Split-BioID — Proteoom analyse van Context-specifieke eiwitcomplexen in hun inheemse cellulaire omgeving

Het algemene doel van deze procedure is om de samenstelling van eiwitcomplexen te onderzoeken die zich specifiek vormen rond een paar van geïnteresseerde, met elkaar interacterende eiwitten met behulp van split-BioID, een eiwitfragment-complementatietest die afstandsafhankelijke eiwit-biotinylering induceert in levende cellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de celbiologie, zoals hoe eiwitcomplexen dynamisch reageren om verschillende cellulaire functies te reguleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de eenvoudige identificatie mogelijk maakt van contextspecifieke eiwitcomplexen in hun natuurlijke cellulaire omgevingen en met zeer hoge resolutie.

Voor de uiteindelijke massaspectrometrische analyse moeten de volgende stappen worden uitgevoerd onder keratinevrije omstandigheden en moeten alle materialen en reagentia zo keratinevrij mogelijk zijn. Na het klonen van de ORF's van twee eiwitten van belang in het split-BioID-plasmide, voert u een tijdelijke transfectie uit en voegt u volgens het tekstprotocol biotine-aanvullend medium toe, gebruik vervolgens PBS om de cellen twee keer te wassen. Voeg 1,5 milliliter PBS toe aan elke plaat en gebruik een schraper om de cellen te oogsten, breng de cellen vervolgens voor elke conditie over naar een aparte 15 milliliter buis en centrifugeer de buizen bij 1.200 keer g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten.

Verwijder de supernatanten en vries de pellets snel in vloeibare stikstof in. Bewaar de buizen vervolgens bij min 80 graden Celsius tot verdere verwerking. Om cellysaten te bereiden, gebruikt u één milliliter RT-lyseringsbuffer om de pellets op te schalken.

Breng vervolgens de cellen 10 tot 20 keer door een naald met 25 gauge. Soniceer vervolgens de monsters. Voeg vervolgens 100 microliter 20% Triton X-100 toe per 900 microliter hersteld sonisch lysaat voor een uiteindelijke concentratie van 2% Voeg 2,3 milliliter 50 millimolair Tris, pH 7,4, per milliliter lysaat toe om de NaCl-concentratie aan te passen tot 150 millimolair voor binding aan streptavidinekralen.

Verdeel vervolgens de aangepaste lysaten in 1,5 milliliter buizen en centrifugeer ze gedurende tien minuten bij 16.000 keer g en vier graden Celsius. Breng de supernatanten over naar een 15 milliliter buis en bewaar 50 tot 100 microliter als inputmateriaal. Om een streptavidine pulldown uit te voeren, brengt u voor elke conditie 200 microliter streptavidine-gekoppelde magnetische kralensuspensie over naar een 1,5 milliliter buis.

Plaats de buizen op een magnetische rack en wacht ongeveer een minuut voordat u het opslagoplosmiddel verwijdert. Was de kralen met één milliliter evenwichtsbuffer door voorzichtig te mengen. Verspreid vervolgens de evenwichtige kralen gelijkmatig in het benodigde aantal buizen en plaats ze terug op de magnetische rack.

Na het verwijderen van het evenwichtsbuffer, resuspendeer elk setje kralen met gelijke hoeveelheden van de corresponderende cellysaten. Incubeer de monsters vervolgens een nacht op een roterend wiel bij vier graden Celsius. Plaats de buizen de volgende dag op een magnetische rack.

Wacht tot de kralen aan de zijkant van de buizen plakken en breng de supernatanten over naar een 15 milliliter buis gelabeld als flow through. Resuspendeer de kralen in elke buis met 200 microliter wasbuffer een en combineer elke set resuspendeerde kralen die overeenstemt met één conditie in 1,5 milliliter buizen. Gebruik één milliliter wasbuffer een om de kralen twee keer te wassen op een roterend wiel gedurende acht minuten.

Voer vervolgens twee wasbeurten uit voor wasbuffers twee, drie en vier. Om er zeker van te zijn dat de wasbuffer na de laatste wasstap volledig is verwijderd, centrifugeert u de monsters na het verwijderen van het grootste deel van het supernatant. Plaats ze vervolgens terug op de magnetische rack en verwijder de resterende buffer.

Voeg 30 microliter elutiebuffer toe aan de kralen, incubeer de monsters vervolgens gedurende vijftien minuten bij 98 graden Celsius en verplaats de buizen onmiddellijk naar de magnetische rack. Breng het eluteerde monster over naar een verse buis en bewaar de buizen bij min 20 graden Celsius tot verdere verwerking. Bereid voor elk inputmonster een PAGE-monster voor door gelijke hoeveelheden eiwit te mengen met het juiste volume 3X SDS-laadbuffer in een totaal volume van 28 microliter.

Bereid vervolgens PAGE-monsters voor door vijf microliter van elk elutiemonster te mengen met 2,5 microliter 3X SDS-laadbuffer. Laad de monsters op een SDS-polyacrylamidegel. Ga vervolgens door met elektroforese en western blotting volgens het tekstprotocol.

Om SDS-PAGE uit te voeren voor MS-analyse, voegt u 6,25 microliter 4X-monsterbuffer toe aan 18,75 microliter van elk elutiemonster en laat de monsters lopen op een vier tot 20% voorgevormde SDS-gel totdat ze twee tot drie centimeter in de gel migreren. In een 15 centimeter petrischaal, kleurt u de gel met colloïdaal Coomassie Brilliant Blue G250-kleuring. Gebruik een schone scalpel om de volledige banen voor elk monster uit te snijden, met uitzondering van de streptavidineband, en breng de uitgesneden banden over naar 1,5 milliliter buizen voor MS-analyse.

Naast de endogene gebiotinyleerde eiwitten die zijn geïdentificeerd in een BioID, split-BioID-experiment, zijn de extra belangrijkste banden die worden waargenomen door western blot de fusie-eiwitten die zichzelf hebben gebiotinyleerd, wat aangeeft dat de twee geteste eiwitten, in dit voorbeeld Ago2 en TNRC6C of Ago2 en Dicer, in de cellen zijn geïnteracteerd. Bovendien geven de resultaten van de western blot aan dat het hebben van een NBirA*Ago2-fusie-eiwit gekoppeld aan CBirA*-fusies naar TNRC6C of Dicer efficiënter is dan de tegenovergestelde combinaties waarin CBirA*Ago2 is gekoppeld aan NBirA*-fusies van de andere twee eiwitten. Bovendien was de activering specifiek, aangezien geen van de CBirA*-fusies de NBirA*GFP-controle-fusie-eiwit tot appreciabele niveaus kon activeren.

Wanneer u de isolatie voor de eerste keer uitvoert, moeten alle stappen van de zuivering worden geanalyseerd door western blotting. Zoals hier ge