Name: Musculus levator Auris Longus Voorbereiding onderzoek van zoogdieren neuromusculaire transmissie Voltage Clamp voorwaarden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Leer de isolatie van de muis levator auris longus spier voor elektrofysiologische metingen van synaptische transmissie aan de neuromusculaire synaps. Deze methode helpt onderzoekers om zenuw-musculaire communicatie te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr. Mark M. Rich en Daniel Miranda voor redactiecommentaren, Ahmad Khedraki voor het helpen vaststellen van deze techniek en Wright State University voor financiële steun (opstarten Fonds A.A.V.).

<ol><li>Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+levator+auris+longus+muscle+of+the+mouse%3A+a+convenient+preparation+for+studies+of+short-+and+long-term+presynaptic+effects+of+drugs+or+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins.</a> Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).</li>
<li>Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+types+in+the+mouse+levator+auris+longus+muscle%3A+a+convenient+preparation+to+study+muscle+and+nerve+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: a convenient preparation to study muscle and nerve plasticity.</a> J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).</li>
<li>Bertone, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbonic+anhydrase+inhibitor+acetazolamide+shifts+synaptic+vesicle+recycling+to+a+fast+mode+at+the+mouse+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Carbonic anhydrase inhibitor acetazolamide shifts synaptic vesicle recycling to a fast mode at the mouse neuromuscular junction.</a> Synapse. , (2017).</li>
<li>Garcia-Chacon, L. E., Nguyen, K. T., David, G., Barrett, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrusion+of+Ca2%2B+from+mouse+motor+terminal+mitochondria+via+a+Na%2B-Ca2%2B+exchanger+increases+post-tetanic+evoked+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extrusion of Ca2+ from mouse motor terminal mitochondria via a Na+-Ca2+ exchanger increases post-tetanic evoked release.</a> J Physiol. 574 (Pt 3), 663-675 (2006).</li>
<li>Murray, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+vulnerability+of+motor+neurons+and+dissociation+of+pre-+and+post-synaptic+pathology+at+the+neuromuscular+junction+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).</li>
<li>Nadal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+muscarinic+acetylcholine+autoreceptors+%28M1%2C+M2+and+M4+subtypes%29%2C+adenosine+receptors+%28A1+and+A2A%29+and+tropomyosin-related+kinase+B+receptor+%28TrkB%29+modulate+the+developmental+synapse+elimination+process+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Presynaptic muscarinic acetylcholine autoreceptors (M1, M2 and M4 subtypes), adenosine receptors (A1 and A2A) and tropomyosin-related kinase B receptor (TrkB) modulate the developmental synapse elimination process at the neuromuscular junction.</a> Mol Brain. 9 (1), 67(2016).</li>
<li>Rousse, I., St-Amour, A., Darabid, H., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse-glia+interactions+are+governed+by+synaptic+and+intrinsic+glial+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synapse-glia interactions are governed by synaptic and intrinsic glial properties.</a> Neuroscience. 167 (3), 621-632 (2010).</li>
<li>Rozas, J. L., Gomez-Sanchez, L., Tomas-Zapico, C., Lucas, J. J., Fernandez-Chacon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+neurotransmitter+release+at+the+neuromuscular+junction+in+a+mouse+model+of+polyglutamine+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Increased neurotransmitter release at the neuromuscular junction in a mouse model of polyglutamine disease.</a> J Neurosci. 31 (3), 1106-1113 (2011).</li>
<li>Takeuchi, A., Takeuchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+analysis+of+relationship+between+end-plate+potential+and+end-plate+current%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Further analysis of relationship between end-plate potential and end-plate current.</a> J Neurophysiol. 23, 397-402 (1960).</li>
<li>McLachlan, E. M., Martin, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non+linear+summation+of+end+plate+potentials+in+the+frog+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Non linear summation of end plate potentials in the frog and mouse.</a> The Journal of Physiology. 311 (1), 307-324 (1981).</li>
<li>Obis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+protein+kinase+C+epsilon+isoform+modulates+acetylcholine+release+in+the+rat+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">The novel protein kinase C epsilon isoform modulates acetylcholine release in the rat neuromuscular junction.</a> Mol Brain. 8 (1), 80(2015).</li>
<li>Silveira, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+and+inositol+triphosphate+receptors+modulate+facilitation+and+tetanic+depression+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Ryanodine and inositol triphosphate receptors modulate facilitation and tetanic depression at the frog neuromuscular junction.</a> Muscle Nerve. 52 (4), 623-630 (2015).</li>
<li>Wood, S. J., Slater, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+factor+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Safety factor at the neuromuscular junction.</a> Prog Neurobiol. 64 (4), 393-429 (2001).</li>
<li>Miranda, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+Cl-+channel+defects+reveal+disrupted+skeletal+muscle+maturation+in+R6%2F2+Huntington%27s+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Progressive Cl- channel defects reveal disrupted skeletal muscle maturation in R6/2 Huntington's mice.</a> J Gen Physiol. 149 (1), 55-74 (2017).</li>
<li>Waters, C. W., Varuzhanyan, G., Talmadge, R. J., Voss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington+disease+skeletal+muscle+is+hyperexcitable+owing+to+chloride+and+potassium+channel+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Huntington disease skeletal muscle is hyperexcitable owing to chloride and potassium channel dysfunction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9160-9165 (2013).</li>
<li>Khedraki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depressed+Synaptic+Transmission+and+Reduced+Vesicle+Release+Sites+in+Huntington%27s+Disease+Neuromuscular+Junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Depressed Synaptic Transmission and Reduced Vesicle Release Sites in Huntington's Disease Neuromuscular Junctions.</a> Journal of Neuroscience. 37 (34), 8077-8091 (2017).</li>
<li>Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreene%2C+EC+%22The+anatomy+of+the+rat%22">The anatomy of the rat</a>. , Hafner Pub. (1955).</li>
<li>Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+probes+that+stain+living+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fluorescent probes that stain living nerve terminals.</a> J Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).</li>
<li>Jack, J. J. B., Noble, D., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJack%2C+JJB+%22Electric+current+flow+in+excitable+cells%22">Electric current flow in excitable cells</a>. , Clarendon Press. (1983).</li>
<li>Voss, A. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19805741">Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y(1) receptors.</a> Journal of Physiology-London. 587 (23), 5739-5752 (2009).</li>
<li>Albuquerque, E. X., McIsaac, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+slow+mammalian+muscles+after+denervation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Fast and slow mammalian muscles after denervation.</a> Experimental Neurology. 26 (1), 183-202 (1970).</li>
<li>Santafe, M. M., Urbano, F. J., Lanuza, M. A., Uchitel, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+types+of+calcium+channels+mediate+transmitter+release+during+functional+recovery+of+botulinum+toxin+type+A-poisoned+mouse+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Multiple types of calcium channels mediate transmitter release during functional recovery of botulinum toxin type A-poisoned mouse motor nerve terminals.</a> Neuroscience. 95 (1), 227-234 (2000).</li>
<li>Gaffield, M. A., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+mobility+in+mouse+motor+nerve+terminals+with+and+without+synapsin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle mobility in mouse motor nerve terminals with and without synapsin.</a> J Neurosci. 27 (50), 13691-13700 (2007).</li>
<li>Zhang, Z. S., Nguyen, K. T., Barrett, E. F., David, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+ATPase+Inserted+into+the+Plasma+Membrane+of+Motor+Terminals+by+Exocytosis+Alkalinizes+Cytosolic+pH+and+Facilitates+Endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Vesicular ATPase Inserted into the Plasma Membrane of Motor Terminals by Exocytosis Alkalinizes Cytosolic pH and Facilitates Endocytosis.</a> Neuron. 68 (6), 1097-1108 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier beschreven is de voorbereiding en het gebruik van de muis LAL spier voor de meting van de neuromusculaire transmissie onder stroom - of spanning-clamp voorwaarden. Er zijn verschillende belangrijke punten om te overwegen voor het ontleden van de LAL. Reiniging van overtollige bindweefsel van de spier aids in elektrode Spietsing, als de elektroden kunt addertje onder het gras het bindweefsel wanneer ze voor Spietsing positionering. Echter alleen het verwijderen van bindweefsel die kan worden ontnomen gemakkelijk te b...

Bestuderen van synaptische transmissie op de motorische eindplaat biedt inzichten in de dynamische relatie tussen de gespierde nerveus en skelet-systemen en is een uitstekend model voor de behandeling van synaptic fysiologie. De Musculus levator auris longus (LAL) is een dunne spier, waardoor de neuromusculaire kruispunten te gemakkelijk worden gevisualiseerd. Eerdere verslagen hebben omschreven het gemak van het gebruik van de LAL synaptic drugs en toxine te onderzoeken en het skelet spiervezel type Eigenschappenvan de LAL1,2hebben gekenmerkt. Talrijke studies hebben de LAL gebruikt om te onderzoeken van de neuromusculaire fysiologie3,4,5,6,7,8. Voor electrofysiologie, de mogelijkheid om eenvoudig observeren LAL neuromusculaire kruispunten voorziet in de nauwkeurige plaatsing van microelectrodes in de motorische eindplaat en sterk vermindert ruimte klem kwesties in de opname van de synaptische transmissie. Current-clamp opnames van de spier membraan eigenschappen, zoals de membraan tijdconstante (τm) en de input weerstand (Rin) zijn gemakkelijk verkregen. Bovendien kunnen deze eigenschappen worden gemeten vanaf de dezelfde spiervezels gebruikt voor de registratie van de neuromusculaire transmissie, waardoor een directe vergelijking van synaptische functie aan de eigenschappen van de spier-membraan. Analyse van deze gegevens kan belangrijke inzicht verwerven in de fysische mechanismen van veel neuromusculaire ziekten en Staten van gewijzigde activiteit.
Een belangrijk aspect van de hier beschreven techniek is het gebruik van spanning-clamp voor synaptic opnamen, die zijn niet onderworpen aan de niet-lineariteiten ondervonden in current-clamp en zijn onafhankelijk van de eigenschappen van de spier-membraan. Voordelen van het gebruik in tegenstelling tot huidige-klem-spanning-klem te onderzoeken van de neuromusculaire transmissie zijn vastgesteld door de baanbrekende inspanningen in de jaren 1950-9. Onder huidige-clamp zijn EPPs die hoger zijn dan 10-15 mV in amplitude niet een lineaire product van de waterwerkgroep amplitude9. Bijvoorbeeld, als de gemiddelde waterwerkgroep is 1 mV, een EVP van 5 mV kan worden aangenomen dat het product van 5 mEPPs (QC 5); Overwegende dat een EVP van 40 mV zullen het product van meer dan 40 mEPPs. Deze niet-lineariteit op grotere EPPs treedt op omdat de drijvende kracht voor het EPP-programma, dat is het verschil tussen de membraanpotentiaal en evenwicht potentieel voor de acetylcholine receptor (~ -10 mV), aanzienlijk verlaagt tijdens grote EPPs. Dit probleem is in spanning-clamp experimenten vermeden omdat de membraanpotentiaal spier niet tijdens spanning-clamp experimenten verandert. Een nadeel is dat spanning-clamp experimenten technisch moeilijker zijn te voltooien dan current-clamp opname. Met dit in gedachten ontwikkeld McLachlan en Martin een eenvoudige wiskundige correctie die goed is voor niet-lineariteiten in current-clamp opnames van EPPs10. De correcties werken goed11,12,13, maar nog belangrijker is, veronderstellen dat de spier membraan eigenschappen hebben niet verstoord.
De spier membraan eigenschappen zijn met name belangrijk om te overwegen als studeren voorwaarden of ziekte staten die verstoren van de spier. Skeletspieren van de R6/2 transgene model van de ziekte van Huntington is bijvoorbeeld hyperexcitable als gevolg van een geleidelijke vermindering in de rust chloride en kalium stromingen14,15. Dientengevolge, worden mEPPs en EPPs versterkt in de skeletspieren R6/2. Bijkomende factoren kunnen zeker, mEPPs en EPPs wijzigen. Werken met een ander model van de ziekte van Huntington muizen (R6/1) wijzigingen in EPPs dat leek te worden gerelateerd aan SNARE-eiwitten8gevonden. Om te beoordelen de mechanismen waardoor veranderde neuromusculaire transmissie, zou het zinvol zijn om te elimineren van de effecten van de eigenschappen van de membraan van de gewijzigde spier met behulp van een spanning-klem. In een recente studie, werd de R6/2 neuromusculaire transmissie bestudeerd onder beide stroom en spanning-kogelklem voorwaarden hierin met behulp van de techniek beschreven. Het geheel van de motor endplates waren spanning-geklemd met minder dan 1% fout door het plaatsen van twee microelectrodes binnen de constante van de lengte van de eindplaat16. Het bleek dat spanning-clamp en current-clamp records opgeleverd contrasterende metingen van neuromusculaire transmissie in R6/2 spier gecorrigeerd. Dit benadrukt dat het wellicht moeilijk te corrigeren EPPs voor niet-lineariteiten als de spier membraan eigenschappen zijn gewijzigd en toont de voordelen van het verkrijgen van de spanning-clamp records die onafhankelijk van de eigenschappen van de spier-membraan zijn. Het protocol gepresenteerd hierin is ideaal voor de behandeling van de voorwaarden of ziekte staten die invloed hebben op de synaptische transmissie en de eigenschappen van het postsynaptisch membraan.

<table><tbody><tr><td>Olympus Compound Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>10x Objective</td><td>Olympus</td><td>UMPLFLN10XW</td><td></td></tr><tr><td>40x Objective</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate Glass</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF150-86-7.5</td><td></td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Santa Barbara Instruments Group</td><td>ST-7XMEI</td><td></td></tr><tr><td>Mater-9 Pulse Generator</td><td>AMPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iso-flex Stimulus Isolator</td><td>AMPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software</td><td>Molecular Devices</td><td>1-2500-0180</td><td></td></tr><tr><td>Concentric Bipolar Electrode</td><td>FHC</td><td>CBDSH75</td><td></td></tr><tr><td>Ball-joint Manipulator</td><td>Narishige&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Non-metalic Syringes 34 Gauge</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td></td></tr><tr><td>No. 5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>No. 2 Forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5Q41</td><td></td></tr><tr><td>Microdissecting Scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5912SC</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>2404019862</td><td></td></tr><tr><td>Hair Removal Cream</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grass SD9 Stimulator</td><td>Grass Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Model P-1000 Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low Pass Bessell Filter</td><td>Warner Instrument Corp.</td><td>LPF-8</td><td></td></tr><tr><td>Left-handed Micromanipulator</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641/45DL</td><td></td></tr><tr><td>Right-handed Micromanipulator</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641/45DR</td><td></td></tr><tr><td>Single Motion Controler</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MC100e</td><td></td></tr><tr><td>Crossed Roller Micromanipulator</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641R</td><td>Dit is toegevoegd aan de Z-as van de linkshandige en rechtshandige micromanipulators om de z-as te kunnen motoriseren. Deze aangepaste set-up is goedkoper en minder omvangrijk dan het kopen van een 4-assige gemotoriseerde micromanipulator. Het stelt ons ook in staat om beide micromanipulatoren met één controller te besturen</td></tr><tr><td>Alle chemicaliën werden besteld bij Fisher, behalve,</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BTS</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>B315190</td><td></td></tr><tr><td>CTX</td><td>Alomone Labs</td><td>C-270</td><td></td></tr><tr><td>4-Di-2-Asp</td><td>Molecular Probes</td><td></td><td>Molecular Probes is niet langer een bedrijf. Nu besteld via Fisher</td></tr></tbody></table>

musculus levator auris longus voorbereiding onderzoek van zoogdieren neuromusculaire transmissie voltage clamp voorwaarden

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Dit protocol beschrijft een techniek naar record synaptische transmissie van de motorische eindplaat current-clamp en spanning-clamp voorwaarden. Een ex vivo -voorbereiding van de Musculus levator auris longus (LAL) wordt gebruikt omdat het is een dunne spier die gemakkelijke visualisatie van de motorische eindplaat micro-elektrode Spietsing op de motorische eindplaat voorziet. Deze methode zorgt voor de opname van de spontane miniatuur eindplaat potentials en stromingen (mEPPs en mEPCs), eindplaat zenuw-evoked potentials en stromingen (EPPs en Spoon), evenals de eigenschappen van de membraan van de motorische eindplaat. Deze methode verkregen resultaten omvatten de quantal inhoud (QC), aantal vesikel release sites (n), de waarschijnlijkheid van het vesikel release (prel), synaptic versoepeling en depressie, evenals de tijdconstante van de spier-membraan (τ m) en de inbreng van de weerstand. Toepassing van deze techniek te Muismodellen van ziekten bij de mens kan markeren belangrijkste pathologieën in ziekte staten en helpen bij het identificeren van de roman behandelingsstrategieën. Deze methode biedt door volledig spanning-klemmen een enkele SYNAPS, een van de meest gedetailleerde analyses van de synaptische transmissie momenteel beschikbaar.

Figuur 8 toont een voorbeeld van de huidige pulsen (figuur 8A) en de spanning Reacties (Figuur 8) uit één LAL vezel onder current-clamp uit een 12-week-oude wild type R6/2-muis. De aanwezigheid van mEPPs geeft aan dat deze records werden genomen uit de motorische eindplaat. De records werden verkregen in normale fysiologische zoutoplossing oplossing. Deze huidige-clamp records kunnen worden geanalyse...

Het protocol beschreven in dit document maakt gebruik van de muis Musculus levator auris longus (LAL) spier graag spontane, zenuw-opgeroepen postsynaptisch potentieel (current-clamp) en stromingen (spanning-klem) op de motorische eindplaat. Gebruik van deze techniek kan belangrijke inzicht verwerven in de mechanismen van synaptische transmissie onder normale en zieke voorwaarden.

Musculus levator Auris Longus Voorbereiding onderzoek van zoogdieren neuromusculaire transmissie Voltage Clamp voorwaarden

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...

Het algemene doel van deze procedure is om de levator auris longus-spier en zijn zenuw te isoleren om synaptische stromen bij de neurale spierverbinding te registreren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de synaptische fysiologie, zoals de grootte van de eindplakstroom, de kwantale inhoud, de waarschijnlijkheid van afgifte en de relaties tussen neurotransmissie en spierexcitabiliteit. Het grote voordeel van deze techniek is dat de gedetailleerde elektrofysiologische opnamen van een enkele synaps gemakkelijk kunnen worden gecombineerd met optische experimenten met levende cellen.Hoewel deze methode inzicht kan geven in synaptische functie en feedbackcommunicatie tussen zenuw en spier, kan het ook worden toegepast op andere systemen, variërend van drosophila tot zoogdieren. Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat de zoogdierzenuwspierpreparaat kwetsbaar is, vooral de zenuw. Het verwerven en interpreteren van de resulterende spanningsklemmen kan ook een uitdaging zijn.Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in een uur worden uitgevoerd als deze goed wordt uitgevoerd. De procedure wordt gedemonstreerd door Steve Burke van mijn laboratorium. Om deze procedure te beginnen, maak onder een stereo-dissectiemicroscoop een kleine incisie in de huid op de rug van de muis ter hoogte van de schouderbladen.Gebruik een paar microdissectiescharen. Snijd de huid over het hoofd en de rug. Trek vervolgens de huid langs de incisie in de buurt van de schouderbladen omhoog.Snijd de spieren die inferieur zijn aan de LAL door te beginnen bij het rechterschouderblad. Til vervolgens voorzichtig het gesneden weefsel direct rechts van de middenlijn op. Maak een snede naar het linkeroor met de messen van de schaar tegen het schedeldak gedrukt om verschillende laagjes spier die inferieur zijn aan de linker LAL te verwijderen.Vermijd het snijden van de zenuw die de LAL innerveert, die zich rond het gehoorkanaal wikkelt en de spieren aan de mediale kant van het oor binnengaat. Snijd door het gehoorkanaal en houd zoveel mogelijk van de zenuw bevestigd. Snijd vervolgens het vetweefsel achter het gehoorkanaal langs de ventrolaterale portie van het oor.Snijd langs het linker schouderblad, vergelijkbaar met de procedures die aan de rechterkant zijn uitgevoerd, om de spier volledig uit de muis te verwijderen. Snijd vervolgens de pinna van het oor af langs de basis en laat het kraakbeenachtige deel van het oor aan de LAL bevestigd. Draai de spier zodat de inferieure kant naar boven wijst.Om de LAL-spier te isoleren, plaats de LAL en het omringende weefsel in een petrischaal met een siliconen elastomeerbodem en speld het gedissekteerde weefsel op de bodem. Was het weefsel regelmatig in een fysiologische zoutoplossing. Plaats vervolgens een insectenpin door het gehoorkanaal om het preparaat op zijn plaats te houden.Gebruik kleinere pinnen om het resterende weefsel aan de andere kant van de middenlijn van de LAL vast te pinnen. Gebruik een paar pincetten. Trek voorzichtig de huid omhoog op de laterale portie van het oor om de spier uit te rekken en plaats een kleine pin door de huid.Herhaal deze stap totdat het weefsel goed op de schotel is bevestigd. Verwijder de spieren die de LAL bedekken en die via bindweefsel aan de LAL zijn gebonden en vooral strak zijn in de buurt van de middenlijn. Trek vervolgens de bovenliggende spierlaag omhoog en snijd het bindweefsel met de messen gericht naar de spierlaag die wordt getrokken.Snijd naar de middenlijn tot ongeveer driekwart van de weg naar de middenlijn en verwijder spierlagen totdat alleen de LAL overblijft. Zorg er tijdens het schoonmaakproces voor dat de zenuwen niet worden beschadigd. Vervolgens, verwijder enkele resterende bindweefsellaagjes die de LAL bedekken om het doorprikken van de elektroden te vergemakkelijken.Verwijder alleen weefsel dat gemakkelijk kan worden verwijderd zonder het risico om de LAL tijdens het proces te beschadigen. Gebruik een zenuwstimulator om de zenuw die de LAL innerveert te identificeren, door de zenuwen met de zenuwstimulator aan te raken. Wanneer de spier samentrekt, is de juiste zenuw geïdentificeerd.Pak vervolgens voorzichtig het weefsel in de buurt van de zenuw vast en gebruik veerscharen om de zenuw te scheiden van het weefsel rond het oor. Om schade te minimaliseren, houd het grootste deel van de zenuw ingebed in wat omringende weefsel dat later wordt gebruikt om de zenuw aan de opnamebak te bevestigen. Op dit punt kan de onderzoeker een pauze van een uur nemen, zolang de LAL wordt gebaad in 20 milliliter of meer van een fysiologische zoutoplossing.Vervolgens ontspeld en breng het spierweefsel over naar een stage-inzet onder de dissectiemicroscoop voor elektrofysiologische experimenten. Speld het spierweefsel aan de uiteinden en langs de rand vast. Positioneer de zenuw loodrecht op de spiervezels en bevestig deze aan de bodem van de schotel door middel van overtollig weefsel dat aan het uiteinde van de zenuw intact is gelaten.Houd het weefsel altijd in een fysiologische zoutoplossing. Voor het elektrofysiologische experiment bevestigt u de perfusiekamer met de LAL aan de microscoopstandaard. Plaats de referentie-elektrode in een kop gevuld met drie-molare kaliumchloride die is verbonden met de opnamekamer via een agarbrug.Positioneer op dit punt de zenuwstimulerende elektrode op de zenuw. Stel de LAL-preparaat 10 minuten bloot aan 4-Di-2-Asp om voldoende fluorescentie te bereiken voor visualisatie van de neuromusculaire junctie. Na 10 minuten vervangt u de 4-Di-2-Asp-oplossing door de normale calciumoplossing.Vul ondertussen de glascapillairen met de juiste oplossingen voor de spanningsgevoelige en stroomdoorlatende elektroden. Tik zachtjes op de capillair om eventuele luchtbellen te verwijderen en bevestig de gevulde capillair in de elektrodehouder op de headstage. Gebruik een rechtopstaande micros

levator-auris-longus-preparation-for-examination-mammalian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier beschrijven we elektrofysiologische methoden voor het meten van synaptische transmissie bij de neuromusculaire junctie van Drosophila larve. Evoked release wordt kunstmatig geïnitieerd door het stimuleren van de motorische neuron axonen, en de transmissie door middel van de NMJ kan worden gemeten door de postsynaptische respons opgeroepen in de spier.

Elektrofysiologische methoden voor opname Synaptic Potentials van de NMJ van Drosophila Larven

Toepassing van elektrofysiologie toegankelijke synapsen biedt een kwantificeerbare maat van synaptische activiteit, nuttig bij het analyseren van synaptische mutanten. Dit artikel beschrijft een dissectie methode die wordt gebruikt om de neuromusculaire verbindingen (NMJ) van...

Ontleden en opnemen van The C. Elegans neuromusculaire junctie

Elektrofysiologische opname in de Drosophila Embryo

De opener spier van de rivierkreeft been wordt gepresenteerd voor het historisch belang en experimentele veelzijdigheid in de spieren fenotype, synaptische fysiologie en plasticiteit.

Bekijk de historische en fysiologie demonstratie op het NMJ van de rivierkreeft Opener Muscle

We beschrijven de procedures voor de herhaalde toediening van remmers van muscarine-signalering naar de levator Auris longus (LAL) spier van jong volwassen muizen en voor de daaropvolgende immunokleuring van de neuromusculaire verbindingen (NMJs) in wholemounts. De LAL spier heeft unieke voordelen voor het openbaren...

Subcutane toediening van muscarine antagonisten en Triple-Immunokleuring van de Levator Auris longus in Muizen

Deze nieuwe methode maakt het gelijktijdig intracellulaire opname van een volwassen muis motoneuron en de meting van de kracht die door de spiervezels. De gecombineerde onderzoek van de elektrische en mechanische eigenschappen van motoreenheden in normale en genetisch gemodificeerde dieren is een doorbraak voor de studie van het neuromusculaire systeem.

Gelijktijdig Intracellulaire opnemen van een lumbale motoneuron en de kracht die door de motor in de volwassen muis<em&gt; In vivo</em

Een functionele evaluatie van de motorische eindplaat (NMJ) kan verschaffen essentiële informatie over de communicatie tussen spieren en zenuwen. Hier beschrijven we een protocol uitvoerig evalueren zowel de spier de NMJ functionaliteit met behulp van twee verschillende spier-zenuw preparaten, d.w.z. soleus-ischialgie en membraan-phrenic.

Meten van de motorische eindplaat functionaliteit

Axonale prikkelbaarheid technieken bieden een krachtig hulpmiddel om te onderzoeken pathofysiologie en biofysische wijzigingen die voorafgaan aan de onomkeerbare degeneratieve gebeurtenissen. Dit manuscript demonstreert het gebruik van deze technieken op het telefoonbotje van narcose ratten.

In Vivo Elektrofysiologische meting van de Rat telefoonbotje met axonale prikkelbaarheid testen

Het protocol beschrijft de methode om een fluorescerende calciumkleurstof door de gesneden zenuw in de motorische zenuwuiteinden van de muis te laden. Daarnaast wordt een unieke methode gepresenteerd voor het registreren van snelle calciumtransiënten in de perifere zenuwuiteinden met behulp van confocale microscopie.

Registratie van calciumtransiënten in de neuromusculaire overgang van de muis met een hoge temporele resolutie met behulp van confocale microscopie

Hier presenteren we een protocol dat in vivo elektroporatie en denervatie van de craniale levator auris longus (LAL) spier combineert. Deze procedure maakt het mogelijk om de mogelijke rol van spiereiwitten bij de regeneratie van de neuromusculaire synaps te bestuderen.

Gecombineerde in vivo elektroporatie en kortdurende reïnnervatie van de skeletspier van de craniale levator Auris longus

Dynamische klemelektrofysiologie kan causale verbanden leggen tussen neuronale vuurtekorten en disfunctie van ionkanalen. We beschrijven dynamische klemmethoden en protocollen in de cerebellaire Purkinje-neuronen van muizen, waarbij we nuttige bronnen en technische overwegingen opmerken. In een representatieve studie voegen we gemodelleerde natriumgeleiding toe aan Tsc1-/- Purkinje-neuronen om herhaald vuren te redden.

Dynamische klemmethoden om verminderde neuronale prikkelbaarheid geassocieerd met autisme te onderzoeken

Leer de isolatie van de muis levator auris longus spier voor elektrofysiologische metingen van synaptische transmissie aan de neuromusculaire synaps. Deze methode helpt onderzoekers om zenuw-musculaire communicatie te bestuderen.

Musculus levator Auris Longus Voorbereiding onderzoek van zoogdieren neuromusculaire transmissie Voltage Clamp voorwaarden

Meer video's verkennen