Retrospectieve MicroRNA Sequencing: CDNA Bibliotheek voorbereiding Protocol met behulp van formaline-vaste paraffine-ingebedde RNA Specimens
5 mei 2018
Paraffine-ingebedde specimens formaline-vaste vormen een waardevolle bron van moleculaire biomarkers voor ziekten bij de mens. Hier presenteren we een laboratorium gebaseerde cDNA Bibliotheek voorbereiding protocol, in eerste instantie ontworpen met vers bevroren RNA, en geoptimaliseerd voor de analyse van gearchiveerde microRNAs uit weefsels tot 35 jaar opgeslagen.
Het algemene doel van deze CDNA-bibliotheekvoorbereiding is om succesvol sequencing van kleine RNA's mogelijk te maken die zijn opgeslagen in formele en gefixeerde paraffine-ingebedde weefsels. Deze methode is erg handig voor het analyseren van formele en gefixeerde paraffine-ingebedde specimens. Je extraheert RNA uit maximaal 18 specimens, je analyseert de inhoud van al deze en verkrijgt een profiel van alle microRNase voor alle specimens.
Om het protocol te beginnen, voeg je 8,5 microliter van eerder bereide ligatie master mix toe aan elk van de 18 afzonderlijk gealiquoteerde FFPERNA-monsters. Schud de buisjes voorzichtig en centrifugeer gedurende twee seconden. Na het centrifugeren, bewaar de buisjes op ijs.
Gebruik een drie microliter pipet om een microliter van elke adapter over te brengen naar de corresponderende FFPERNA-monsters die RNA en ligatie master mix bevatten. Pipetteer niet op en neer en verwissel tips tussen FFPERNA-monsters. Sluit elke buis, schud ze om te mengen en centrifugeer ze gedurende twee seconden.
Plaats de buisjes op ijs. Denatureer de reacties door de buisjes één minuut op een verwarmingsblok op 90 graden Celsius te plaatsen en plaats ze vervolgens onmiddellijk op ijs. Gebruik vervolgens een drie microliter pipet om een microliter van het verdunde ligatie-enzym over te brengen in elk van de 18 RNA-monsters.
Plaats de ligaties op ijs en plaats ze in een koude kamer van vier graden Celsius voor een overnachtelijke incubatie van 18 uur. Plaats de buisjes gedurende één minuut op een verwarmingsblok op 90 graden Celsius om de ligatiereactie te deactiveren en plaats ze vervolgens gedurende ten minste twee minuten op ijs om af te koelen. Breng 1,2 microliter van de precipitatie master mix in elke buis over.
Voeg 63 microliters 100% ethanol toe. Sluit elke buis, schud de buisjes om te mengen en centrifugeer ze gedurende twee seconden. Plaats de buisjes op ijs.
Combineer de inhoud van alle 18 buisjes in een enkele 1,5 milliliter gesiliconiseerde buis en draai om drie keer om te mengen. Centrifugeer de buisjes gedurende twee seconden en plaats ze 60 minuten op ijs om te sedimenteren. Na sedimentatie, centrifugeer de 1,5 milliliter buis met de gepoolde ligaties.
Verwijder vervolgens het supernatant met een 1 milliliter pipettip, maar laat wat vloeistof op de bodem. Kantel de buis en gebruik een 20 microliter pipet om het resterende supernatant te verwijderen. Zuig het supernatant met een Pasteur pipet met een 10 microliter tip op en suspendeer het RNA-pellet in 20 microliter RNase-vrij water door de buis te schudden.
Voeg 20 microliter PAA gel-laadoplossing toe om het RNA te resuspenderen. Schud de buis, centrifugeer de buis gedurende twee seconden bij kamertemperatuur en plaats de buis op ijs. Vervang de eerder bereide 0,5 XTBE van de gelapparatuur met verse 0,5 XTBE en laad deze laatste, groottemarkers en geligeerd RNase in het midden van de gel, waarbij twee lege putjes aan beide zijden worden achtergelaten.
Laat vervolgens de gel lopen. Nadat de gel is gelopen, verwijder de 15% pagina door een van de glasplaten te verwijderen. Spuit de gel die op de glasplaat ligt lichtjes met 10 microliters fluorescerende kleurstofoplossing en 25 milliliter 0,5 XTBE en laat het vijf minuten vlak in het donker liggen.
Leg het glas met de gel op een blauwlicht-transilluminator en lijn beide 19 nucleotide en 24 nucleotide groottemarkers uit met een liniaal om de excisie van de geligeerd kleine RNA's te richten. Snijd vervolgens de gel uit. Plaats de uitgesneden gel in een 0,5 milliliter buis ontworpen om gelsegmenten te fragmenteren, stevig gepositioneerd in een 1,5 milliliter gesiliconiseerde microcentrifugebuis.
Centrifugeer de gel gedurende drie minuten bij kamertemperatuur op 16 duizend keer G. Suspendeer het gefragmenteerde gel met 300 microliter 400 millimolair natriumchloride-oplossing. Sluit de buis en verzegel hem met paraffinefolie.
Schud de inhoud op een thermomixer bij 11 honderd RPM in een koude kamer van vier graden Celsius voor een overnachtelijke incubatie. De volgende dag, haal de buis uit de thermomixer en gebruik een 1 milliliter pipet om de oplossing over te brengen naar een vijf micrometer filterbuis, geplaatst in een 1,5 milliliter gesiliconiseerde RNase-vrije opvangbuis. Centrifugeer de buis gedurende drie minuten bij 23 honderd keer G bij kamertemperatuur.
Gooi de filterbuis weg, voeg 950 microliter 100% ethanol toe aan de opvangbuis met de gefilterde oplossing en draai de buis om te mengen. Centrifugeer de buis gedurende twee seconden en plaats deze 60 minuten op ijs. Precipiteer vervolgens het RNA-pellet.
Droog vervolgens het RNA-pellet door de dop te openen en voorzichtig het supernatant met een 1 milliliter pipet te verwijderen, terwijl wat vloeistof op de bodem achterblijft. Gebruik een 20 microliter pipet om alle resterende supernatant te verwijderen zonder het pellet aan te raken. Kantel de buis zodat eventuele resterende oplossing naar de andere kant van het pellet beweegt.
Gebruik een Pasteur pipet om het supernatant te zuigen en droog het pellet met behulp van een vacuüm. Suspendeer het RNA-pellet in 5,6 microliter RNase-vrij water. Ontdooi de reverse transcriptie reagentia op ijs gedurende 15 minuten.
Stel een reverse transcriptie reactie op door drie microliter 5X buffer toe te voegen, 4,2 microliter 10X dioxynucleotide trifosfaat, of DNTP's, en 1,5 microliter dithiothreitol, of DTT. Schud de buis voorzichtig om de reactie te mengen en centrifugeer gedurende twee seconden om de oplossing te verzamelen. Nadat de reactie gedurende exact 30 seconden op een verwarmingsblok op 90 graden Celsius is geplaatst, breng het direct over naar een thermomixer op 50 graden Celsius gedurende twee minuten om de temperatuur gelijk te maken.
Voeg 0,75 microliter van het reverse transcriptie-enzym direct toe aan de oplossing. Schud voorzichtig om te mengen en plaats de buis onmiddellijk terug op de thermomixer op 50 graden Celsius gedurende 30 minuten. Na 30 minuten, breng de bu
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor de preparatie van een cDNA-bibliotheek, geoptimaliseerd voor het analyseren van gearchiveerde microRNA's uit in formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde weefsels. De methode maakt de extractie en sequencing van kleine RNA's mogelijk uit monsters die tot 35 jaar bewaard zijn gebleven.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biomarkeranalyse
- Moleculaire biologie
Achtergrond
- In formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde monsters zijn waardevol voor het bestuderen van menselijke ziekten.
- Micro-RNA's spelen een cruciale rol bij genregulatie en ziekteprocessen.
- Gearchiveerde weefsels bieden een unieke mogelijkheid om biologische veranderingen op de lange termijn te bestuderen.
- Traditionele RNA-extractiemethoden zijn mogelijk niet geschikt voor deze monsters.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbaar protocol voor de preparatie van cDNA-bibliotheken uit gearchiveerde weefsels.
- Het mogelijk maken van de analyse van microRNA's uit met formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde monsters.
- Het faciliteren van de sequencing van kleine RNA's voor de ontdekking van biomarkers.
Gebruikte methoden
- Extractie van RNA uit maximaal 18 in formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde monsters.
- Bereiding van de ligatiemix voor cDNA-synthese.
- Centrifugatie en bewaring van monsters op ijs.
- Sequencing van kleine RNA's om microRNA-profielen te verkrijgen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle extractie van RNA uit gearchiveerde monsters.
- Generatie van cDNA-bibliotheken die geschikt zijn voor sequencing.
- Profiel van microRNA's verkregen uit meerdere monsters.
- Validatie van de methode voor langdurig bewaarde weefsels.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol is effectief voor het analyseren van gearchiveerde microRNA's.
- Deze methode vergroot het potentieel voor de ontdekking van biomarkers in historische monsters.
- Toekomstige studies kunnen deze aanpak benutten voor onderzoek naar diverse ziekten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Gearchiveerde FFPE-weefsels vormen een waardevolle maar onderbenutte bron voor retrospectieve biomarker-ontdekking in de oncologie en andere therapeutische gebieden. Dit protocol maakt betrouwbare microRNA-profilering mogelijk vanuit monsters die decennialang zijn bewaard, wat targetvalidatie en mechanische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase ondersteunt. Door reproduceerbare NGS-klare bibliotheken te genereren uit gedegradeerd RNA, wordt het voorspellend vertrouwen bij het identificeren van vroege moleculaire veranderingen die gekoppeld zijn aan ziekterisico vergroot.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken met behulp van miRNA-expressie uit klinisch geannoteerde gearchiveerde weefsels.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door vroege moleculaire gebeurtenissen te koppelen aan latere ziekteprogressie in gematchte patiëntcohorten.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde, gebarcodeerde cDNA-bibliotheken die geschikt zijn voor gemultiplexde small RNA-sequencing van maximaal 18 monsters.
- Operationele waarde: Waarborgt de reproduceerbaarheid van de assay door middel van PAGE-gebaseerde grootteselectie en pilot-PCR-optimalisatie voor minimale inputvereisten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert translationele continuïteit door het mogelijk maken van een vergelijking van miRNA-profielen tussen FFPE- en vers bevroren monsters van dezelfde patiënten.
- Operationele waarde: Biedt een robuuste workflow voor longitudinale studies met gebruik van weefsels die tot 35 jaar zijn gearchiveerd, ter ondersteuning van inspanningen voor biomarker-kwalificatie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van hypothese-gestuurde targetvalidatie tot preklinische biomarkerbeoordeling, in het bijzonder voor studies die gebruikmaken van historische klinische monsters.
- Discovery Biology: Maakt hypothese-testen mogelijk door kwantitatieve miRNA-expressiegegevens te leveren uit goed geannoteerde FFPE-cohorten.
- Screening: Levert assay-klare, genormaliseerde small RNA-bibliotheken met een gedefinieerde selectie op grootte voor consistente downstream sequencing.
- Analytics: Produceert reproduceerbare NGS-gegevens die geschikt zijn voor differentiële expressieanalyse en correlatie met fenotypische uitkomsten.
- Translationeel Onderzoek: Ondersteunt preklinische continuïteit door miRNA-signaturen te valideren in gearchiveerde weefsels die die in vers bevroren tumormodellen weerspiegelen.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een schaalbaar, gestandaardiseerd protocol voor retrospectieve moleculaire analyse over meerdere therapeutische gebieden en monstersets.
Operationele impact & bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de selectie van targets door stabiele miRNA-biomarkers te onthullen, ondanks langdurige weefselfixatie en degradatie.
- Operationele waarde: Levert een hoge reproduceerbaarheid en standaardisatie op via gelgebaseerde zuivering en cyclusgeoptimaliseerde PCR, waardoor technische variabiliteit wordt verminderd.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door het gebruik van bestaande biobankbronnen mogelijk te maken, waardoor de behoefte aan prospectieve monsterverzameling wordt geminimaliseerd.
- Impact op de portfolio: Informeert risico-gecorrigeerde prioritering door vroege moleculaire veranderingen te identificeren met een sterke correlatie met invasieve ziektefenotypen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de omgang met klein RNA, PAGE-gelelektroforese en de preparatie van NGS-libraries.
- Is afhankelijk van toegang tot thermocyclers, gelelektroforesesystemen en low-binding buisjes om RNA-verlies te voorkomen.
- Vereist gestandaardiseerde adapterligatie en barcode-ontwerp om kruiscontaminatie tussen monsters in multiplex-workflows te vermijden.
- Omvat optimalisatiestappen voor de hoeveelheid en kwaliteit van het input-RNA, in het bijzonder voor sterk gedegradeerde FFPE-extracten.
- Wordt beperkt door de RNA-integriteit in extreem oude of slecht geconserveerde monsters, waardoor een QC-beoordeling vóór de library-preparatie noodzakelijk is.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Title
0:39
3' Barcoded Adapter Ligations with 18 Individual RNA Samples
2:00
Ligated Small RNA Purification
5:26
5' Ligated and 3' Barcoded Purified Small RNAs Reverse Transcription
8:12
Pilot PCR and Large-scale PCR Amplification
10:46
Results: Protocol Robust Whether Fresh, Frozen, or Aged
12:01
Conclusion
