Name: Generatie van High-Throughput driedimensionale Tumor spheroïden voor Drug Screening (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-05T15:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Leer hoe je driedimensionale tumorsferoïden kweekt in een 1536-well plaat voor high-throughput drug screening in oncologisch onderzoek. Deze methode verbetert de identificatie van nieuwe kankertherapieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs wil erkennen Marc Ferrer aan het National Center for Advancing translationeel Sciences, National Institutes of Health voor zijn steun en begeleiding op de initiële ontwikkeling van deze tests. Daarnaast zouden we graag bedanken Alyson Freeman, Mariela Jaskelioff, Michael Acker, Jacob Haling en Vesselina Cooke voor hun wetenschappelijke inbreng en discussie als project teamleden.

1. het kweken van 1536-well 3D Tumor spheroïden
<ol><li>Voorbereiding van een verse 3D tumor sferoïde middellange stam (cel medium + knock-out serum vervanging insuline-transferrine-selenium) door de volgende reagentia toe te voegen aan 500 mL Dulbecco van bewerkt Eagles Medium (DMEM/F12): 1 x penicilline/streptomycine, 10 ng/mL van de mens fundamentele fibroblast groeifactor (bFGF), 20 ng/mL van menselijke epidermale groeifactor (EGF), 0,4% bovien serumalbumine (BSA) (deel V), 1 x insuline-transferrine-selenium, en 1% knock-out (KO) serum vervanging (doen niet bevriezen-ontdooien).</li>
	<li>Filter-steriliseren het gehele medium met de supplementen via een 0.4 µm fles-top-filtersysteem.</li>
	<li>Loskoppelen van de cellijnen van kanker, die zijn gegroeid volgens aanbevolen routine kweekomstandigheden, van de traditionele cultuur van de cel kolven door wassen ze 3 x met 1 x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en het toevoegen van een geschikte hoeveelheid van een 0,25% trypsine (1 mL per 5 cm2) gedurende 5 minuten om te maken van een dun laagje over de gewenste cellen. Neutraliseren van de trypsine met 5 x het bedrag van het medium met het serum en overgaan tot de cellen tellen. Gebruik bijvoorbeeld 25 mL voedingsbodem voor 5 mL trypsine.</li>
	<li>De concentratie van de oplossing van de cel voor 62,5 x 104 cellen/mL aanpassen om zaad van een totaal van 500 cellen per putje in 8 µL van sferoïde medium in de 1536-well weefsel-cultuur-testgroep platen.</li>
	<li>Seed in een biologische veiligheid kabinet, de cellen een gesteriliseerde, kleine roestvrij-staal-tipped cassette met een peristaltische pomp gebaseerde systeem. Tussen verschillende cellijnen, spoel de slang van de cassette met 1 x PBS en 70% Ethanol voor 10 s.</li>
	<li>U kunt ook zaad de cellen met behulp van een vloeibare handler gelegen binnen een HEPA-gefilterd kamer met behulp van een gesteriliseerde, kleine roestvrij-staal-tipped cassette en een peristaltische pomp of een bijgevoegde-spuitpomp, afhankelijk van het aantal platen per cellijn nodig.</li>
	<li>Het zegel van de platen met behulp van een ademend zelfklevende plaat zegel ofwel handmatig of met behulp van een plaat sealer.</li>
	<li>Plaats de platen in een draaiende incubator vastgesteldop 10 rpm en 37 ° C met 5% kooldioxide (CO2) en 95% relatieve vochtigheid. Toestaan dat de spheroïden naar formulier voor 3 d.</li>
</ol>2. kweken van 1536-well 2D kanker lijnen
Opmerking: De 1536-well 2D kanker lijnen moeten worden gekweekt 24 h vóór de toevoeging van de stof aan de 3D platen.
<ol><li>Een 2D kanker cel medium voor te bereiden door de volgende reagentia tot 500 mL van een geschikte groeimedium voor de geselecteerde regels toe te voegen: 1 x penicilline/streptomycine en 10% foetale runderserum (FBS).</li>
	<li>Filter-steriliseren het gehele medium met de supplementen via een 0.4 µm fles-top-filtersysteem.</li>
	<li>Loskoppelen van de cellijnen van kanker, die zijn gegroeid volgens aanbevolen routine kweekomstandigheden, van de traditionele cultuur van de cel kolven door wassen ze 3 x met 1 x PBS en het toevoegen van een geschikte hoeveelheid van een 0,25% trypsine (1 mL per 5 cm2) gedurende 5 minuten aan Maak een dunne laag over de gewenste cellen. Neutraliseren van de trypsine met 5 x het bedrag van het medium met het serum en overgaan tot de cellen tellen. Gebruik bijvoorbeeld 25 mL voedingsbodem voor 5 mL trypsine.</li>
	<li>De concentratie van de oplossing van de cel voor 62,5 x 104 cellen/mL aanpassen om zaad van een totaal van 500 cellen per putje in 8 µL van volledige medium in 1536-well weefsel-cultuur-testgroep platen.</li>
	<li>Seed in een biologische veiligheid kabinet, de cellen een gesteriliseerde, kleine roestvrij-staal-tipped cassette met een peristaltische pomp gebaseerde systeem. Tussen de verschillende cellijnen, spoel de slang van de cassette met 1 x steriele PBS en 70% Ethanol voor 10 s.</li>
	<li>U kunt ook zaad de cellen met behulp van een vloeibare handler gelegen binnen een HEPA-gefilterd robotica-kamer met behulp van een gesteriliseerde, kleine roestvrij-staal-tipped cassette en een peristaltische pomp of de bijgevoegde-spuitpomp, afhankelijk van het volume van de platen per cel lijn nodig.</li>
	<li>Het zegel van de platen met behulp van een ademend zelfklevende plaat zegel ofwel handmatig of met behulp van een plaat sealer.</li>
	<li>Plaats de platen in een draaiende incubator vastgesteldop 10 rpm en 37 ° C gedurende 24 uur vóór de samengestelde toevoeging, met 5% CO2 en 95% relatieve vochtigheid.</li>
</ol>3. samengestelde toevoeging
<ol><li>Maak 8-punts, 3 katernen seriële verdunningen van MAPK remmers in 100% dimethylsulfoxide (DMSO) op een vloeistof-handling robot met de hoogste concentratie van een 10 mM. Het proteasoom-remmers Bortezomib wordt gebruikt als positieve controle voor een volledige cel doden om te bepalen van het dynamisch bereik van de bepaling.</li>
	<li>Quick-spin all assay platen en samengestelde platen op 100 x-g te verzamelen condensatie. De Zelfklevende zegel uit elke plaat verwijderen en plaatsen van een plaat op een akoestische dispenser set-up om toe te voegen voor een totaal van 8 nL van elke stof/verdunning vertegenwoordigen een eindconcentratie van 0,1% DMSO per putje en een top samengestelde dosis van 10 µM.</li>
	<li>Nadat de toevoeging van de verbinding is voltooid, plaats de deksel van een op maat gemaakte, roestvrij stalen cel-cultuur die voorkomt verdamping op de plaat en plaats van de plaat in een incubator van de spinnen bij 37 ° C voor 5 d, met 5% CO2 en 95% relatieve vochtigheid.</li>
</ol>4. detectie reagens toevoeging en de verwerving van Raw-gegevens
<ol><li>Vooraf warm een voldoende volume van lysis van de cel reagens met luciferine om te detecteren veranderingen in adenine adenosinetrifosfaat (ATP) en, dus, veranderingen in de celproliferatie bij kamertemperatuur of in een waterbad 37 ° C. Een totaal van 3 µL van het detectie-reagens toevoegen aan elk putje gebruik een peristaltische pomp en Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende ten minste 15 minuten.</li>
	<li>Het vastleggen van de luminescentie op een plaat luminometer.</li>
</ol>5. de verwerking van de gegevens
<ol><li>Pak de onbewerkte gegevens van het instrument en normaliseren van alle velden die bevatten test verbindingen met het gemiddelde van alle putjes met DMSO alleen als het neutrale besturingselement. Van deze waarde, berekenen de percentage groeiremming van elke stof. Dit is voltooid met behulp van de formule functie in Microsoft Excel waar f (x) = {(genieten van de relatieve waarde licht eenheden (RLUs) / (gemiddelde DMSO waarde RLUs) * 100)}.</li>
	<li>Het genereren van de dosis / respons-curven en remmende IC50s door de waarden van de genormaliseerde gegevens uit stap 5.1 tegen de samengestelde concentratie met behulp van een grafische programma graphing. Opmerking: We analyseerde de gegevens met behulp van Helios, een interne NIBR softwaretool. Om deze functie te voeren, wij de niet-parametrische kromme Analysetool geselecteerd.</li>
</ol>

<ol><li>Lee, M., Vasioukhin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+polarity+and+cancer--cell+and+tissue+polarity+as+a+non-canonical+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Cell polarity and cancer--cell and tissue polarity as a non-canonical tumor suppressor.</a> Journal of Cell Science. 121 (Pt 8), 1141-1150 (2008).</li>
<li>Nath, S., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+systems+in+cancer+research%3A+Focus+on+tumor+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model.</a> Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).</li>
<li>Weigelt, B., Ghajar, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+need+for+complex+3D+culture+models+to+unravel+novel+pathways+and+identify+accurate+biomarkers+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 69, 42-51 (2014).</li>
<li>Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+overlay+culture+models+of+human+breast+cancer+reveal+a+critical+sensitivity+to+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 332 (3), 821-828 (2010).</li>
<li>Li, L., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+a+3D+Culture+System+to+Study+the+Interaction+between+Epithelial+Breast+Cancer+and+Its+Surrounding+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Optimizing a 3D Culture System to Study the Interaction between Epithelial Breast Cancer and Its Surrounding Fibroblasts.</a> Journal of Cancer. 2, 458-466 (2011).</li>
<li>Pickl, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+3D+and+2D+tumor+models+reveals+enhanced+HER2+activation+in+3D+associated+with+an+increased+response+to+trastuzumab%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab.</a> Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).</li>
<li>Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumour+models%3A+novel+in+vitro+approaches+to+cancer+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">3D tumour models: novel in vitro approaches to cancer studies.</a> Journal of Cell Communication and Signaling. 5 (3), 239-248 (2011).</li>
<li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+three-dimensional+%283D%29+models+in+cancer+research%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update.</a> Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).</li>
<li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+pharmacological+profiling+of+3D+tumor+models+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Large-scale pharmacological profiling of 3D tumor models of cancer cells.</a> Cell Death & Disease. 7 (12), e2492(2016).</li>
<li>Polo, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsiveness+to+PI3K+and+MEK+inhibitors+in+breast+cancer.+Use+of+a+3D+culture+system+to+study+pathways+related+to+hormone+independence+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Responsiveness to PI3K and MEK inhibitors in breast cancer. Use of a 3D culture system to study pathways related to hormone independence in mice.</a> PLoS One. 5 (5), e10786(2010).</li>
<li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).</li>
<li>Bhargava, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Registered+report%3A+RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Registered report: RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Elife. 5, e09976(2016).</li>
<li>Mathews, L. A., Hurt, E. M., Zhang, X., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+CpG+promoter+methylation+in+invasive+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of CpG promoter methylation in invasive prostate cancer cells.</a> Molecular Cancer. 9, 267(2010).</li>
<li>Mathews, L. A., Crea, F., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+gene+regulation+in+stem+cells+and+correlation+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Epigenetic gene regulation in stem cells and correlation to cancer.</a> Differentiation. 78 (1), 1-17 (2009).</li>
<li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+DNA+repair+genes+in+invasive+human+pancreatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreas%22%5BJournal%5D)">Increased expression of DNA repair genes in invasive human pancreatic cancer cells.</a> Pancreas. 40 (5), 730-739 (2011).</li>
<li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+1536-well+quantitative+high-throughput+screen+to+identify+compounds+targeting+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).</li>
<li>Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+culture+of+murine+primordial+germ+cells+and+embryonic+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells.</a> Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+SOX9+by+the+NF-kappaB+signaling+pathway+in+pancreatic+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of SOX9 by the NF-kappaB signaling pathway in pancreatic cancer stem cells.</a> Stem Cells. 31 (8), 1454-1466 (2013).</li>
<li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+1536-well+quantitative+high-throughput+screen+to+identify+compounds+targeting+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).</li>
<li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+combinatorial+screening+identifies+drugs+that+cooperate+with+ibrutinib+to+kill+activated+B-cell-like+diffuse+large+B-cell+lymphoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).</li>
<li>Herter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+three-dimensional+heterotypic+spheroid+model+for+the+assessment+of+the+activity+of+cancer+immunotherapy+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">A novel three-dimensional heterotypic spheroid model for the assessment of the activity of cancer immunotherapy agents.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (1), 129-140 (2017).</li>
</ol>

De auteurs zijn werknemers van Novartis, en sommige werknemers zijn ook aandeelhouders.

De hier gepresenteerde methoden aantonen een gedetailleerd protocol over het produceren van tumor spheroïden in 1536-Wells-platen voor grootschalige samengestelde screenings. Deze methoden zijn in eerste instantie aangepast vanaf werk aan het National Cancer Institute, waar de tumor spheroïden werden geteeld in lage-throughput assays in 6-well en 96-wells-platen om vragen te stellen over genetische afhankelijkheden en samengestelde gevoeligheid13, 14 ,...

In het afgelopen decennium hebben meer en meer studies het gebruik van 3D cel cultuur modellen te begrijpen concepten die niet volledig door de groeiende cellen in 2D op plastic zijn gerecapituleerd geïmplementeerd. Voorbeelden van deze concepten zijn de afwisseling in normale epitheliale cel polariteit1 waar de ruimtelijke oriëntatie van apicale en basale lagen van cellen zijn verloren, evenals de rol van de extracellulaire matrix bij het reguleren van de overleving en het lot van de cel. Oncologie onderzoek, heeft in het bijzonder 3D-modellen gebruikt om te begrijpen van de fundamentele biologie van kankercellen en de verschillen tussen 2D en 3D cel cultuur systemen3,4. De ontwikkeling van meer geavanceerde cel cultuur technieken en hun verdere aanpassing aan multi goed formaten heeft de zoektocht naar nieuwe geneesmiddelen in 3D instellingen ingeschakeld. In tegenstelling tot cellen gegroeid onder 2D, 3D-modellen van tumoren variëren in complexiteit verschillen van gelaagde cellulaire systemen5 tot single-cell-type bollen van verschillende grootte, tot complexe multi-cell-type bollen6,7, 8. de ontdekking van nieuwe verbindingen of biologics die krachtig het induceren van celdood in deze 3D-model-systemen is daarom van groot belang in drug ontwikkeling campagnes. Eindpunten van deze tests zijn vaak identiek zijn aan die uitgevoerd in 2D culturen te beoordelen van wijzigingen in celproliferatie, maar wanneer uitgevoerd in een meer fysiologisch relevante omgeving, zij kunnen openbaren de ware niveau van afhankelijkheid van de target-gen of het traject wordt ondervraagd.
Zoals hierboven geïntroduceerde, allerlei modelsystemen zijn ontwikkeld om te studeren drug reacties in 3D cultuur systemen, maar de meeste gebruiken beide 96 of 384-well microtiterplaat platen en zijn niet gemakkelijk aan te passen aan de high-throughput screening (HTS) formaten vaak gebruikt in Drug discovery screening campagnes. Dergelijke systemen omvatten het gebruik van opknoping druppel technologieën, sferoïde culturen, pulserende cellen met magnetische deeltjes ertoe levitatie, en culturen waarin natuurlijke of synthetische gels zoals collageen, Matrigel of polyethyleenglycol (PEG)2 . Hier presenteren we de gedetailleerde methoden van een eerder ontwikkelde techniek om het produceren van 3D sferoïde culturen van gevestigde kanker cellijnen in een formaat van 1536-well plaat. In dit protocol wordt een zeer beschreven medium gebruikt waardoor de bevestiging van normaal aanhangend cel lijnen9. Dit systeem heeft beperkingen (dat wil zeggen, het kan niet volledig recapituleren een complex modelsysteem van kanker), maar toch deze testen een high-throughput screening van grote verzamelingen van kleine moleculen en kruiselings vergelijkingen van drug antwoord inschakelen tussen 2D en 3D culturen tegen allerlei soorten cellijnen en verbindingen.
De cellijnen geselecteerd om aan te tonen van de methoden in dit artikel alle harbor mutaties in de genen aan de MAPK weg, een weg die zeer dysregulated in kanker, signalering gerelateerde en voor welke veel therapieën beschikbaar zijn. Veel van de lijnen hebben activeren oncogene mutaties in het Kirsten Rat Sarcoom virus ook wel genoemd de KRAS, de neuroblastoom RAS of NRI's de Harvey Rat Sarcoom virus oncogen of HRAS en de bijbehorende kinases snel versnelde fibrosarcomen, ook bekend als RAFs. Recente literatuur suggereert dat de inhibitors van verschillende knooppunten van dit traject uniek doeltreffender in een subset van de cellijnen zijn als volwassen onder 3D voorwaarden9,10. Één studie vond toen kankercellen met actieve RAS werden gekweekt in 3D, dat zij een verhoogde gevoeligheid voor MAPK remmers aangetoond, en verder, dat deze aanpak kon identificeren trajecten en gerichte remmers die zou kunnen worden gemist in de traditionele 2D instelling. Het doel van deze studie is om te presenteren van de methoden die voor de cultuur van deze cellijnen en verder, om aan te tonen het verschil reacties op deze remmers die kunnen worden waargenomen, alleen bij het gebruik van 3D cel cultuur systemen.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12</td><td>ATCC</td><td>30-2006</td><td>Aangeschaft als een voorbereide oplossing. Dit recept werd als beter bevonden in vergelijking met andere leveranciers.</td></tr><tr><td>DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td>Aangeschaft als een voorbereide oplossing.</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)</td><td>Lonza</td><td>12-115Q</td><td>Aangeschaft als een voorbereide oplossing.</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td>Aangeschaft als een voorbereide oplossing.</td></tr><tr><td>1x 0.25% Trypsin met Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Hyclone</td><td>SH30042.01</td><td>Aangeschaft als een voorbereide oplossing.</td></tr><tr><td>1x Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>Aangeschaft als een voorbereide oplossing.</td></tr><tr><td>10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF)</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>Opnieuw gesuspendeerd in steriel water.</td></tr><tr><td>20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>Opnieuw gesuspendeerd in steriel water.</td></tr><tr><td>0.4% Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td>Opnieuw gesuspendeerd in steriel PBS en gefilterd.</td></tr><tr><td>1x Insulin Transferrin Selenium (ITS)</td><td>Gibco</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>1% KnockOut (KO) Serum Replacement</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td>Voeg vers toe vlak voor gebruik.</td></tr><tr><td>100% Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>276855-100ML</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo</td><td>Promega</td><td>G7573</td><td>Aangeschaft als een voorbereide oplossing.</td></tr><tr><td>Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small Combi Cassette</td><td>ThermoFisher</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>Small Multiflow Cassette</td><td>BioTek</td><td>294085</td><td></td></tr><tr><td>1536-well sterile TC plates (white)</td><td>Corning</td><td>3727</td><td></td></tr><tr><td>1536-well sterile TC plates (black)</td><td>Corning</td><td>3893</td><td></td></tr><tr><td>Scivax Plates</td><td>MBL International</td><td>NCP-LH384-10</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adhesives seals</td><td>ThermoFisher</td><td>AB0718</td><td></td></tr><tr><td>Spinning Incubator</td><td>LiCONiC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Lids</td><td>The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATS Acoustic Dispensor</td><td>EDS Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Echo Acoustic Dispensor</td><td>Labcyte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Envision-Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic Pump- Multidrop Combi</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid Handler-Multiflow FX</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generatie van high-throughput driedimensionale tumor spheroïden voor drug screening

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Kankercellen hebben routinematig zijn gekweekt in twee dimensies (2D) op een kunststof ondergrond. Deze techniek, mist echter de ware milieu een tumor massa wordt blootgesteld aan in vivo. Solide tumoren groeien niet als verbonden met kunststof blad, maar in plaats daarvan als een verzameling van klonen cellen in een driedimensionale (3D) ruimte interactie met hun buren en met verschillende ruimtelijke eigenschappen zoals de verstoring van de normale cellulaire polariteit. Deze interacties veroorzaken 3D-gekweekte cellen te verwerven van morfologische en cellulaire kenmerken die meer relevant voor in vivo tumoren zijn. Bovendien, een tumor massa is in direct contact met andere celtypes zoals stromale en immuun cellen, evenals de extracellulaire matrix van alle andere celtypes. De matrix gestort bestaat van macromoleculen zoals collageen en fibronectine.
In een poging om de vertaling van de onderzoeksresultaten in Oncologie van bench naar bed, zijn veel groepen begonnen met het gebruik van 3D-modelsystemen in hun drugsstrategieën ontwikkeling onderzoeken. Deze systemen worden verondersteld te zijn meer fysiologisch relevant omdat ze proberen te recapituleren van de complexe en heterogene omgeving van een tumor. Deze systemen, kunnen echter vrij complex en hoewel vatbaar voor groei in 96-Wells-formaten, en sommige nu zelfs in 384, ze weinig mogelijkheden voor grootschalige groei en screening. Dit waargenomen kloof heeft geleid tot de ontwikkeling van de methoden die hier worden beschreven in detail aan cultuur tumor spheroïden in een hoog-productie capaciteit in 1536-Wells-platen. Deze methoden vormen een compromis voor de zeer complexe matrix gebaseerde systemen, die moeilijk op scherm, en conventionele 2D testen. Een verscheidenheid van kanker cellijnen herbergen verschillende genetische mutaties zijn succesvol gescreend, samengestelde werkzaamheid te onderzoeken met behulp van een curator bibliotheek met verbindingen richten de Mitogen-Activated proteïne Kinase of MAPK-pathway. De sferoïde cultuur antwoorden worden dan vergeleken met de reactie van cellen gekweekt in 2D, en differentiële activiteiten worden gemeld. Deze methoden bieden een unieke protocol voor het testen van samengestelde activiteit in een 3D omgeving van hoge gegevensdoorvoer.

Een verscheidenheid van gevestigde kankercel lijnen bekend groeien goed onder 2D kweekomstandigheden werden getest met behulp van de methoden hier. Representatieve beelden uit een verscheidenheid van MAPK mutant kanker cellijnen (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS en KNS-62:HRAS) zijn te zien in Figuur 1. Deze beelden tonen aan dat hoewel de cellijnen verschillende morphologies hebben, elk gevormd 3D structuren in de 1536-well assay-platen. <strong c...

Over een breed scala van indicaties van de ziekte, meer fysiologisch relevante modellen worden ontwikkeld en uitgevoerd in drug discovery-programma's. Het nieuwe modelsysteem hier beschreven demonstreert hoe driedimensionale tumor spheroïden kunnen worden gekweekt en vertoond in een high-throughput 1536-well plaat-gebaseerd systeem om te zoeken naar nieuwe oncologie drugs.

Generatie van High-Throughput driedimensionale Tumor spheroïden voor Drug Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van geneesmiddelontdekking, zoals, wat is de meest relevante weefselkweekomgeving voor hit to lead identificatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het het kweken van cellen in drie dimensies mogelijk maakt, op een snel doorvoerende manier, met behulp van 1536 putjesplaatjes. Kalyani Gampa, een senior wetenschapper uit mijn lab, zal dit protocol demonstreren.Om een 3D tumor sfeercultuur op te zetten, scheidt u de belangrijke kankercellijnen met drie wasbeurten van BBS. Gevolgd door de toevoeging van één milliliter trypsine per vijf centimeter vierkante gebied van de kweekflacon. Na vijf minuten, neutraliseert u het trypsine met vijf keer het volume van serum aangevuld medium in elke flacon, en telt u de cellen.Gebruik een gesteriliseerde, kleine roestvrijstalen punt cassette met een peristaltiek pomp gebaseerd systeem om een totaal van 500 cellen in acht microliter sfeermedium in elke put van een 1.536 putjesplaatje met weefselkweekbehandeling te zaaien. Gebruik vervolgens een ademende kleefbare plaatsealer om de plaat te bedekken. En plaats de plaat in een draaiende incubator ingest

generation-high-throughput-three-dimensional-tumor-spheroids-for-drug

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

We introduceren een protocol voor het aanleggen van grote aantallen (duizenden tot honderdduizenden) van gelijke grootte-en-samenstelling gecontroleerde bolvormige tumoren, met behulp van in de handel verkrijgbare microputjesplaten.

De productie van grote aantallen grote gecontroleerde bolvormige tumoren met behulp microputjesplaten

Invasie van omliggende normale weefsels is een typerend kenmerk van kwaadaardige tumoren. We bieden hier een eenvoudige, semi-geautomatiseerde microplaattest van invasie in een natuurlijke 3D biomatrix die met een aantal modellen van gevorderde menselijke kankers is geëxemplifeerd.

Driedimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Er wordt een protocol gepresenteerd voor robotisch afdrukken van kankercelsferoïden in een 96-wellsplaatformaat met hoge doorvoer met behulp van een waterig tweefasensysteem.

Robotic productie van Cancer Cell sferoïden met een waterige tweefasensysteem voor Drug Testing

Van patiënten afgeleide xenografts van glioblastoma multiforme kunnen worden geminiaturiseerd tot levende microtumoren met behulp van een 3D-menselijke biogel-kweeksysteem. Deze in vivo-achtige 3D-tumortest is geschikt voor het testen van de reactie op geneesmiddelen en moleculair profileren, inclusief kinoomanalyse.

Genereren van Microtumors Met behulp van 3D Human Biogel Cultuur System en Patient afgeleide glioblastoma Cellen voor Kinomic Profiling and Drug Response Testen

Optische coherentie tomografie (OCT), een driedimensionale imaging technologie, werd gebruikt om te controleren en te karakteriseren de kinetiek van de groei van meercellige tumor spheroïden. Precieze volumetrische kwantificering van tumor spheroïden met behulp van een voxel tellen aanpak, en label-vrije dood weefsel detectie in de spheroïden op basis van intrinsieke optische demping daarentegen werden gedemonstreerd.

Longitudinale morfologische en fysiologische Monitoring van driedimensionale Tumor spheroïden met behulp van optische coherentie tomografie

Dit protocol beschrijft het genereren van door patiënten afgeleide spheroïden en downstreamanalyses, waaronder de kwantificering van proliferatie, cytotoxiciteits testen, Flowcytometrie, immunofluorescentie kleuring en confocale beeldvorming, om de geneesmiddelen te beoordelen potentiële kandidaten als anti-neoplastische Therapeutics. Dit protocol ondersteunt precisie geneeskunde met identificatie van specifieke geneesmiddelen voor elke patiënt en stadium van de ziekte.

Fysiologisch patiënt afgeleide 3D-Spheroids voor anti-neoplastische geneesmiddelen screening om kanker stamcellen te targeten

Dit protocol beschrijft een methode voor de productie van drie verschillende soorten sferoïden op een manier die ze geschikt maakt voor grootschalige screening en analyse met een hoog gehalte. Daarnaast worden voorbeelden gepresenteerd die laten zien hoe ze kunnen worden geanalyseerd op sferoïde en individuele celniveaus.

Een robuuste methode voor de grootschalige productie van sferoïden voor screening- en analysetoepassingen met een hoog gehalte

Tumorsferoïden worden steeds vaker gebruikt om tumorcel-micro-omgevingsinteracties en therapierespons te beoordelen. Het huidige protocol beschrijft een robuuste maar eenvoudige methode voor semi-high-throughput beeldvorming van 3D-tumorsferoïden met behulp van snelle optische clearing.

Snelle optische clearing voor semi-high-throughput analyse van tumorsferoïden

Het huidige protocol beschrijft het genereren van 3D-tumorcultuurmodellen van primaire kankercellen en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen met behulp van cel-levensvatbaarheidstests en microscopische onderzoeken.

Het vaststellen van 3-dimensionale sferoïden uit van de patiënt afgeleide tumormonsters en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen

Dit artikel demonstreert een gestandaardiseerde methode voor het construeren van driedimensionale tumorsferoïden. Een strategie voor sferoïde observatie en beeldgebaseerde deep-learning analyse met behulp van een geautomatiseerd beeldvormingssysteem wordt ook beschreven.

Generatie van 3D-tumorsferoïden voor geneesmiddelenevaluatiestudies

Hier zetten we een metabool profileringsplatform op dat driedimensionale (3D) glioomsferoïden integreert met op beeldvorming gebaseerde normalisatie via extracellulaire fluxanalyse. Deze benadering maakt een nauwkeurigere beoordeling mogelijk van tumormetabole reacties op medicamenteuze behandelingen en biedt inzicht in mogelijke resistentiemechanismen.

Vooruitgang in de metabole profilering van driedimensionale hersentumorsferoïden voor screening op geneesmiddelen

Leer hoe je driedimensionale tumorsferoïden kweekt in een 1536-well plaat voor high-throughput drug screening in oncologisch onderzoek. Deze methode verbetert de identificatie van nieuwe kankertherapieën.

Generatie van High-Throughput driedimensionale Tumor spheroïden voor Drug Screening

Meer video's verkennen