Ablatie van een neuronale bevolking met behulp van een twee-foton Laser en haar beoordeling met Calcium Imaging en gedrags opname in Zebrafish larven
2 juni 2018
Hier presenteren we een protocol om een genetisch gelabelde subpopulatie van neuronen door een twee-foton laser vanaf Zebrafish larven lasertherapie.
Het algemene doel van dit experiment is om het effect van laserablatie van bepaalde neuronen op circuitactiviteit en gedrag te testen. Met deze experimentele techniek kunnen we de noodzaak van neuronen in een circuit dat gedrag onderligt, onderzoeken. Deze methode kan helpen om onze belangrijkste vragen in het gedrags- en neurowetenschappenveld te beantwoorden, zoals hoe prooi wordt waargenomen en hoe prooivangend gedrag wordt gegenereerd door neurale activiteit.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat neuronen specifiek kunnen worden afgebroken vanwege de genetische markering van deze neuronen en ook de hoge ruimtelijke resolutie van de laser. Na het opvoeden van larven en ze in 2% lage smeltende agarose te plaatsen volgens het tekstprotocol, plaats je de in agarose ingebedde larven onder een twee-foton laser-scanning microscoop en start je het microscopiesysteem. Open de beeldverwervingssoftware en klik onder het lasertab op de aan-knop om de laser aan te zetten.
Wacht tot de status van de laser verandert van druk in mode locked. Op het kanalentab stel je de golflengte van de laser in op 880 nanometer voor EGFP-ablatie of 800 nanometer voor GCaMP-ablatie. Selecteer de 20X subjectieve lens door de lens revolver handmatig te bewegen.
Klik vervolgens op de lokaliseren tab, klik op GFP om de optische paden te wijzigen en bekijk direct de fluorescentie met het oog. Centreer de hersenen van de zebravislarve in het gezichtsveld, klik vervolgens op de verwervingstab om terug te gaan naar twee-foton microscopie en stel de laservermogen en versterking in. Als record van de voorafgaande ablatieconditie klik je op Z stack om de Z stack optie te selecteren.
Vervolgens, na het focussen op het ventrale uiteinde van de hersenen van de larve, klik je op de eerste instellen knop om de ondergrens in te stellen en na het focussen op het meest dorsale oppervlak van de hersenen, klik je op de laatste instellen knop om de bovengrens in te stellen. Klik tenslotte op de start experiment knop om de Z stack beeldverwerving te starten. Selecteer vervolgens de 63X subjectieve lens door de lens revolver handmatig te bewegen.
Klik vervolgens op de lokaliseren tab om over te schakelen naar epifluorescentie microscopie. Centreer de cellen die moeten worden afgebroken met het oog en klik vervolgens op de verwervingstab om terug te gaan naar laser-scanning microscopie. In de verwervingsmodustab stel je de framegrootte in op 256 bij 256.
Klik op live en observeer de interessante neuronen. Zoek vervolgens, beginnend vanaf de meest dorsale zijde, een brandpuntsvlak waarin de cellen die moeten worden afgebroken scherp staan. Gebruik de regiofunctie om een kleine cirkelvormige gebied van ongeveer 1/3 van de grootte van de cel in diameter op elke neuron als een ROI te markeren.
Stel de scansnelheid in op 13,9 seconden per 256 bij 256 pixels wat overeenkomt met een laserverblijftijd van ongeveer 200 microseconden per pixel of 200 microseconden per halve micron. Stel ook de herhalingscyclus in op vier herhalingen. Klik op start experiment om de tijdsreeks en verblekingsfuncties uit te voeren.
Vergelijk de afbeelding vóór de ablatie met de afbeelding na de ablatie in de tijdsreekscyclus om er zeker van te zijn dat de fluorescentie in de doelcellen verdwenen is. Beweeg vervolgens het brandpuntsvlak iets dieper en kies het volgende brandpuntsvlak waarin onbewerkte cellen verschijnen. Voer de verblekingsfunctie uit zoals zojuist is gedemonstreerd en herhaal het proces totdat alle cellen in de interessante neurale structuur zijn afgebroken.
Na de ablatie controleer je de cellen op verdwenen fluorescentie en herhaal je de laserbestraling indien nodig. Na bestraling moeten de larven worden hersteld. Maak voorzichtig kleine loodrechte sneden in de agarose rond de larven.
Wacht vervolgens tot de vis uit de agarose op eigen kracht zwemt wanneer de verdoving afneemt. Na het kweken van paramecium en het verdoven van een zebravislarve volgens het tekstprotocol, plaats je de larven in 2% lage smeltpunt agarose en verwijder je onmiddellijk overtollig agarose zodat het oppervlak van de agarose er licht bol uitziet. Gebruik een dissectieneedle om de larven snel in een rechtopstaande positie te plaatsen.
Maak vervolgens met een chirurgisch mes een paar kleine sneden in de agarose om de agarose rond het hoofd van de zebravis te verwijderen, waardoor ruimte ontstaat voor de paramecium om te zwemmen. Verwijder voorzichtig de resterende agarose door voorzichtig systeemwater op de kamer te gieten. Plaats vervolgens één paramecium in de opnamekamer om als visueel stimulus te dienen.
Plaats vervolgens de opnamekamer onder een epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een wetenschappelijke CMOS-camera en selecteer een 2,5X objectieflens. Start de beeldverwervingstoepassing voor de uitgeruste camera. Klik op het sequentiepaneel en selecteer harde schijf opnemen op het paneel.
Stel in het scaninstellingengedeelte het frametelling in op 900 of een andere gewenste totaal aantal frames. In het opnamepaneel stel je de belichtingstijd in op 30 milliseconden en de binning op twee bij twee. Klik op live op het opnamepaneel om de larven in het camerabeeld te lokaliseren en focus en klik vervolgens op stop live en klik op de startknop.
Sla de film op in cxd-formaat en analyseer de gegevens volgens het tekstprotocol. Na het opzetten van het gedragsopnamesysteem en het plaatsen van een larve in een opnamekamer volgens het tekstprotocol, gebruik je een micropipet om 50 paramecium te verzamelen en deze in de opnamekamer te plaatsen. Om een deksel op de opnamekamer te plaatsen, doe je een kleine druppel water op het deksel voordat je het op het wateroppervlak van de opnamekamer plaatst om te voorkomen dat lucht in de kamer wordt gebracht.
Plaats de opnamekamer in het verlichtingssysteem. Begin vervolgens met de time-lapse opname met 10 frames per seconde gedurende 11 minuten. Voer tenslotte de analyse uit volgens het tekstprotocol.
In dit experiment met de Gal4-lijn die kernen in het pretectale gebied en een subpopulatie van reukbolneuronen labelt. De pretec
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het ablateren van genetisch gelabelde subpopulaties neuronen in zebravislarven met behulp van een tweefotonenlaser. Het hoofddoel is om te onderzoeken hoe de laserablatie van specifieke neuronen de circuitactiviteit en het gedrag beïnvloedt, in het bijzonder in relatie tot de waarneming van prooien en vangstgedrag. De techniek maakt nauwkeurige targeting van neuronen mogelijk dankzij genetische labeling en biedt een hoge ruimtelijke resolutie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Beeldvormingstechnieken
- Gedragsanalyse
Achtergrond
- Het begrijpen van neurale circuits die gedrag aansturen, is essentieel in de neurowetenschappen.
- Technieken voor neurale ablatie helpen bij het bepalen van de noodzaak van specifieke neuronen bij gedragsresponsen.
- Deze methode kan specifiek neuronen targeten zonder aangrenzende structuren te beïnvloeden.
Doel van de Studie
- Test de effecten van laserablatie op de circuitactiviteit en het gedrag in Zebrafish-larven.
- Onderzoek de rol van pretectale neuronen bij het prooivangstgedrag.
- Maak gebruik van laserablatie om inzicht te krijgen in neuronale interacties en circuits.
Gebruikte methoden
- Het hoofdpodium dat wordt gebruikt is een tweefotonen laser-scanningmicroscoop.
- Het biologische model omvat genetisch gelabelde Zebrafish-larven met gerichte neuronale populaties.
- Belangrijke stappen omvatten Z-stack-imaging voor de basisfluorescentie, specifieke laserinstellingen voor ablatie en procedures voor herstel na ablatie.
Belangrijkste resultaten
- De tweefotonlaser ableerde effectief de doelgerichte pretectale neuronen terwijl de omringende cellulaire structuren behouden bleven.
- Neuronale activiteit werd waargenomen als reactie op visuele stimuli, wat duidt op de functionaliteit van de resterende neuronen.
- De bevindingen suggereren dat pretectale neuronen essentieel zijn bij het mediëren van reacties tijdens het vangen van prooien.
Conclusies
- Deze studie demonstreert een betrouwbare methode voor het selectief ablateren van neuronen om hun functionele rollen te analyseren.
- De verkregen inzichten dragen significant bij aan het begrip van de neurale mechanismen die ten grondslag liggen aan gedrag.
- De aanpak kan bredere implicaties hebben voor het bestuderen van neuronale circuits in verschillende modellen van gedrag en ziekte.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Selectieve neuronale ablatie met behulp van tweefotonlasers in zebravissenlarven maakt een nauwkeurige analyse van de neurale circuitfunctie en gedragsresultaten mogelijk. Deze aanpak biedt mechanistische risicoanalyse met een hoge resolutie voor targetvalidatie in vroege discovery-pipelines binnen de neurowetenschappen. De integratie van calcium imaging en gedragsregistratie ondersteunt het voorspellend vertrouwen bij het koppelen van neuronale populaties aan functionele fenotypes.
Strategische toepassingen in BioPharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe tests mogelijk van de noodzaak van neuronen in gedefinieerde circuits voor gedragsmatige output.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door ablatie te koppelen aan circuit- en gedragsveranderingen.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie door de impact van specifieke neuronale populaties te isoleren.
- Verbetert het voorspellende vertrouwen voor het verder ontwikkelen van neurobiologische targets.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Vestigt gevalideerde, genetisch gelabelde systemen voor reproduceerbare ablatiestudies.
- Levert kwantitatieve calcium-imagingoutputs voor standaardisatie van assays.
- Maakt robuuste gedragsmatige fenotypering na ablatie mogelijk voor downstream screening.
- Ondersteunt het hergebruik van het platform over verschillende neuronale subpopulaties.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt functionele circuitinterrogatie uit met gedragsmatige eindpunten die relevant zijn voor de ziekte.
- Maakt continuïteit mogelijk van ontdekking tot preklinische validatie in neurobehaviorale modellen.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde voortgang door circuit-gedragsrelaties te verduidelijken.
- Faciliteert de ontwikkeling van translationele biomarkers via kwantitatieve beeldvorming en gedrag.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode bevindt zich in het continuüm van vroege ontdekking naar preklinisch onderzoek en maakt hypothesegedreven target-validatie en mechanistische risicoreductie mogelijk vóór de identificatie van lead-verbindingen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door genetisch gedefinieerde neuronen te ableren en de gevolgen voor het circuit en het gedrag te meten.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve beeldvormings- en gedragsgegevens voor de ontwikkeling van assays.
- Analytics: Levert meetbare output — calciumsignalen en gedragsmetrieken — voor comparatieve analyse.
- Translationeel onderzoek: Slaat de brug tussen ontdekkingsbevindingen en preklinische modellen door neurale circuits te koppelen aan observeerbare gedragingen.
- Enterprise Reuse: Biedt een herbruikbare workflow voor het onderzoeken van diverse neuronale populaties in verschillende projecten.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar neurale circuits.
- Operationele waarde: Standaardiseert ablatie- en beeldvormingsprotocollen voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door relaties tussen doelwit en gedrag in een vroeg stadium van de pijplijn te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van neurobiologische doelwitten voor verdere ontwikkeling mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in tweefotonmicroscopie en genetische labeling van neuronale populaties.
- Vereist toegang tot geavanceerde infrastructuur voor beeldvorming en gedragsregistratie.
- Noodzaak van standaardisatie tussen teams voor reproduceerbare ablatie en analyse.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende neuronale circuits of gedragsparadigma's.
- Zorgvuldige controle is vereist om off-target effecten te vermijden en specificiteit te waarborgen.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Title
0:51
Ablation of a Subpopulation of Neurons Using a Two-photon Laser Microscope
4:47
Calcium imaging to Record Prey-Evoked Neuronal Activity in the Pretectum-Ablated Zebrafish Larvae
6:38
Assessment of Behavioral Consequences Following Laser Ablation
7:30
Results: Assessment of Laser Ablated Pretectal Neurons with Calcium Imaging
9:05
Conclusion
