Name: Ablatie van een neuronale bevolking met behulp van een twee-foton Laser en haar beoordeling met Calcium Imaging en gedrags opname in Zebrafish larven (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Leer hoe je specifieke neuronen ablateert in Zebrafish-larven met een twee-foton laser en de gevolgen evalueert via calcium imaging en gedragsanalyse. Deze methode onthult cruciale inzichten over neurale circuits.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studies werden gefinancierd door subsidies ontvangen de MEXT JSPS KAKENHI Grant nummers JP25290009, JP25650120, JP17K07494 en JP17H05984.

<ol><li>Feierstein, C. E., Portugues, R., Orger, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+whole+picture%3A+A+comprehensive+imaging+approach+to+functional+mapping+of+circuits+in+behaving+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Seeing the whole picture: A comprehensive imaging approach to functional mapping of circuits in behaving zebrafish.</a> Neuroscience. 296, 26-38 (2015).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Muto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+visualization+with+an+improved+GCaMP+calcium+indicator+reveals+spatiotemporal+activation+of+the+spinal+motor+neurons+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic visualization with an improved GCaMP calcium indicator reveals spatiotemporal activation of the spinal motor neurons in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (13), 5425-5430 (2011).</li>
<li>Lorent, K., Liu, K. S., Fetcho, J. R., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+space+cadet+gene+controls+axonal+pathfinding+of+neurons+that+modulate+fast+turning+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The zebrafish space cadet gene controls axonal pathfinding of neurons that modulate fast turning movements.</a> Development. 128 (11), 2131-2142 (2001).</li>
<li>Asakawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits+by+Tol2+transposon-mediated+Gal4+gene+and+enhancer+trapping+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1255-1260 (2008).</li>
<li>Sternberg, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+Neurotoxin+to+Investigate+the+Contribution+of+Excitatory+Interneurons+to+Speed+Modulation+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimization of a Neurotoxin to Investigate the Contribution of Excitatory Interneurons to Speed Modulation In Vivo.</a> Curr Biol. , (2016).</li>
<li>Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+zebrafish+behavior+with+halorhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (42), 17968-17973 (2009).</li>
<li>Orger, M. B., Kampff, A. R., Severi, K. E., Bollmann, J. H., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+visually+guided+behavior+by+distinct+populations+of+spinal+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Control of visually guided behavior by distinct populations of spinal projection neurons.</a> Nat Neurosci. 11 (3), 327-333 (2008).</li>
<li>Huang, K. H., Ahrens, M. B., Dunn, T. W., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+projection+neurons+control+turning+behaviors+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Spinal projection neurons control turning behaviors in zebrafish.</a> Curr Biol. 23 (16), 1566-1573 (2013).</li>
<li>Smear, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+glutamate+transport+at+a+central+synapse+limits+the+acuity+of+visual+perception+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Vesicular glutamate transport at a central synapse limits the acuity of visual perception in zebrafish.</a> Neuron. 53 (1), 65-77 (2007).</li>
<li>Bianco, I. H., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visuomotor+transformations+underlying+hunting+behavior+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Visuomotor transformations underlying hunting behavior in zebrafish.</a> Curr Biol. 25 (7), 831-846 (2015).</li>
<li>Trivedi, C. A., Bollmann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visually+driven+chaining+of+elementary+swim+patterns+into+a+goal-directed+motor+sequence%3A+a+virtual+reality+study+of+zebrafish+prey+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Visually driven chaining of elementary swim patterns into a goal-directed motor sequence: a virtual reality study of zebrafish prey capture.</a> Front Neural Circuits. 7, 86(2013).</li>
<li>Jouary, A., Haudrechy, M., Candelier, R., Sumbre, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+2D+virtual+reality+system+for+visual+goal-driven+navigation+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A 2D virtual reality system for visual goal-driven navigation in zebrafish larvae.</a> Sci Rep. 6, 34015(2016).</li>
<li>Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+neuronal+activity+during+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of neuronal activity during perception.</a> Curr Biol. 23 (4), 307-311 (2013).</li>
<li>Del Bene, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filtering+of+visual+information+in+the+tectum+by+an+identified+neural+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Filtering of visual information in the tectum by an identified neural circuit.</a> Science. 330 (6004), 669-673 (2010).</li>
<li>Semmelhack, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dedicated+visual+pathway+for+prey+detection+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A dedicated visual pathway for prey detection in larval zebrafish.</a> Elife. 3, 04878(2014).</li>
<li>Preuss, S. J., Trivedi, C. A., vom Berg-Maurer, C. M., Ryu, S., Bollmann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+object+size+in+retinotectal+microcircuits%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Classification of object size in retinotectal microcircuits.</a> Curr Biol. 24 (20), 2376-2385 (2014).</li>
<li>Romano, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+Neuronal+Network+Dynamics+Reveal+Circuit%27s+Functional+Adaptations+for+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Spontaneous Neuronal Network Dynamics Reveal Circuit's Functional Adaptations for Behavior.</a> Neuron. 85 (5), 1070-1085 (2015).</li>
<li>Barker, A. J., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorimotor+decision+making+in+the+zebrafish+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Sensorimotor decision making in the zebrafish tectum.</a> Curr Biol. 25 (21), 2804-2814 (2015).</li>
<li>Ewert, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9783642675027">Neuroethology: an Introduction to the Neurophysiological Fundamentals of Behavior</a>. , Springer Verlag. (1980).</li>
<li>Muto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+hypothalamic+feeding+centre+upon+visual+prey+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Activation of the hypothalamic feeding centre upon visual prey detection.</a> Nat Commun. 8, 15029(2017).</li>
<li>Muto, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+in+Free-Swimming+Larval+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium Imaging of Neuronal Activity in Free-Swimming Larval Zebrafish.</a> Methods Mol Biol. 1451, 333-341 (2016).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="https://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">THE ZEBRAFISH BOOK, 5th Edition</a>. , University of Oregon Press. (2007).</li>
<li>National BioResource Project Paramecium. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://nbrpcms.nig.ac.jp/paramecium/?lang=en">http://nbrpcms.nig.ac.jp/paramecium/?lang=en</a> (2017).</li>
<li>Fiji. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://fiji.sc">https://fiji.sc</a> (2017).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Mueller, T., Wullimann, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BrdU-%2C+neuroD+%28nrd%29-+and+Hu-studies+reveal+unusual+non-ventricular+neurogenesis+in+the+postembryonic+zebrafish+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">BrdU-, neuroD (nrd)- and Hu-studies reveal unusual non-ventricular neurogenesis in the postembryonic zebrafish forebrain.</a> Mech Dev. 117 (1-2), 123-135 (2002).</li>
<li>Muto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+genetic+analysis+of+visual+behavior+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Forward genetic analysis of visual behavior in zebrafish.</a> PLoS Genet. 1 (5), 66(2005).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen conflicten van belang verslag.

Hoewel de twee-foton laser een uitstekende ruimtelijke resolutie heeft te specifiek lasertherapie individuele neuronen, moet grote voorzichtigheid worden genomen om te voorkomen dat ongewenste schade op het hersenweefsel als gevolg van warmte. De belangrijkste stap in het baarmoederslijmvlies experiment is om te bepalen van de optimale hoeveelheid laser-bestraling. Onvoldoende bestraling mislukt om te doden van de neuronen. Te veel bestraling zal warmte-schade het omringende weefsel, die zal resulteren in ongewenste effe...

Om te begrijpen hoe gedrag vloeit voort uit de neuronale activiteit in de hersenen, is het noodzakelijk om te identificeren van de neurale circuits die bij de generatie van dat gedrag betrokken zijn. Het larvale stadium, de zebravis biedt een ideale dierlijk model voor het bestuderen van de hersenfunctie geassocieerd met het gedrag, omdat hun kleine, transparante hersenen maken het mogelijk om te onderzoeken van neuronale activiteit op een cellulaire resolutie op een breed gebied van de hersenen met inachtneming van de gedrag1. Beeldvorming van neuronale activiteit in specifieke neuronen is mogelijk door de uitvinding van genetisch gecodeerde calcium (Ca) indicatoren (GECIs) zoals GCaMP2geworden. GCaMP transgene zebrafish hebben bewezen nuttig voor het koppelen van het functionele neurale circuit met gedrag door het uitvoeren van Ca imaging in dieren3gedragen.
Terwijl Ca beeldvorming kan aantonen dat de correlaties tussen Neuronale activiteit en gedrag, om aan te tonen van causaliteit, onderdrukking van neuronale activiteit en haar gevolgen op gedrag testen zijn belangrijke stappen. Er zijn verschillende manieren om dit te bereiken: het gebruik van genetische mutatie die wijzigt van specifieke neurale circuits4, uitdrukking van neurotoxines in specifieke neuronen5,6, gebruik van optogenetic hulpmiddelen zoals halorhodopsin7, en laser ablatie van gerichte neuronen8,9. Laser Ablatie is bijzonder geschikt voor het elimineren van de activiteit in een relatief klein aantal specifieke neuronen. Onomkeerbare eliminatie van neuronale activiteit door het doden van neuronen vergemakkelijkt gedragsmatige gevolgen.
Een interessant gedrag dat kan worden waargenomen in het larvale stadium van zebravis is prooi vangen(Figuur 1). Deze visueel geleide, doelgericht gedrag biedt een gunstige experimenteel systeem voor de studie van de gezichtsscherpte10, visuomotor transformatie11,12,13, visuele perceptie en erkenning van objecten14,15,16,17,18en19van de besluitvorming. Hoe prooi wordt herkend door roofdieren en hoe prooi detectie leidt tot prooi vangen van gedrag is een centrale vraag in neuroethology20. In dit artikel focussen we op de rol van het pretecto-hypothalame circuit gevormd door projecties van een kern in de pretectum (nucleus pretectalis superficialis pars magnocellularis, hierna gewoon bekend als de pretectum) aan de ILH. Laser-ablatie van de pretectum bleek te verminderen prooi vangen activiteit en neuronale activiteit in de ILH die is gekoppeld aan de visuele prooi perceptie21af te schaffen. Hier, laser protocollen voor het uitvoeren van ablatie en testen zijn effect met behulp van Ca2 + beeldvorming en gedrags opname in zebrafish larven worden beschreven.

<table><tbody><tr><td>NuSieve GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>Cat.#50080</td><td>low-melting temperature agarose</td></tr><tr><td>6 cm petrischaal</td><td>FALCON</td><td>Product#:351007</td><td></td></tr><tr><td>dissectie naald</td><td>AS ONE Corporation</td><td>Cat. No. 2-013-01</td><td>https://keystone-lab.com/nl/item/detail/404142</td></tr><tr><td>LSM7MP</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>twee-foton laser scanning microscoop</td></tr><tr><td>W Plan-Apochromat 63x/1.0</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>63X objectieflens</td></tr><tr><td>Imager.Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>een epi-fluorescentiemicroscoop</td></tr><tr><td>ZEN</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Beeldverwervingssoftware voor confocale microscopen</td></tr><tr><td>Secure-Seal Hybridisatiekamerpakking, 8 kamers, 9 mm diameter x 0.8 mm diepte</td><td>Molecular Probes</td><td>Catalogusnr. S-24732</td><td>Wordt gebruikt als opnamekamer in Ca-beeldvorming</td></tr><tr><td>Beeldvormingskamers</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5</td><td>Wordt gebruikt als gedragsopnamekamer</td></tr><tr><td>chirurgisch mes</td><td>MANI</td><td>Ophthalmisch mes MST15</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>model:C11440-22CU</td><td>een wetenschappelijke CMOS-camera</td></tr><tr><td>HCImage</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td>beeldverwervingssoftware</td></tr><tr><td>Hard Disk Recording module</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td>Een softwaremodule die het mogelijk maakt om de filmbestanden in korte tijd op een harde schijf op te slaan</td></tr><tr><td>SZX7</td><td>Olympus</td><td></td><td>stereoscoop</td></tr><tr><td>DF PL 0.5X</td><td>Olympus</td><td></td><td>objectieflens voor SZX7</td></tr><tr><td>Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio</td><td>FLIR Systems, Inc.</td><td>Productnr. GS3-U3-41C6NIR-C</td><td>CMOS-camera</td></tr><tr><td>XIMEA xiQ-camera</td><td>XIMEA</td><td>Productnr. MQ042RG-CM</td><td>CMOS-camera</td></tr><tr><td>een ring LED-licht</td><td>CCS</td><td>Model: LDR2-100SW2-LA</td><td>Witte LED</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nylon gaas 32&micro;m</td><td>Tokyo Screen</td><td>N-No.380T</td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/</td></tr><tr><td>Nylon gaas 13&micro;m</td><td>Tokyo Screen</td><td>N-No. 508T-K</td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/</td></tr><tr><td>Metaalzeef 150 micron opening</td><td>Tokyo Screen</td><td></td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami</td></tr><tr><td>Metaalzeef 75 micron opening</td><td>Tokyo Screen</td><td></td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami</td></tr><tr><td>EBIOS</td><td>Asahi Food &amp; Healthcare, Co. Ltd.</td><td></td><td>droge biergist</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td><td>een geïntegreerde ontwikkelomgeving voor programmeren</td></tr><tr><td>Mai-Tai HP</td><td>Spectra Physics&nbsp;</td><td></td><td>twee-foton laser&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ablatie van een neuronale bevolking met behulp van een twee-foton laser en haar beoordeling met calcium imaging en gedrags opname in zebrafish larven

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Ter identificatie van de rol van een subpopulatie van neuronen in gedrag, is het essentieel om te testen van de gevolgen van het blokkeren van de activiteit in levende dieren. Laser ablatie van neuronen is een effectieve methode voor dit doel als neuronen zijn selectief gelabeld met de fluorescerende sondes. In de huidige studie, worden protocollen voor laser geruineerd een subpopulatie van neuronen met behulp van een twee-foton microscoop en het testen van de functionele en gedragsmatige gevolgen daarvan beschreven. In deze studie, wordt prooi vangen gedrag in zebrafish larven gebruikt als een studie-model. Het pretecto-hypothalame circuit is bekend dat ten grondslag liggen aan deze visueel gestuurde prooi vangen van gedrag. Zebravis pretectum waren laser-ablated worden, en neuronale activiteit in de inferieure kwab van de hypothalamus (ILH; het doel van de pretectal projectie) werd onderzocht. Prooi vangen gedrag na pretectal ablatie werd ook getest.

Specifieke neuronen waren genetisch gelabeld met EGFP of GCaMP6s, waarvan de expressie werden verdreven in Gal4 lijnen. Een Gal4 lijn gSAIzGFFM119B werd gebruikt om de label van een nucleus in het pretectal gebied (magnocellular oppervlakkige pretectal kern), en een subpopulatie van bulbus olfactorius neuronen. Een andere lijn van de Gal4, hspGFFDMC76A, werd gebruikt om de label van de ILH. We laser-ablated worden de pretectal neuronen bilateraal (Figuur 2</st...

Hier presenteren we een protocol om een genetisch gelabelde subpopulatie van neuronen door een twee-foton laser vanaf Zebrafish larven lasertherapie.

Ablatie van een neuronale bevolking met behulp van een twee-foton Laser en haar beoordeling met Calcium Imaging en gedrags opname in Zebrafish larven

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Het algemene doel van dit experiment is om het effect van laserablatie van bepaalde neuronen op circuitactiviteit en gedrag te testen. Met deze experimentele techniek kunnen we de noodzaak van neuronen in een circuit dat gedrag onderligt, onderzoeken. Deze methode kan helpen om onze belangrijkste vragen in het gedrags- en neurowetenschappenveld te beantwoorden, zoals hoe prooi wordt waargenomen en hoe prooivangend gedrag wordt gegenereerd door neurale activiteit.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat neuronen specifiek kunnen worden afgebroken vanwege de genetische markering van deze neuronen en ook de hoge ruimtelijke resolutie van de laser. Na het opvoeden van larven en ze in 2% lage smeltende agarose te plaatsen volgens het tekstprotocol, plaats je de in agarose ingebedde larven onder een twee-foton laser-scanning microscoop en start je het microscopiesysteem. Open de beeldverwervingssoftware en klik onder het lasertab op de aan-knop om de laser aan te zetten.Wacht tot de status van de laser verandert van druk in mode locked. Op het kanalentab stel je de golflengte van de laser in op 880 nanometer voor EGFP-ablatie of 800 nanometer voor GCaMP-ablatie. Selecteer de 20X subjectieve lens door de lens revolver handmatig te bewegen.Klik vervolgens op de lokaliseren tab, klik op GFP om de optische paden te wijzigen en bekijk direct de fluorescentie met het oog. Centreer de hersenen van de zebravislarve in het gezichtsveld, klik vervolgens op de verwervingstab om terug te gaan naar twee-foton microscopie en stel de laservermogen en versterking in. Als record van de voorafgaande ablatieconditie klik je op Z stack om de Z stack optie te selecteren.Vervolgens, na het focussen op het ventrale uiteinde van de hersenen van de larve, klik je op de eerste instellen knop om de ondergrens in te stellen en na het focussen op het meest dorsale oppervlak van de hersenen, klik je op de laatste instellen knop om de bovengrens in te stellen. Klik tenslotte op de start experiment knop om de Z stack beeldverwerving te starten. Selecteer vervolgens de 63X subjectieve lens door de lens revolver handmatig te bewegen.Klik vervolgens op de lokaliseren tab om over te schakelen naar epifluorescentie microscopie. Centreer de cellen die moeten worden afgebroken met het oog en klik vervolgens op de verwervingstab om terug te gaan naar laser-scanning microscopie. In de verwervingsmodustab stel je de framegrootte in op 256 bij 256.Klik op live en observeer de interessante neuronen. Zoek vervolgens, beginnend vanaf de meest dorsale zijde, een brandpuntsvlak waarin de cellen die moeten worden afgebroken scherp staan. Gebruik de regiofunctie om een kleine cirkelvormige gebied van ongeveer 1/3 van de grootte van de cel in diameter op elke neuron als een ROI te markeren.Stel de scansnelheid in op 13,9 seconden per 256 bij 256 pixels wat overeenkomt met een laserverblijftijd van ongeveer 200 microseconden per pixel of 200 microseconden per halve micron. Stel ook de herhalingscyclus in op vier herhalingen. Klik op start experiment om de tijdsreeks en verblekingsfuncties uit te voeren.Vergelijk de afbeelding vóór de ablatie met de afbeelding na de ablatie in de tijdsreekscyclus om er zeker van te zijn dat de fluorescentie in de doelcellen verdwenen is. Beweeg vervolgens het brandpuntsvlak iets dieper en kies het volgende brandpuntsvlak waarin onbewerkte cellen verschijnen. Voer de verblekingsfunctie uit zoals zojuist is gedemonstreerd en herhaal het proces totdat alle cellen in de interessante neurale structuur zijn afgebroken.Na de ablatie controleer je de cellen op verdwenen fluorescentie en herhaal je de laserbestraling indien nodig. Na bestraling moeten de larven worden hersteld. Maak voorzichtig kleine loodrechte sneden in de agarose rond de larven.Wacht vervolgens tot de vis uit de agarose op eigen kracht zwemt wanneer de verdoving afneemt. Na het kweken van paramecium en het verdoven van een zebravislarve volgens het tekstprotocol, plaats je de larven in 2% lage smeltpunt agarose en verwijder je onmiddellijk overtollig agarose zodat het oppervlak van de agarose er licht bol uitziet. Gebruik een dissectieneedle om de larven snel in een rechtopstaande positie te plaatsen.Maak vervolgens met een chirurgisch mes een paar kleine sneden in de agarose om de agarose rond het hoofd van de zebravis te verwijderen, waardoor ruimte ontstaat voor de paramecium om te zwemmen. Verwijder voorzichtig de resterende agarose door voorzichtig systeemwater op de kamer te gieten. Plaats vervolgens één paramecium in de opnamekamer om als visueel stimulus te dienen.Plaats vervolgens de opnamekamer onder een epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een wetenschappelijke CMOS-camera en selecteer een 2,5X objectieflens. Start de beeldverwervingstoepassing voor de uitgeruste camera. Klik op het sequentiepaneel en selecteer harde schijf opnemen op het paneel.Stel in het scaninstellingengedeelte het frametelling in op 900 of een andere gewenste totaal aantal frames. In het opnamepaneel stel je de belichtingstijd in op 30 milliseconden en de binning op twee bij twee. Klik op live op het opnamepaneel om de larven in het camerabeeld te lokaliseren en focus en klik vervolgens op stop live en klik op de startknop.Sla de film op in cxd-formaat en analyseer de gegevens volgens het tekstprotocol. Na het opzetten van het gedragsopnamesysteem en het plaatsen van een larve in een opnamekamer volgens het tekstprotocol, gebruik je een micropipet om 50 paramecium te verzamelen en deze in de opnamekamer te plaatsen. Om een deksel op de opnamekamer te plaatsen, doe je een kleine druppel water op het deksel voordat je het op het wateroppervlak van de opnamekamer plaatst om te voorkomen dat lucht in de kamer wordt gebracht.Plaats de opnamekamer in het verlichtingssysteem. Begin vervolgens met de time-lapse opname met 10 frames per seconde gedurende 11 minuten. Voer tenslotte de analyse uit volgens het tekstprotocol.In dit experiment met de Gal4-lijn die kernen in het pretectale gebied en een subpopulatie van reukbolneuronen labelt. De pretec

ablation-neuronal-population-using-two-photon-laser-its-assessment

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier beschrijven we een methode voor het monteren van zebravis embryo's voor de lange termijn imaging, twee-foton beeldvorming en weefsel-schade technieken en time-lapse confocale beeldvorming.

Twee-foton axotomy en time-lapse confocale imaging in levende zebravis embryo&#39;s

Deze video beschrijft de prooivangsttest. De video bespreekt de methode om het vangstgedrag van prooidieren van zebravislarven te bestuderen na de laserablatie van specifieke neuronen.

Prey Capture Assay: een methode om het prooivangstgedrag van zebravislarven te bestuderen

Deze video beschrijft de methode om axonen in zebravisembryo's te verwonden met behulp van twee fotonlaseraxotomie en het observeren van axonale herstel van letsel.

Twee-Foton Laser Axotomie: Een methode om axonen in zebravisembryo's te verwonden en axonale herstel te observeren

This video demonstrates the method for studying visual prey detection in transgenic zebrafish larvae using calcium indicator-based fluoresce imaging with their neurons expressing fluorescent calcium indicator complexes.

Analyzing the Prey-Evoked Neuronal Activity in a Transgenic Zebrafish Larva

Source: Morsch, M.,  et. al., Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (2017) In this video, we explore the technique of high-intensity UV laser ablation for precisely targeting and studying individual neurons in transgenic zebrafish. We demonstrate how to prepare, immobilize, and visualize neuronal responses, highlighting the cellular dynamics of injury and recovery.

Selective Single-Neuron Laser Ablation in a Zebrafish Larva Using a Confocal Microscope

Source: Muto, A., et al. Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (2018) In this video, a two-photon laser ablation procedure is demonstrated, enabling the selective destruction of fluorescent neurons in agarose-immobilized zebrafish larvae. High-resolution imaging before and after the procedure confirms efficient neuronal damage, as observed by the absence of fluorescence.

Targeted Neuronal Ablation Using Two-Photon Microscopy in a Zebrafish Larava

Hoewel het perifere zenuwstelsel (PNS) in staat is om significant herstel na een blessure, is weinig bekend over de cellulaire en moleculaire mechanismen die dit fenomeen regeren. Met behulp van levende, transgene zebravis en een reproduceerbare zenuw doorsnijding test, kunnen we dynamische gliacel gedrag te bestuderen tijdens zenuw degeneratie en regeneratie.

Motor Nerve doorsnijding en Time-lapse beeldvorming van gliacellen Gedrag Live zebravis

Laserablatie is een breed toepasbare technologie voor het bestuderen van regeneratie in biologische systemen. Het gepresenteerde protocol beschrijft het gebruik van een standaard laserscanning confocale microscoop voor laserablatie en de daaropvolgende time-lapse beeldvorming van het regenereren van interneuromastcellen in de zebravis laterale lijn.

Confocale Microscoop-gebaseerde Laser Ablatie en Regeneratie Test in Zebrafish Interneuromast Cellen

Hier presenteren we een protocol om twee-foton calciumbeeldvorming uit te voeren in de dorsale voorhersenen van volwassen zebravissen.

Calciumbeeldvorming met twee fotonen van de activiteit van de voorhersenen bij zich gedragende volwassen zebravissen

Dit protocol beschrijft een twee-foton-laserablatiebenadering die wordt uitgevoerd in zebravislarven, die als model dient om botregeneratie en de effecten van de immuunrespons op ablatie te bestuderen.

Twee-foton laser-gemedieerde ablatie van osteoblasten in zich ontwikkelende zebravislarven

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om neurale activiteit te onderzoeken in hersengebieden van transgene zebravissen die GCaMP-calciumindicatoren tot expressie brengen met behulp van confocale microscopie.

In vivo Confocale fluorescentiebeeldvorming van neurale activiteit geïnduceerd door sensorische stimulatie bij gedeeltelijk ingeperkte larvale zebravissen

Leer hoe je specifieke neuronen ablateert in Zebrafish-larven met een twee-foton laser en de gevolgen evalueert via calcium imaging en gedragsanalyse. Deze methode onthult cruciale inzichten over neurale circuits.

Ablatie van een neuronale bevolking met behulp van een twee-foton Laser en haar beoordeling met Calcium Imaging en gedrags opname in Zebrafish larven (Video) | JoVE Journal

Ablatie van een neuronale bevolking met behulp van een twee-foton Laser en haar beoordeling met Calcium Imaging en gedrags opname in Zebrafish larven

Meer video's verkennen