Name: Protocol voor MicroRNA overdracht naar volwassen beenmerg-afgeleide hematopoietische stamcellen om cel Engineering gecombineerd met magnetische Targeting (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Leer een veilig niet-viraal protocol voor genetische modificatie van CD133+ hematopoëtische stamcellen met magnetische polyplex-transfectie. Deze methode behoudt cel eigenschappen en maakt MRI-monitoringsmogelijkheden voor regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door het federale ministerie van onderwijs en onderzoek Duitsland (FKZ 0312138A en FKZ 316159), de staat Mecklenburg-Voorpommeren met EU-structuurfondsen (ESF/IVWM-B34-0030/10 en ESF/IVBM-B35-0010/12) en de DFG (DA1296/2-1), de Duitse Hartstichting (F/01/12), de goedgekeurd (VIP + 00240) en de VOCHTIGE Foundation. Bovendien, worden F.H. en P.M. ondersteund door het FORUN programma van Rostock Universiteit medisch centrum (889001).

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

In de afgelopen jaren, CD133+ SCs opgedoken als een veelbelovende celpopulatie voor SC gebaseerde therapieën zoals blijkt uit verschillende fase I, II en III klinische proeven43,44,45,46, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 ...

CD133+ SCs vertegenwoordigen een heterogene stam en progenitor cel bevolking met het veelbelovende potentieel voor regeneratieve geneeskunde. Hun hematopoietische, endotheel en myogenic differentiatie potentiële1,2,3 maakt de CD133+ cellen, bijvoorbeeldbij te dragen tot neovascularization processen door middel van differentiatie in nieuw vorming van vaartuigen en activering van pro-angiogenic signalering door paracrine mechanismen4,5,6,7.
Ondanks hun hoge potentieel aangetoond in meer dan 30 erkende klinische proeven (ClinicalTrails.gov), is hun therapeutische resultaat nog steeds onder de controversiële discussie4. Inderdaad, een klinische toepassing van SCs wordt belemmerd door lage retentie in het orgel van belang en massale eerste cel dood5,8,9. Extra engineering van CD133+ SCs voorafgaande transplantatie kan helpen deze uitdagingen.
Een voorwaarde voor een efficiënte celtherapie zou de verlaging van de massale eerste celdood ter verbetering van de engraftment van therapeutische relevante cellen10. Huidige studies aangetoond een immense cel verlies van 90-99% in zeer geperfundeerd organen zoals de hersenen en het hart tijdens de eerste 1-2 h, onafhankelijk van de getransplanteerde celtype of toepassing route11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21. SC labelen met behulp van magnetische nanodeeltjes (MNPs) kan een niet-invasieve innovatiestrategie op target cellen op de site van belang22,23,24,25,26 en tegelijkertijd zorgt voor de cel opvolging met behulp van MRI27 en magnetische deeltjes imaging (MPI). De meest efficiënte in vivo studies toepassen gemagnetiseerde cel gericht op behoud van de gebruikte cel na lokale toediening boven cel begeleiding na intraveneuze injectie23,24,28 . Daarom is onze fractie ontworpen een levering systeem bestaande uit superparamagnetische ijzeroxide nanodeeltjes29. Met deze techniek, CD133+ SCs en menselijke navelstreng ader endotheliale cellen (HUVECs) kunnen efficiënt worden gericht, zoals blijkt uit in vitro probeert30,31.
Een andere hindernis voor SC therapieën is de vijandige inflammatoire omgeving van het getroffen weefsel na de transplantatie, die tot de eerste cel dood32 bijdraagt. Naast verschillende studies van de pre-conditionering was de toepassing van therapeutische relevante miRs geteste33; succesvol is gebleken dat anti-apoptotic miRs apoptosis in vitro remmen en cel engraftment in vivo33 verbeteren. Deze kleine molecules, samengesteld uit de 20-25 nucleotiden, spelen een cruciale rol als posttranscriptional modulatoren van messenger RNAs (mRNAs) en dus beïnvloeden stamcel lot en gedrag34. Bovendien voorkomen de exogene invoering van miRs de ongewenste stabiele integratie in de host genoom34.
Huidige pogingen voor efficiënte binnenbrengen van nucleic zuren (NAs) primaire SCs zijn meestal gebaseerd op recombinante virussen8,35. Ondanks de hoge transfectie efficiëntie presenteert recombinante virus manipulatie een groot obstakel voor een vertaling van de Bank-naar-bed, bijvoorbeeld, oncontroleerbare genexpressie, pathogeniteit, immunogeniciteit en dat mutagenese35 ,,36. Dus, niet-virale levering systemen zoals polymeer gebaseerde constructies zijn kritisch te ontwikkelen. Onder degenen, polyethylenimine (PEI) vertegenwoordigt een geldige leveringsvoertuig biedt voordelen voor miRs zoals nb condensatie te behoeden voor degradatie, cellulaire opname, en intracellulaire release via endosomal ontsnappen37,,38. MiR-PEI complexen blijkt bovendien een hoge biocompatibiliteit in klinische proeven39. Daarom onze levering systeem bestaat uit een biotinyleerd vertakte 25 kDa PEI gebonden aan een daar beklede MNP-core30,31,40.
In dit manuscript, presenteren wij een uitgebreide protocol beschrijven (i) de handmatige Isolatievan CD133+ SC van de donatie van menselijke beenmerg (BM) met een gedetailleerde karakterisering van het product van de SC en (ii) een efficiënte en zachte transfectie strategie van een Magnetisch niet-virale polymeer gebaseerde expresbezorgingssysteem voor genetische manipulatie van CD133+ SCs miRs gebruiken. CD133+ SCs zijn geïsoleerd en magnetisch verrijkt van menselijke sternale BM aangeblazen met behulp van een oppervlakte antilichaam gebaseerde magnetische-geactiveerde cel sorteren (MACS) systeem. Daarna worden de levensvatbaarheid van de cellen, alsook de zuiverheid van de cel geanalyseerd met behulp van stroom cytometry. Vervolgens, miR/PEI/MNP complexen zijn bereid en CD133+ SCs zijn transfected. 18 h na transfectie, de opname doeltreffendheid en het effect van transfectie op SC marker expressie en cel levensvatbaarheid worden geanalyseerd. Bovendien is evaluatie van de intracellulaire verdeling van de transfectie complexe verbindingen wordt uitgevoerd met behulp van vierkleuren labeling en gestructureerde verlichting microscopie (SIM).

<table><tbody><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid with Methylene Blue</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7060</td><td>3%</td></tr><tr><td>anti-CD133/2-PE (clone: 293C3)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-090-853</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD34-FITC (clone: AC136)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-081-001</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1)</td><td>BD Biosciences</td><td>560178</td><td></td></tr><tr><td>rhodamine dye; Atto 565 dye conjugated to biotin</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 565-71</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS LSRII flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software 6.1.2</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>CD133 antibody-linked superparamagnetic iron dextran particles; CD133 MicroBead Kit</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-097-049</td><td></td></tr><tr><td>collagenase B</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>11088831001</td><td></td></tr><tr><td>counting chamber</td><td>Paul Marienfeld GmbH &amp; Co. KG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyanine 3 dye labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1</td><td>Ambion</td><td>AM17120</td><td></td></tr><tr><td>Cyanine 5 dye miR labelling kit; Cy5 dye Label IT miRNA Labeling Kit</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 9650</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>10104159001</td><td>(100 U/mL)</td></tr><tr><td>ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FcR Blocking Reagent, human</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>bright green protein labeling kit; Oregon Green 488 Protein Labeling Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>O10241</td><td></td></tr><tr><td>aqueous mounting medium; Fluoroshield</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>F6182</td><td></td></tr><tr><td>density gradient centrifugation tube; Leukosep Centrifuge Tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>89048-932</td><td></td></tr><tr><td>MACS magnet holder; MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MACS pre-separation filter</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-041-407</td><td>30 &micro;m</td></tr><tr><td>MACS separation column (MS / LS)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-201 / 130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS permanent magnet; MACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV PVDF Filter</td><td>Merck</td><td>SLHV013SL</td><td>0.45 &mu;m</td></tr><tr><td>mouse IgG 2b-PE</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-092-215</td><td></td></tr><tr><td>amine reactive dye; Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>human lymphocyte separating medium; Pancoll</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-60500</td><td>density: 1.077 g/mL</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-53500</td><td>without Ca and Mg</td></tr><tr><td>PEI</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>408727</td><td>branched; 25 kDa</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>100 U/mL, 100 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Merck Schuchardt OHG</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>unlabelled precursor miR; Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1</td><td>Ambion</td><td>AM17110</td><td></td></tr><tr><td>RBC lysis buffer</td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>RNAse decontamination solution; RNaseZap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>human lymphocyte medium; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-16500</td><td></td></tr><tr><td>recombinant human cytokine supplement; StemSpan CC100</td><td>Stemcell Technologies</td><td>2690</td><td></td></tr><tr><td>serum-free haematopoietic cell expansion medium; StemSpan H3000</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9800</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles</td><td>Promega Corporation</td><td>Z5481</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue solution</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>T8154</td><td>0.4 %</td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td>0.5 M; pH 8.0</td></tr><tr><td>ZEN2011 software</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonorex RK 100 SH sonicating water bath</td><td>Bandelin electronic</td><td></td><td>Ultrasonic nominal output: 80 W; Ultrasonic frequency: 35 kHz</td></tr></tbody></table>

protocol voor microrna overdracht naar volwassen beenmerg-afgeleide hematopoietische stamcellen om cel engineering gecombineerd met magnetische targeting

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Terwijl CD133+ hematopoietische stamcellen (gcv) zijn bewezen om hoog potentieel op het gebied van regeneratieve geneeskunde, hun lage retentie tarieven na injectie in benadeelde weefsels, alsmede de waargenomen massale cel dood tarieven leiden tot zeer beperkte therapeutische effecten. Deze beperkingen wilt opheffen, we geprobeerd om een niet-virale gebaseerd protocol voor geschikt cel engineering voorafgaand aan hun administratie. De wijziging van menselijke CD133+ uiten van SCs met behulp van magnetische polyplexes microRNA (miR) geladen werd behandeld met betrekking tot de opname efficiëntie en veiligheid alsmede de targeting mogelijkheden van de cellen. Een beroep op ons protocol, kunnen wij hoge miR opname tarieven van 80-90% terwijl de CD133+ stamcel eigenschappen blijven onaangetast. Bovendien, deze gewijzigde cellen bieden de mogelijkheid van magnetische targeting. Hier beschrijven we een veilige en zeer efficiënte procedure voor de wijziging van de CD133+ SCs. Wij verwachten dat deze aanpak om een standaardtechnologie voor optimalisatie van de cel van de stam van de therapeutische effecten en voor de controle van het product door de overheid gereguleerde cel via magnetische resonantie beeldvorming (MRI).

Het gepresenteerde protocol beschrijft een handmatige isolatie en magnetische verrijking van menselijke BM afkomstige CD133+ SCs met een latere virus onafhankelijke cel engineering strategie, als een niet-invasieve technologie voor in vitro cel manipulatie en in vivo controlehulpmiddel.
Deze technologie van de isolatie van drie-stap staat een scheiding van multinationals van de vooraf verteerd sterna...

Dit protocol illustreert een veilige en efficiënte procedure voor het wijzigen van de CD133+ hematopoietische stamcellen. De voorgestelde niet-virale, magnetische polyplex gebaseerde benadering verschaffen een basis voor de optimalisatie van de cel van de stam van de therapeutische effecten ook monitoring van het product door de overheid gereguleerde cel via magnetische resonantie beeldvorming.

Protocol voor MicroRNA overdracht naar volwassen beenmerg-afgeleide hematopoietische stamcellen om cel Engineering gecombineerd met magnetische Targeting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Ons protocol kan sleutelvragen beantwoorden op het gebied van regeneratieve geneeskunde, zoals of cellen kunnen worden verbeterd voor de gunstige eigenschappen en of ze kunnen worden gericht naar de gewenste locatie. Een belangrijk voordeel van ons protocol is het feit dat de cellen tijdelijk genetisch kunnen worden gemanipuleerd met behulp van onze niet-virale transfectiemethode, waardoor de eigenschappen van de cellen behouden blijven. De methode van Sauter kan inzicht bieden in de modificatie van hematopoëtische stamcellen die kan worden toegepast op andere celtypen die worden gebruikt voor transplantatie, zoals mesenchymale stamcellen.Om het protocol te starten, verwarm menselijk lymfocytmedium voor tot kamertemperatuur en ontdooi Collagenase B en DNase. Verzamel het beenmerg, of BM, in een conische buis van 50 milliliter. Gooi eventuele bestaande stolsels weg.Neem een BM-monster van 200 microliters voor latere flowcytometrische analyse. Bewaar het monster op vier graden Celsius totdat het nodig is. Breng vervolgens tien milliliter BM over in een nieuwe conische buis van 50 milliliter en voeg zes milliliter PBS EDTA, 20 milliliter menselijk lymfocytmedium, 175 microliters Colla

protocol-for-microrna-transfer-into-adult-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Combinatorische 5 fluorescerende eiwitten markering van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen maakt in vivo klonale volgen via confocale en twee-foton microscopie, het verstrekken van inzicht in het beenmerg hematopoietische architectuur tijdens de regeneratie. Deze methode maakt het mogelijk niet-invasieve lot in kaart brengen van spectraal-gecodeerde HSPCs-afgeleide cellen in intacte weefsels voor langere perioden na de transplantatie.

In vivo Klonale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen Gekenmerkt door Five fluorescerende eiwitten met behulp van confocale microscopie en Multiphoton

Gerichte celbezorging is nuttig in een verscheidenheid aan biomedische toepassingen. Het doel van dit protocol is om superparamagnetische ijzeroxide nanodeeltjes (SPION) te gebruiken om cellen te labelen en daardoor magnetische celaanpakbenaderingen mogelijk te maken voor een hoge mate van controle over celbezorging en -lokalisatie.

Cel Labeling en Targeting met superparamagnetische ijzeroxide Nanodeeltjes

Chondrogenese uit stamcellen vereist fine tuning van de kweekomstandigheden. Hier presenteren we een magnetische aanpak voor het condenseren van cellen, een essentiële stap om chondrogenese te initiëren. Bovendien tonen wij aan dat dynamische rijping in een bioreactor zijn mechanische stimulatie van de cellulaire constructen en verbetert kraakbeenachtige extracellulaire matrix productie.

3D Magnetic Stem Cell Samenvoeging en Bioreactor rijping voor het herstel van kraakbeen

Dit manuscript beschrijft de efficiënte, niet-virale aflevering van miR aan endotheelcellen door een PEI / MNP vector en de magnetisatie. Dus behalve genetische modificatie, deze benadering voor magnetische cellen leiding en MRI detecteerbaarheid. De techniek kan worden gebruikt om de kenmerken van de therapeutische cel producten te verbeteren.

voorbereiding en<em&gt; In Vitro</em&gt; Karakterisering van Magnetische miR-gemodificeerde endotheelcellen

Dit protocol beschrijft de voorbijgaande genetische manipulatie van tandheelkundige stamcellen gewonnen uit de menselijke tandheelkundige follikel. De toegepaste niet-virale wijziging strategie kan een basis voor de verbetering van de cel van de stam van de therapeutische producten geworden.

Isolatie, karakterisering en MicroRNA gebaseerde genetische modificatie van stamcellen van menselijke tandheelkundige follikel

We beschrijven het gebruik van hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT) te beoordelen van de kwaadaardige potentieel van genetisch gemanipuleerde hematopoietische cellen. HSCT is handig voor de evaluatie van verschillende kwaadaardige hematopoietische cellen in vivo , alsmede het genereren van een grote cohort van muizen met myelodysplastic syndromes (MDS) of leukemie ter evaluatie van nieuwe therapieën.

Gebruik van hematopoietische stamceltransplantatie te beoordelen van de oorsprong van myelodysplastisch syndroom

Het doel van dit protocol is het isoleren van niet-menselijke primaten CD34+ cellen uit primer beenmerg, gen-wijzigen van deze cellen met lentivirale vectoren, en voor te bereiden een product infusie in de autologe host. Het protocol van de totale lengte is ongeveer 48 uur.

Voorbereiding en genetische modificatie van Nonhuman primaat hematopoietische stamcellen en voorlopercellen

Beschreven zijn protocollen voor de zeer efficiënte genoom bewerking van muriene hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPC) door het CRISPR/Cas9-systeem om snel muismodel systemen te ontwikkelen met hematopoietische systeemspecifieke genmodificaties.

Lentivirale CRISPR/Cas9-gemedieerde genoom bewerking voor de studie van hematopoietische cellen in ziekte modellen

Het huidige protocol beschrijft een geoptimaliseerde hematopoietische stam- en voorlopercel (HSPC) kweekprocedure voor de robuuste engraftment van gen-bewerkte cellen in vivo.

CRISPR/Cas9-genbewerking van hematopoietische stam- en voorlopercellen voor gentherapietoepassingen

Dit protocol beschrijft de procedure voor genoombewerking in van beenmerg afgeleide macrofagen van muizen met behulp van Cas9-sgRNA ribonucleoproteïnecomplexen die in vitro zijn geassembleerd en door elektroporatie worden afgeleverd.

Zeer efficiënte genverstoring in primaire beenmerg-afgeleide macrofagen met behulp van geëlektropoleerde Cas9-sgRNA-complexen

Dit protocol beschrijft de intrafemorale injectie van enkele hematopoëtische of leukemische stamcellen, waaronder gen-bewerkte cellen, in muizenxenotransplantaatmodellen, die niet alleen de snelle en veilige transplantatie van cellen mogelijk maken, maar ook seriële analyses van het beenmerg.

Vereenvoudigde intrafemorale injecties met levende muizen maken continue beenmerganalyse mogelijk

Leer een veilig niet-viraal protocol voor genetische modificatie van CD133+ hematopoëtische stamcellen met magnetische polyplex-transfectie. Deze methode behoudt cel eigenschappen en maakt MRI-monitoringsmogelijkheden voor regeneratieve geneeskunde.

Protocol voor MicroRNA overdracht naar volwassen beenmerg-afgeleide hematopoietische stamcellen om cel Engineering gecombineerd met magnetische Targeting (Video) | JoVE Journal

Protocol voor MicroRNA overdracht naar volwassen beenmerg-afgeleide hematopoietische stamcellen om cel Engineering gecombineerd met magnetische Targeting

Meer video's verkennen