CARIP-Seq en ChIP-Seq: methoden voor het identificeren van de chromatine-geassocieerde RNAs en eiwit-DNA interacties in embryonale stamcellen

Het algemene doel van CARIP-Seq is om genoom-breed chromatine-geassocieerde RNA's te onderzoeken. Het doel van ChIP-Seq is om eiwit-DNA-interacties op een globaal niveau te evalueren in embryonale stamcellen. Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van epigenetica en stamcellen, het identificeren van de locatie in het genoom waar transcriptiefactoren of epigenetische regulatoren binden of de bezetting van histonmodificaties of chromatine-geassocieerde RNA's in embryonale stamcellen.

Het belangrijkste voordeel van deze technieken is dat ze toelaten om op een onbevooroordeelde manier het hele genoom te onderzoeken op RNA's die geassocieerd zijn met chromatine-constituenten en om eiwit-DNA-interacties globaal te identificeren. Hoewel deze methoden inzicht kunnen geven in de biologie van embryonale stamcellen, kunnen ze ook worden toegepast op andere zoogdierceltypen om kankerbiologie of andere menselijke ziekten te bestuderen. Om de embryonale stamcellen te oogsten, was de cellen eerst met fosfaatgebufferd zoutwater.

Los daarna de cellen los met 0,25% trypsine, voorverwarmd tot 37 graden Celsius. Na trypsinisering, suspendeer de cellen in voorverwarmd MEF-medium, aangevuld met 10% foetaal bovien serum. Voeg vervolgens 37% formaldehyde toe aan de cellen in een conische buis tot een eindconcentratie van 1% en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende acht minuten om de cellen te cross-linken.

Om de fixatiereactie te stoppen, voeg 1,25 molaal glycine toe, voorgekoeld op vier graden Celsius tot een eindconcentratie van 0,125 molaal. Plaats vervolgens de buis op een rotator en draai deze acht keer per minuut gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Na vijf minuten centrifugeert u het monster gedurende vijf minuten bij 300g bij kamertemperatuur.

Nadat de centrifugatie voorbij is, gooit u de supernatant weg. Was vervolgens de pellet met voorgekoeld fosfaatgebufferd zoutwater en centrifugeer het monster opnieuw. Vervolgens verwijdert u het fosfaatgebufferd zoutwater en bevriest u de cellen gedurende een minuut in vloeibare stikstof.

Zodra de embryonale stamcellen op ijs zijn ontdooid, suspendeert u de pellet in 2,5 milliliter sonicatiebuffer. Om transcriptiefactoren of epigenetische factoren te bestuderen, suspendeert u de cellenpellet in sonicatiebuffer zonder natriumdodecylsulfaat. Voor histonmodificaties, suspendeert u de cellenpellet in buffer die natriumdodecylsulfaat bevat.

Vervolgens, voor chromatine-immunoprecipitatie, soniceer de chromatine gedurende 14 tot 18 cycli bij 40% amplitude met 30 seconden aan en 30 seconden rustmodus. Om de chromatine voor de eiwitfactor ChIP te solubiliseren, voegt u 28 microliters van 10% natriumdodecylsulfaat toe aan de sonicatiebuffer. Voor eiwitfactoren in histonmodificaties, voegt u 28 microliters natriumdeoxycholaat en 0,28 milliliters van 10% Triton X-100 toe en mengt u goed.

Centrifugeer vervolgens het monster gedurende 10 minuten bij 10.000g bij vier graden Celsius om de chromatine vooraf te zuiveren. Voeg in een lage bindingsbuis van 1,5 milliliter 40 microliters A of G magnetische kralen toe. Was vervolgens de kralen met 600 microliters fosfaatgebufferd zoutwater en breng de buis met de kralen op een rek met een magneet en incubeer gedurende een minuut bij kamertemperatuur.

Verwijder vervolgens het fosfaatgebufferd zoutwater en suspendeer de kralen opnieuw in 100 microliters fosfaatgebufferd zoutwater. Voeg aan de buis twee tot vier microgram antilichaam toe en incubeer het door het op een rotator te plaatsen gedurende 40 minuten bij acht omwentelingen per minuut om antilichaambinding aan de kralen te bevorderen. Voeg vervolgens 200 microliters fosfaatgebufferd zoutwater toe om de kralen te wassen.

Na het wassen, incubeer de gesoniceerde chromatine-extract op een rotator bij vier graden Celsius gedurende een nacht om de chromatine-gebonden eiwitten te immunoprecipiteren. De volgende dag wast u de kralen en incubeert u ze met RIPA-buffer, RIPA-buffer met zout, lithiumchloridebuffer, Tris-EDTA-buffer met Triton X-100 en Tris-EDTA-buffer, elk gedurende 10 minuten op een rotator. Om te decrosslinken voor ChIP, suspendeert u de kralen in 100 microliters Tris-EDTA-buffer.

Voeg vervolgens drie microliters 10% natriumdodecylsulfaat en vijf microliters 20 milligram per milliliter Proteinase K toe en incubeer de kralen gedurende een nacht bij 65 graden Celsius. Na incubatie, draait u de buizen de volgende dag meerdere keren om, laat ze op de magnetische rek en brengt u de supernatant over naar een schone buis. Was vervolgens de magnetische kralen door 100 microliters Tris-EDTA-buffer toe te voegen, met 0,5 molare natriumchloride en combineert u de twee supernatanten.

Om te decrosslinken voor CARIP, suspendeert u de kralen in 100 microliters Tris-EDTA-buffer. Voeg vervolgens drie microliters 10% natriumdodecylsulfaat en vijf microliters 20 milligram per milliliter Proteinase K toe en incubeer de kralen gedurende vier tot 12 uur bij 65 graden Celsius. Draai de buis opnieuw meerdere keren om en plaats op de magnetische rek om de supernatant over te brengen naar een schone buis.

Was vervolgens de magnetische kralen door 100 microliters Tris-EDTA-buffer toe te voegen, met 0,5 molare natriumchloride en combineer vervolgens de twee supernatanten. Isoleer ten slotte het RNA-monster door fenol chloroform isoamyalcohol te gebruiken in een verhouding van 25 tot 24 tot 1 volume per volume. Gebruik vervolgens DNase om DNA te verwijderen uit het chromatine-geassocieerde geïmmunoprecipiteerde RNA-monster.

Voeg vervolgens 10X DNase-buffer toe aan het CARIP-monster en pas het eindvolume aan tot 1X concentratie. Incubeer vervolgens het monster gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Synthetiseer vervolgens de eerste streng van complementair DNA door een PCR-reactie op te zetten door 10,5 microliters RNA en een microliter van drie microgram per milliliter willekeurige hexameer-primers toe te voegen.

Om de secundaire structuur te denatureren, incubeert u de buis