten is geweest en dat er potentieel een enorm aanbod van klinisch is geannoteerde gearchiveerde exemplaren, is duidelijk geworden dat deze kleine RNA moleculen vormen een veelbelovende bron van potentiële kanker biomarkers15,16,17,18. Het gebruik van een high-throughput gen expressie technologie zoals NGS heeft het voordeel van een globale beoordeling van alle miRNA afschriften in vergelijking met gerichte technologieën zoals PCR en/of microarrays19. Om deze reden is een geoptimaliseerde, betaalbare en gemakkelijk toepasbare protocol voorbereiding cDNA Bibliotheek van kleine RNAs van oudere gearchiveerde exemplaren voor NGS geoptimaliseerd zodat grootschalige retrospectieve studies20.
Wij eerder vastgestelde een gelijktijdige RNA/DNA-extractie-protocol voor afzonderlijke terugwinning van RNA en DNA uit oudere gearchiveerde exemplaren, die wij beter te presteren dan hedendaagse commerciële kits21gevonden. Met behulp van dit protocol extractie te verkrijgen van totaal RNA van FFPE weefsels gearchiveerd voor langere periode van tijd, wij de voorbereiding van cDNA bibliotheken voor NGS van miRNAs in klinische monsters bewaard tot 35 jaar geoptimaliseerd. Bovendien, in een onlangs gepubliceerde studie waar we bereid cDNA bibliotheken van klinisch geclassificeerde ductaal carcinoma in situ (DCIS) exemplaren, we geïdentificeerd differentially uitgedrukte miRNAs die werden gevalideerd door kwantitatieve PCR, die aangegeven dat specifieke miRNA expressie verandert kan in DCIS laesies van patiënten die de ontwikkeling van kanker van de borst in vergelijking met DCIS laesies van patiënten die geen borstkanker ontwikkelen opgespoord worden.
Gelet op de kosten van commerciële kits voor voorbereiding van kleine RNA-cDNA bibliotheken, het potentieel voor hun stopzetting, evenals het gebruik van/octrooi beschermd reagentia die niet kan worden geoptimaliseerd, we besloten aan te passen een eerder gepubliceerde laboratorium gebaseerde en kit-gratis 3' barcoded cDNA Bibliotheek voorbereiding protocol voor NGS van kleine RNAs gearchiveerd in FFPE exemplaren, waardoor gelijktijdige analyse van 1822monsters. Dit protocol biedt een ideale en robuuste stapsgewijze procedure met visuele en technische evaluatie controleposten, die kritisch zijn voor de aanpassing aan FFPE RNA exemplaren waren, en heeft een sterk potentieel voor toepassing naar andere bronnen van gecompromitteerde of moeilijk RNA om materiaal te gebruiken. Van het protocol van het oorspronkelijke toepasbaarheid werd verbeterd door vervanging van radioactief gelabelde grootte markeringen met TL (bvSYBR Gold) aantoonbaar RNA grootte markeringen gebruikt tijdens de selectie van ligaturen bibliotheken op grote polyacrylamide gels. Dit geoptimaliseerd protocol is afhankelijk van de afbinding van 3' barcoded adapters met 18 afzonderlijke FFPE RNA-modellen, die dan samengevoegd samen te ondergaan adapter afbinding 5', omgekeerde-transcriptie en een pilot PCR-analyse voor op maat van versterking van de definitieve cDNA bibliotheek voorafgaand aan grootschalige PCR versterking, reiniging, en NGS op een hoge doorvoersnelheid sequencer.

<table><tbody><tr><td>1% Triton x-100</td><td>Invitrogen</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>10mM ATP</td><td>Ambion</td><td>AM8110G</td><td></td></tr><tr><td>10X dNTPs</td><td>Ambion</td><td>AM8110G</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15581044</td><td></td></tr><tr><td>14M Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>O3445I-100</td></tr><tr><td>20 nt ladder</td><td>Jena Bioscience</td><td>M-232S</td><td></td></tr><tr><td>20mg/ml Bovine Serum Albumine</td><td>Sigma</td><td>B8894-5ML</td><td></td></tr><tr><td>50X Titanium Taq</td><td>Clontech Laboratories</td><td>639208</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs</td><td>GIBCO</td><td>V16</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D9170-5VL</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf microcentrifuge 5424R</td><td>USA scientific</td><td>4054-4537Q</td><td></td></tr><tr><td>Eppndorf Thermomixer</td><td>USA scientific</td><td>4053-8223Q</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>Gel Breaker Tube 0.5 ml</td><td>IST Engineering Inc,</td><td>3388-100</td><td></td></tr><tr><td>Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs</td><td>Biorad</td><td>1704446</td><td></td></tr><tr><td>Glycoblue</td><td>Ambion</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Jersey-Cote</td><td>LabScientific, Inc</td><td>1188</td><td></td></tr><tr><td>KcL 2M</td><td>Ambion</td><td>AM9640G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 1M</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Minifuge dual rotor personal centrifuge</td><td>USA scientific</td><td>2641-0016</td><td></td></tr><tr><td>Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers</td><td>Ciore Life Science</td><td>21070010</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotides</td><td>IDT</td><td>Defined during order</td><td></td></tr><tr><td>Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>B2</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Gel Extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Restriction enzyme PmeI</td><td>NEB</td><td>R0560S</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free water</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0</td><td>Life Technologies</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0 blue light transilluminator</td><td>Thermofisher</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE agarose</td><td>Lonza</td><td>50002</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III reverse transcription kit</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>SybrGold</td><td>Life Technologies</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 1</td><td>NEB</td><td>M0204S</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q</td><td>NEB</td><td>0351L</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td>Themocycler with heated lid</td><td>Applied Biosystem</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>Tris 1M pH 7.5</td><td>Invitrogen</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>Tris 1M pH8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td></td></tr></tbody></table>

retrospectieve microrna sequencing: cdna bibliotheek voorbereiding protocol met behulp van formaline-vaste paraffine-ingebedde rna specimens

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

– Gearchiveerd, klinisch ingedeeld formaline-vaste kunnen paraffine-ingebedde (FFPE) weefsels voorzien nucleïnezuren retrospectieve moleculaire studies van de ontwikkeling van kanker. Met behulp van niet-invasieve of vooraf kwaadaardige laesies van patiënten die later het ontwikkelen van invasieve ziekte, kunnen gen expressie analyses helpen identificeren van vroege moleculaire veranderingen die naar cancer risk predisponeren. Het is goed beschreven dat nucleïnezuren verhaald FFPE weefsels ernstige fysieke schade en chemische wijzigingen, die bemoeilijken hun analyse en in het algemeen vereist aangepast tests hebben ondergaan. MicroRNAs (miRNAs), maar die een kleine klasse vertegenwoordigen van RNA-moleculen die slechts tot ~ 18-24 nucleotiden, is aangetoond dat langdurige opslag weerstaan en hebben met succes is geanalyseerd in FFPE monsters. Hier presenteren we een 3' barcoded complementaire DNA (cDNA) bibliotheek voorbereiding protocol specifiek geoptimaliseerd voor de analyse van kleine RNAs geëxtraheerd uit gearchiveerde weefsels, die onlangs werd aangetoond als robuust en zeer reproduceerbaar, wanneer met behulp van gearchiveerd klinische monsters opgeslagen tot 35 jaar. De voorbereiding van deze bibliotheek is goed aangepast aan de multiplex analyse van gevaar/gedegradeerd materiaal waar RNA samples (maximaal 18) zijn afgebonden met individuele 3' barcoded adapters en vervolgens samen gebundeld voor verdere enzymatische en biochemische preparaten vóór de analyse. Alle purifications worden uitgevoerd door polyacrylamide gelelektroforese (pagina), waarmee de grootte-specifieke selecties en verrijking van barcoded kleine RNA soorten. Dit cDNA Bibliotheek voorbereiding is goed aangepast aan minuut RNA ingangen, als een pilot polymerase-kettingreactie (PCR) vaststelling van een specifieke versterking cyclus toelaat te produceren optimale hoeveelheden materiaal voor het rangschikken van de volgende generatie (NGS). Deze aanpak is geoptimaliseerd voor het gebruik van aangetaste FFPE RNA uit monsters van maximaal 35 jaar gearchiveerd en biedt zeer reproduceerbaar NGS-gegevens.

Zoals beschreven in de methode hier, een totaal van 18 afzonderlijke FFPE RNA monsters (100 ng elke) in afzonderlijke buizen zijn ingesteld voor het ondergaan van 3' adenylated barcoded oligonucleotide T4 afbinding 's nachts. De volgende dag, zijn de enzymatische reacties warmte-gedeactiveerd, gecombineerd en neergeslagen in een enkele buis. De RNA-pellet is geresuspendeerde en de ligaturen RNA-moleculen worden gescheiden op een 15% denaturering polyacrylamidegel (pagina), waar RNA oligon...

Paraffine-ingebedde specimens formaline-vaste vormen een waardevolle bron van moleculaire biomarkers voor ziekten bij de mens. Hier presenteren we een laboratorium gebaseerde cDNA Bibliotheek voorbereiding protocol, in eerste instantie ontworpen met vers bevroren RNA, en geoptimaliseerd voor de analyse van gearchiveerde microRNAs uit weefsels tot 35 jaar opgeslagen.

Retrospectieve MicroRNA Sequencing: CDNA Bibliotheek voorbereiding Protocol met behulp van formaline-vaste paraffine-ingebedde RNA Specimens

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Het algemene doel van deze CDNA-bibliotheekvoorbereiding is om succesvol sequencing van kleine RNA's mogelijk te maken die zijn opgeslagen in formele en gefixeerde paraffine-ingebedde weefsels. Deze methode is erg handig voor het analyseren van formele en gefixeerde paraffine-ingebedde specimens. Je extraheert RNA uit maximaal 18 specimens, je analyseert de inhoud van al deze en verkrijgt een profiel van alle microRNase voor alle specimens.Om het protocol te beginnen, voeg je 8,5 microliter van eerder bereide ligatie master mix toe aan elk van de 18 afzonderlijk gealiquoteerde FFPERNA-monsters. Schud de buisjes voorzichtig en centrifugeer gedurende twee seconden. Na het centrifugeren, bewaar de buisjes op ijs.Gebruik een drie microliter pipet om een microliter van elke adapter over te brengen naar de corresponderende FFPERNA-monsters die RNA en ligatie master mix bevatten. Pipetteer niet op en neer en verwissel tips tussen FFPERNA-monsters. Sluit elke buis, schud ze om te mengen en centrifugeer ze gedurende twee seconden.Plaats de buisjes op ijs. Denatureer de reacties door de buisjes één minuut op een verwarmingsblok op 90 graden Celsius te plaatsen en plaats ze vervolgens onmidde

retrospective-microrna-sequencing-complementary-dna-library

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

We beschrijven een op getarget RNA-sequencing gebaseerde methode die de voorbereiding van geïndiceerde cDNA-bibliotheken, hybridisatie en captuur met aangepaste sondes en data-analyse om geselecteerde transcripten te onderzoeken op genexpressie, mutaties en genfusies omvat. Getarget RNAseq maakt een kosteneffectieve, snelle evaluatie van geselecteerde transcripten mogelijk op een desktop sequencer.

Gerichte RNA Sequencing Assay Gene Expression en Genomic Wijzigingen karakteriseren

Deze gewijzigde extractie protocol verbetert RNA en DNA opbrengst van meer doelgerichte regio's van belang in histopathologische weefsel blokken.

Bereiding van formaline gefixeerde paraffine-ingebed weefsel Cores voor zowel RNA en DNA-extractie

Dit protocol biedt een overzicht van de procedures voor de isolatie van RNA voor de profilering van de transcriptomic van de lymfeklier weefsels van grote dieren, met inbegrip van de stappen in de identificatie en de besnijdenis van lymfeklieren van vee en wilde dieren, bemonstering benaderingen te leveren consistentie in meerdere dieren, en overwegingen plus representatieve resultaten voor de post collectie bewaring en verwerking ten behoeve van RNA analyse.

Verzameling en verwerking van lymfklieren uit grote dieren RNA p.a.: lymfeklier Transcriptomic Studies van grote diersoorten voorbereiden

Dit protocol biedt onderzoekers met een nieuw instrument voor het controleren van de betrouwbaarheid van transcriptie in meerdere modelorganismen.

Genoom-brede Surveillance van transcriptie fouten in eukaryote organismen

Circulaire Rna's (Circrna's) zijn niet-Codeer Rna's die mogelijk rollen hebben in transcriptionele regulatie en die interacties tussen eiwitten bemiddel- Na beoordeling van verschillende parameters voor de bouw van circRNA sequencing Bibliotheken, een protocol werd gecompileerd met behulp van gestrande Total RNA Library voorbereiding met RNase R pre-behandeling en wordt hier gepresenteerd.

Identificatie van circulaire Rna's met RNA-sequencing

We presenteren een gedetailleerd klein RNA Library Reparatie protocol met minder bias dan standaardmethodes en een verhoogde gevoeligheid voor 2 '-O-methyl rna's. Dit protocol kan worden gevolgd met behulp van zelfgemaakte reagentia om kosten te besparen of kits te gebruiken voor het gemak.

Verbetering van kleine RNA-SEQ: minder bias en betere detectie van 2 '-O-methyl Rna's

Therapie resistentie ontwikkelt zich vaak bij patiënten met gevorderde prostaatkanker, en in sommige gevallen vordert kanker naar een dodelijk subtype genaamd neuro-endocriene prostaatkanker. Beoordeling van de kleine niet-codering RNA-gemedieerde moleculaire veranderingen die deze overgang vergemakkelijken zou leiden tot een betere stratificatie van de ziekte en identificatie van causale mechanismen die leiden tot de ontwikkeling van neuro-endocriene prostaatkanker.

Sequentiëren van klein niet-coderende RNA van Formalin-vaste weefsels en van serum afgeleide Exosomen van castratie bestendige prostaatkanker patiënten

We beschrijven een techniek voor het profileren van microRNAs in vroege muisembryo's. Dit protocol overwint de uitdaging van lage celinput en kleine RNA-verrijking. Deze test kan worden gebruikt om veranderingen in miRNA expressie na verloop van tijd te analyseren in verschillende celvormen van het vroege muisembryo.

Voorbereiding van kleine RNA-bibliotheken voor sequencing van vroege muisembryo's

Dit protocol beschrijft een methode om RNA te isoleren uit gedefinieerde histologische gebieden van paraformaldehydegebonden, Optimal Cutting Temperature-verbinding-ingebedde muizenleverweefsel met behulp van lasercapture-microdissectie, waardoor gerichte downstream genexpressie-analyse mogelijk is.

Laservangstmicrodissectie van paraformaldehyde-gefixeerd muizenleverweefsel voor RNA-analyse

Hier presenteren we een protocol om het gehele genoom DNA-methylatie in grootschalige klinische patiënt screening studies met behulp van de Methyl-bindende DNA Capture sequencing (MBDCap-seq of MBD-volgende) technologie en de daaropvolgende bioinformatica analyse pijplijn te onderzoeken.

-Methyl-bindende DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Leer een betrouwbaar cDNA-bibliotheekprotocol voor microRNA-sequencing uit formaline-vaste paraffine-ingebedde weefsels tot 35 jaar oud. Deze methode ondersteunt biomarkeronderzoek in gearchiveerde monsters.

Retrospectieve MicroRNA Sequencing: CDNA Bibliotheek voorbereiding Protocol met behulp van formaline-vaste paraffine-ingebedde RNA Specimens (Video) | JoVE Journal

Retrospectieve MicroRNA Sequencing: CDNA Bibliotheek voorbereiding Protocol met behulp van formaline-vaste paraffine-ingebedde RNA Specimens

Meer video's verkennen