Generatie van High-Throughput driedimensionale Tumor spheroïden voor Drug Screening
5 september 2018
Over een breed scala van indicaties van de ziekte, meer fysiologisch relevante modellen worden ontwikkeld en uitgevoerd in drug discovery-programma's. Het nieuwe modelsysteem hier beschreven demonstreert hoe driedimensionale tumor spheroïden kunnen worden gekweekt en vertoond in een high-throughput 1536-well plaat-gebaseerd systeem om te zoeken naar nieuwe oncologie drugs.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van geneesmiddelontdekking, zoals, wat is de meest relevante weefselkweekomgeving voor hit to lead identificatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het het kweken van cellen in drie dimensies mogelijk maakt, op een snel doorvoerende manier, met behulp van 1536 putjesplaatjes. Kalyani Gampa, een senior wetenschapper uit mijn lab, zal dit protocol demonstreren.
Om een 3D tumor sfeercultuur op te zetten, scheidt u de belangrijke kankercellijnen met drie wasbeurten van BBS. Gevolgd door de toevoeging van één milliliter trypsine per vijf centimeter vierkante gebied van de kweekflacon. Na vijf minuten, neutraliseert u het trypsine met vijf keer het volume van serum aangevuld medium in elke flacon, en telt u de cellen.
Gebruik een gesteriliseerde, kleine roestvrijstalen punt cassette met een peristaltiek pomp gebaseerd systeem om een totaal van 500 cellen in acht microliter sfeermedium in elke put van een 1.536 putjesplaatje met weefselkweekbehandeling te zaaien. Gebruik vervolgens een ademende kleefbare plaatsealer om de plaat te bedekken. En plaats de plaat in een draaiende incubator ingesteld op 37 graden Celsius en 10rpm met 5% koolstofdioxide en 95% relatieve luchtvochtigheid gedurende drie dagen.
De meest kritische stap is ervoor te zorgen dat de platen goed afgesloten zijn voordat ze in de incubator worden geplaatst. De sferoïden hebben drie dagen nodig om zich te vormen en deze stap voorkomt mediumverdamping. Aan het einde van de incubatie, draai de kankerlijnen cultuurplaten snel bij 100 maal de zwaartekracht om eventuele condensatie te verzamelen, en verwijder de kleefseals.
Plaats elke plaat die behandeld moet worden op een akoestische dispenser ingesteld om een totaal van acht nanoliter van elke verbinding te leveren. Verdun tot een eindconcentratie van 0,1% DMSO per put, en een topverbinding dosis van 10 micromolar. Wanneer de verbinding is toegevoegd aan de juiste platen, plaats een op maat gemaakte, roestvrijstalen celkweekdeksel op elke plaat om verdamping te voorkomen, en plaats de platen terug in de draaiende incubator voor nog eens vijf dagen.
Aan het einde van de incubatie, voeg drie microliter voorverwarmd cel lysis reagens toe, aangevuld met luciferine, aan elke put van elke celkweekplaat. En incubeer de platen bij kamertemperatuur gedurende ten minste 15 minuten. Vang vervolgens de ATP luminescentie op een plaat luminometer op.
Wanneer alle platen zijn geanalyseerd, extraheer de ruwe gegevens van het instrument en normaliseer alle velden die de testverbindingen bevatten naar het gemiddelde van alle putten die alleen DMSO bevatten als neutrale controle. De procentuele groeiremming van elke verbinding kan vervolgens worden berekend volgens de formule, en dosisresponscurven en remmende IC50's kunnen worden gegenereerd. Een verscheidenheid aan gevestigde kankercellen waarvan bekend is dat ze goed groeien onder 2D kweekomstandigheden, vormden ook 3D structuren toen ze werden gekweekt zoals net gedemonstreerd, ondanks hun morfologische verschillen.
Bij gebruik voor grootschalige screening kan differentiële verbindingsgevoeligheid tussen culturen die in 2D zijn gekweekt versus die in 3D worden waargenomen. Met elke stip die de remmende concentratie van een enkele verbinding vertegenwoordigt waarvoor een 50% celdoodrespons wordt waargenomen in beide kweekinstellingen. In dit representatieve experiment waren beide geteste RAF kinase remmende verbindingen krachtiger in 3D omstandigheden in een non-kleincellige longkanker lijncultuur die een activerende mutatie in het KRAS-eiwit bevat.
De verbindingen vertonen echter een vergelijkbare potentie in zowel 3D sfeer en 2D colon kanker lijnculturen die een G13D activerende mutatie in KRAS bevatten. De 3D-assay maakt ook observatie van het paradoxale groeiaктивation-fenomeen mogelijk, dat optreedt wanneer er een onvolledige remming van RAF-dimeers is in sterk geactiveerde RAF-mutant lijnen, zoals blijkt uit celgroei bij lage concentraties van het medicijn, dat wordt onderdrukt bij hoge concentraties. Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van kankergeneesmiddelontdekking om alternatieve kweekomstandigheden te verkennen voor het identificeren van nieuwe, effectieve chemische stoffen tegen bekende doelen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een nieuwe methode voor geneesmiddelenonderzoek met behulp van driedimensionale tumorsferoïden, gekweekt in een high-throughput 1536-well plaat systeem. Deze aanpak is erop gericht de relevantie van weefselkweekomstandigheden bij het identificeren van potentiële oncologische geneesmiddelen te verbeteren.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Oncologie
- Medicijnontwikkeling
- Celkweektechnieken
Achtergrond
- Traditionele tweedimensionale celculturen slagen er vaak niet in om de tumoromgeving na te bootsen.
- Driedimensionale culturen bieden een fysiologisch relevanter model voor het bestuderen van kanker.
- High-throughput screening is essentieel voor een efficiënte geneesmiddelenontwikkeling.
- Deze studie richt zich op het optimaliseren van de kweek van tumorsferoïden.
Doel van de studie
- Om een high-throughput methode te ontwikkelen voor het kweken van tumorsferoïden.
- Om de relevantie van dit model bij het ontdekken van geneesmiddelen te beoordelen.
- Om de identificatie van nieuwe oncologische geneesmiddelen te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Het loskoppelen van kankercellijnen met behulp van BBS-wassingen.
- Het gebruik van trypsine voor celdetachering en neutralisatie met serum-gesupplementeerd medium.
- Het kweken van cellen in een 1536-well plaatformaat.
- Het screenen naar potentiële kandidaat-geneesmiddelen op een high-throughput wijze.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt een efficiënte kweek van 3D-tumorsferoïden mogelijk.
- High-throughput mogelijkheden maken een snelle screening van kandidaat-medicijnen mogelijk.
- Aangetoonde relevantie van het 3D-kweekmodel bij geneesmiddelenontwikkeling.
- Potentieel om het proces van hit-to-lead identificatie te verbeteren.
Conclusies
- Deze 3D-tumorsferoïde-kweekmethode verbetert de inspanningen voor geneesmiddelenonderzoek.
- Het biedt een nauwkeurigere weergave van de tumorbiologie.
- Deze benadering kan leiden tot de identificatie van nieuwe oncologische therapieën.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Deze methode overbrugt de translationele kloof in de ontdekking van oncologische geneesmiddelen door high-throughput screening mogelijk te maken in een fysiologisch relevant 3D-tumorsferoïdemodel. Het vergroot het voorspellend vertrouwen bij de validatie van targets door differentiële drugresponses tussen 2D- en 3D-kweekcondities bloot te leggen. De aanpak optimaliseert de hit-to-lead identificatie voor MAPK-pathway-remmers in genetisch gedefinieerde kankermodellen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken in een ziekterelevant systeem dat 3D-cellulaire interacties en ruimtelijke organisatie vastlegt.
- Operationele waarde: Ondersteunt mechanische risicoreductie door de effectiviteit van verbindingen in 2D- versus 3D-culturen te vergelijken om contextafhankelijke activiteit te identificeren.
- Predictieve waarde: Faciliteert de identificatie van lead-verbindingen door differentiële gevoeligheid te detecteren in KRAS-mutante modellen van niet-kleincellige longkanker onder 3D-condities.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een gestandaardiseerd, reproduceerbaar 3D-cultuursysteem dat compatibel is met 1536-wells formats voor grootschalige screening van verbindingen.
- Operationele waarde: Maakt kwantitatieve ATP-gebaseerde luminescentiemetingen mogelijk om groeiremming te bepalen en dosis-responscurves en IC50-waarden te genereren.
- Assay-gereedheid: Maakt gebruik van akoestische dispensering voor nauwkeurige levering van verbindingen in nanoliters en gesloten incubatie om verdamping te voorkomen, waardoor de integriteit van de assay wordt gewaarborgd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Slaat een brug tussen discovery- en preklinische workflows door tumor-stroma-interacties en condities die lijken op de extracellulaire matrix in een schaalbaar formaat te modelleren.
- Risico-gecorrigeerde Vooruitgang: Maakt observatie mogelijk van paradoxale groeiactivatie in RAF-dimeermutanten, wat bijdraagt aan combinatietherapiestrategieën en het risico van klinische kandidaten vermindert.
- Biomarker-afstemming: Ondersteunt de evaluatie van pathway-specifieke remmers (bijv. MAPK) in genetisch gedefinieerde achtergronden om het genotype te correleren met de drugrespons.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie tot leadidentificatie, waardoor een vroege beoordeling van de effectiviteit van verbindingen in een fysiologisch relevantere context mogelijk is voordat er wordt geïnvesteerd in preklinisch onderzoek.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door aan te tonen hoe 3D-kweek de druggevoeligheid beïnvloedt in oncogene-gestuurde modellen, zoals KRAS-mutant NSCLC.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid en reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde sferoïdvorming in 1536-well platen met gecontroleerde incubatie- en afsluitingsprotocollen.
- Analytiek: Maakt kwantitatieve meting van de afhankelijke variabele mogelijk via ATP-luminescentienormalisatie ten opzichte van DMSO-controles, wat de berekening van de IC50 en comparatieve potentieanalyse faciliteert.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinische continuïteit door de ruimtelijke tumorarchitectuur en clonale interacties te modelleren die afwezig zijn in 2D-systemen.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbaar platform voor het screenen van diverse kankercellijnen en compound-bibliotheken gericht op geconserveerde pathways zoals MAPK.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door mechanistische ambiguïteit te verminderen via directe vergelijking van 2D- en 3D-medicijnresponsen.
- Operationele waarde: Biedt standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid via robotcompatibele workflows met 1536-well platen en verzegelde incubatie.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go beslissingen door verbindingen met contextspecifieke activiteit te identificeren, waardoor biologische risico's in een laat stadium worden verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van leads mogelijk op basis van differentiële effectiviteit in fysiologisch relevante modellen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in 3D-celkweektechnieken, waaronder trypsinneutralisatie, cel telling en steriele uitplating.
- Is afhankelijk van instrumentatie zoals cassette-systemen op basis van peristaltische pompen, akoestische dispensers, roterende incubatoren en plateluminometers.
- Necessiteert cross-team standaardisatie van sealingsprotocollen, incubatieparameters (37°C, 10rpm, 5% CO2, 95% vochtigheid) en datanormalisatieprocedures.
- Omvat overwegingen voor adaptatie aan verschillende kankercellijnen, aangezien de efficiëntie van sferoïdvorming kan variëren ondanks succesvolle vorming in gevestigde lijnen.
- Omvat praktische beperkingen zoals de noodzaak om verdamping tijdens langdurige incubaties te voorkomen en de optimalisatie van verbindingdosering in nanoliter-volumes.
