Name: Preklinische beoordeling van het topicale van de antikanker cumarine-OT48 door spheroïden, kolonie vorming Assays en Zebrafish Xenografts (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Leer preklinische screening van antikankercumarines met 3D-cultuur en zebrafishmodellen. Deze methode biedt inzicht in farmacologische effecten en verbetert betrouwbaarheid van geneesmiddelonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Onderzoek aan de SNU wordt ondersteund door de nationale Stichting voor onderzoek (NRF) door de MEST van Korea voor Tumor communicatie Global Core Research Center (GCRC) subsidie, [subsidie nummer 2011-0030001]; door de Seoul National University onderzoek subsidie en hersenen Korea (BK21) PLUS programma.

1. kolonie vorming Assays
<ol><li>Cultuur A549 cellen bij een concentratie van 20.000 cellen/cm2 in 15 mL RPMI1640 cel kweekmedium aangevuld met 10% FBS (foetale runderserum) en 1% antibiotica in een maatkolf van 75 cm2 in een CO2 incubator bij 37 ° C en 5% CO2.</li>
	<li>Op de dag van het experiment, bepalen van de concentratie van de cel met behulp van een hemocytometer. Verzamelen van 50.000 cellen door centrifugeren bij 400 x g gedurende 7 minuten in een tube van 1,5 mL microcentrifuge en resuspendeer de cellen in 100 µL van 1 x steriel PBS (Phosphate Buffered Saline) in 1,5 mL tubes.</li>
	<li>Afzien 1.1 mL Halfmassief methylcellulose gebaseerde voedingsbodem (MCBM) in 15 mL buisjes met een multipipette. Één buis voorbereiden op elke voorwaarde.</li>
	<li>Voeg 110 µL van FBS 1.1 ml van MCBM met behulp van een P200-micropipet.</li>
	<li>De cellen van de zaden bij 1000 cellen/mL. Verzamelen van 2,4 µL celsuspensie van de stockoplossing (50.000 cellen in 100 µL van 1 x PBS) met behulp van een micropipet P2 en meng 1.1 mL MCBM aangevuld met 10% FBS.</li>
	<li>Na het toevoegen van de gewenste cellen, vortex de buizen voor 1 min, houden ze verticaal op de hoogste snelheid tot MCBM en cellen goed mengen.</li>
	<li>Voeg test verbindingen (OT48 zelfstandig of in combinatie met A1210477). Bereiden van een aparte buis als een besturingselement voor het oplosmiddel gebruikt (hier dimethylsulfoxide (DMSO)). Afhankelijk van de concentratie van de stoffen en het volume voor elke voorwaarde toegevoegd, zal het oplosmiddel besturingselement bevatten de hoogste concentratie oplosmiddel gebruikt voor het verdunnen van de teststof, om te beoordelen voor nadelige gevolgen die veroorzaakt door het oplosmiddel.</li>
	<li>Vortex buizen gedurende 1 minuut.</li>
	<li>Toevoegen voor elke assay, 1 mL van het mengsel met een P1000 micropipet naar het midden goed van een 12-well cel cultuur plaat.</li>
	<li>Vul lege putten met 1 mL steriel water of 1 x PBS te stabiliseren vochtigheid.</li>
	<li>Incubeer cultuur platen voor 10 dagen in een broedmachine bij 37 ° C en 5% CO2.</li>
	<li>Na 10 dagen incubatie, voeg 200 µL van een MTT-(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide)-stockoplossing (5 mg/mL) aan elk putje te bereiken een eindconcentratie van 1 mg/mL.</li>
	<li>Incubeer 10 min in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2. Levensvatbare kolonies zal blijken violet.</li>
	<li>De opname met behulp van een digitale camera met behulp van de witte achtergrond plaat (LAS witte dia tray). Gebruik de volgende instellingen: methode, digitaliseren; Blootstelling type, precision; Belichtingstijd, handleiding, 1 seconde; Gevoeligheid/resolutie, hoge resolutie. Sla de afbeelding in TIFF-indeling.</li>
	<li>Levensvatbare kolonies te kwantificeren door ImageJ software te gebruiken. Kies op de menubalk "afbeelding | Type | 8 bit". Kies op de menubalk "aanpassen | Drempel". Drempel instellen om te bepalen en houden constant voor alle omstandigheden; Kies op de menubalk "Analyze | Analyseren van deeltjes". Gegevens opslaan en analyseren met een statistieken software voor grafische weergave.</li>
</ol>2. sferoïde vorming Assay
<ol><li>Cultuur A549 cellen bij een concentratie van 20.000 cellen/cm2 in 75 cm2 flacons met 15 mL RPMI 1640 voedingsbodem aangevuld met 10% FBS en 1% antibiotica.</li>
	<li>Op de dag van het experiment, bereiden een 96 goed U-bodemplaat.</li>
	<li>Plaat 10.000 cellen in een put waarin al het stof van belang (hier 50 µM van OT48) en/of 20 µM van A1210477. Het uiteindelijke volume aan 100 µL cultuurmedium van de cel. Het aantal cellen die uniforme spheroïden met een intact buitenrand vormen wordt beschouwd als voldoende om het formulier spheroïden.</li>
	<li>Incubeer gedurende 3 dagen in een broedmachine bij 37 ° C en bij 5% CO2.</li>
	<li>Na 3 dagen incubatie, foto's vastleggen van de spheroïden met behulp van een lichte Microscoop met 4 x vergroting.</li>
</ol>3. de zebravis Xenograft Assay
Opmerking: Deze technische aanpak is gevisualiseerd als een schema (Figuur 1).
<ol><li>
Voorbereiding van de voorraad reagentia
	<ol>
<li>Bereiden 1 L voor 30 x Danieau de oplossing: 1740 mM NaCl, 21 mM KCl 12 mM MgSO4∙7H2O, 18 mM Ca (3)2en 150 mM HEPES. Aangepast aan de pH van de buffer aan 7.6 met behulp van een pH-meter.</li>
		<li>Bereiden van 1% (50 x) tricaïne-oplossing: Los 20 mg ethyl 3-aminobenzoaat methanesulfonate (tricaïne) in 2 mL gedestilleerd water.</li>
		<li>1% fenol rood-PBS-oplossing te bereiden: Voeg 2 µL van fenol Red natrium zout oplossing voor 198 µL van gesteriliseerde PBS-oplossing in een buis 1,5 µL.</li>
		<li>3% methylcellulose bereiden: Voeg 3 g methylcellulose tot 100 mL 1 x Danieau de oplossing.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zebravis eiproductie en incubatie
	<ol>
<li>Scheid een vrouwelijke en een mannelijke zebrafish in een partitie tank gevuld met UV-gesteriliseerd en gefilterde leidingwater bij 28,5 ° C in het donker. Meng na 24u van scheiding, vis van beide geslachten tot paring. Bevruchte eieren van de paring tank overbrengen naar een petrischaal met 5 mL van de verse Danieau oplossing.</li>
		<li>Het wassen van eieren driemaal met 5 mL van de Danieau oplossing. Voor het wassen, moet u zorgvuldig de eieren met een pipet en transfer naar 5 mL van de verse oplossing gecombineerd. Incubeer gedurende 8 h bij 28,5 ° C.<ol>
<li>Na 8 uur incubatie in Danieau de oplossing wijzigen in Danieau de oplossing met 0,03% 1-fenyl-2-thioureum (FTU) voor de remming van de pigmentatie. Uitzoeken ondoorzichtige eieren (onbevruchte of met onontwikkelde embryo's) om te voorkomen dat besmetting.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Embryo dechorionation
	<ol>
<li>24 h post bevruchting (hpf), dechorionate zebrafish embryo's met behulp van scherpe pincet. Incubeer broedeieren embryo's in Danieau de oplossing met 0,03% FTU bij 28,5 ° C tot en met 48 hpf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Stof-behandeld cel voorbereiding
	<ol>
<li>Zaad A549 cellen op 20.000 cellen/cm2 in 25 cm2 cultuur kolven. Na 24 h van het zaaien, het toevoegen van verbindingen (hier OT48 bij 50 µM en en/of A1210477 bij 20 µM) gedurende 24 uur in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2. De behandeltijd voor elke verbinding instellen om de levensvatbaarheid van de cellen maar daartoe hen naar de dood van de cel. Ditmaal punt moet individueel worden ingesteld gebaseerd op de levensvatbaarheid van de cellen, morfologie en moleculaire merkers.</li>
		<li>2 h vóór het einde van de behandeling, kleurstof vlek cellen met 4 µM voor fluorescerende cel tracker CM-Dil bij 37 ° C en 5% CO2. Na 2 uur incubatie, trypsinize cellen met 0,05% trypsine-EDTA en Verdun 106 cellen in 50 µL van fenol rood-PBS oplossing vóór injectie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Micro-injectie van kankercellen voor xenograft vorming
	<ol>
<li>Anesthetize zebrafish in een oplossing van 0,02% tricaïne voor 5 min totdat zij zich op een agarplaat vestigen.</li>
		<li>Trek een 1,0 mm (buiten diameter (OD) glazen capillaire) door een micropipet trekker (programma-instellingen: P: 300, warmte: 260, trekken: 60, VEL: 50, en de tijd: 200). Knip de microcapillary met een spuit te produceren een scherpe rand. Laden microcapillaries met 20 µL van cel/fenol rood-PBS oplossing. Instellen van de druk van de injectie en tijd af te zien van 2 nL per injectie.</li>
		<li>Injecteren van 100 – 200 cellen in de dooierzak door injecterend 6 tot 10 nL via 3 tot 5 injecties. Na injectie, mogelijk vis te herstellen voor 10 tot 30 min in 5 mL van de verse Danieau oplossing met FTU oplossing. Verzending vissen in 24-Wells-platen met 1 mL van de Danieau oplossing met FTU oplossing zijn en incubeer gedurende 72 uur bij 28,5 ° C.</li>
		<li>Na 72 uur incubatie, anesthetize vis in een tricaïne oplossing van 0,02% en immobiliseren op een glasplaatje met een daling van 3% methylcellulose. 5 x fotograferen door fluorescentie microscopie bij een golflengte van 620 tot 750 nm.</li>
		<li>Kwantificeren van de grootte van fluorescerende tumoren ImageJ softwarematig. Kies op de menubalk "Analyze | Maatregel". Waarden die overeenkomen met het fluorescent signaal opslaan en analyseren met een statistieken software voor grafische weergave.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulation+of+cell+signaling+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Deregulation of cell signaling in cancer.</a> FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).</li>
<li>Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bioprinting for cancer research.</a> Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).</li>
<li>Santo, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+3D+in+vitro+tumor+models%3A+overcoming+current+pitfalls+of+efficacy+read-outs%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs.</a> Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).</li>
<li>Tanner, K., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+3D+culture+models+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Beyond 3D culture models of cancer.</a> Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289(2015).</li>
<li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture%3A+a+review+of+current+approaches+and+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">3D cell culture: a review of current approaches and techniques.</a> Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).</li>
<li>Talhi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bis%284-hydroxy-2H-chromen-2-one%29%3A+synthesis+and+effects+on+leukemic+cell+lines+proliferation+and+NF-kappaB+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).</li>
<li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17406473">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li>
<li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Tumor+Models%3A+Advantages%2C+Disadvantages%2C+Variables%2C+and+Selecting+the+Right+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).</li>
<li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytostatic+hydroxycoumarin+OT52+induces+ER%2FGolgi+stress+and+STAT3+inhibition+triggering+non-canonical+cell+death+and+synergy+with+BH3+mimetics+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer.</a> Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+to+the+soft-agar+assay+that+permits+high-throughput+drug+and+genetic+screens+for+cellular+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).</li>
<li>Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Cell+Cycle+Imaging+in+a+3D+Cell+Culture+Model+of+Melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma.</a> Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).</li>
<li>Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging-+and+Flow+Cytometry-based+Analysis+of+Cell+Position+and+the+Cell+Cycle+in+3D+Melanoma+Spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53486(2015).</li>
<li>Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+cell+culture+techniques+for+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery.</a> Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).</li>
<li>Ji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dialkyl+resorcinol+stemphol+disrupts+calcium+homeostasis+to+trigger+programmed+immunogenic+necrosis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer.</a> Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De tarieven van de kolonie vorming verkregen met MCBM, is afhankelijk van het celtype. Voor niet-aanhanger cellen, wordt het aantal kolonies meestal veel hoger vergeleken met aanhangend cellen. We hebben vastgesteld dat de A549 cellen gevormd 30 tot 40 kolonies na 10 dagen. Eerder hebben we gemeld voor verschillende leukemie cellen dat aantal kolonies tussen de 200 tot 2509 is. Onze resultaten toonden aan dat OT48 alleen een significante afname van het aantal kolonies alleen niet produceren. Echte...

Kanker wordt veroorzaakt door cellulaire mutaties en dientengevolge de biochemische signaalroutes triggering van ongecontroleerde celdeling en weerstand tegen celdood worden verstoord. Tumoren interfereren met fysiologische functies van spijsverteringsstelsel, zenuwachtig, bloedsomloop systems en vervolgens naburige weefsels1. Ondanks uitgebreid onderzoeksinspanningen blijft kanker de meest voorkomende levensbedreigende ziekte in de wereld2. Precisie geneeskunde is erkend als basis van toekomstige cancer therapeutics. Nieuwe moleculaire entiteiten worden regelmatig getest in combinatie met bestaande geneesmiddelen ter verbetering van de klinische resultaten.
Een van de belangrijke beperkingen in verband met de ontwikkeling van nieuwe efficiënte gerichte therapieën is echter de mislukking van veelgebruikte tests simuleren de exacte biologische uitkomst van drug blootstelling3. Kanker drugontdekking is nog steeds voornamelijk gebaseerd op testen van de werkzaamheid van de therapeutische agenten in kanker cellijnen gekweekte in 2D enkelgelaagde culturen, die moeilijk te valideren in klinische proeven4. Daarom is er een groeiende belangstelling voor de ontwikkeling van betere kanker modellen die beter na te de ingebouwde functies van tumoren in vivo5 bootsen. In de afgelopen jaren resulteerde een groeiende interesse in 3D cultuur modellen in de ontwikkeling van verbeterde methodologieën voor het produceren van 3D tumor modellen5.
Hier presenteren we een aanpak met drie verschillende 3D cel cultuur technieken waardoor ter verbetering van het inzicht in de potentie van de hydroxycoumarin OT486 in combinatie met BH3 mimetics voordat meer in de diepte in vivo tests. Onze werkwijze bestaat uit de kolonie en SFAs te combineren met een in vivo tumor vorming test gebaseerd op een model van de zebravis verder de werkzaamheid van de combinatie van OT48 en BH3 mimetics in Long kankercellen valideren en controleren van de progressie van kanker in een levende organisme.
Kolonie vorming testen worden routinematig gebruikt om te beoordelen van de werkzaamheid van anticancer agents voor zowel vaste als hematopoietische kankers. De test bepaalt de mogelijkheid van een cel te vermenigvuldigen voor onbepaalde tijd en kolonies7te vormen. Het effect van een antikanker agent op de kolonievormende vermogen van de cellen wordt bepaald door de daling van het aantal en/of grootte van de kolonies.
Spheroïden in vitro tumor modellen vertegenwoordigen en dienen als een goedkope screening platform voor anticancer agents. Spheroïden zijn aggregaten van cellen groeien in suspensie of ingesloten in een 3D-matrix. Deze aanpak wordt veel gebruikt voor drug screening en studies van tumor groei, proliferatie en immuun interactie8.
Om volledig te begrijpen de eigenschappen van een nieuwe drug, is het essentieel om uit te voeren in vivo experimenten met knaagdieren. Deze conventionele methode is echter duur en tijdrovend. In de afgelopen jaren werd zebravissen (Danio rerio) een grote schaal bestudeerde laboratorium organisme dat is goedkoper en sneller te verhogen. Tumoren in de zebravis vertegenwoordigen een 3D cel cultuur benadering maar binnen de in vivo -instelling van een gewervelde9ontwikkeld.
Over het geheel genomen gebruiken we hier drie verschillende 3D cultuur benaderingen, met inbegrip van GVO, SFAs en zebrafish in vivo de vorming van de tumor om aan te tonen van de antikanker capaciteit van hydroxycoumarin OT48 in een long kanker A549 cel model in combinatie met BH3 mimetics.

<table><tbody><tr><td>Benodigdheden voor kolonievormingstesten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500</td><td>-20 C&deg;</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td>-20 C&deg;</td></tr><tr><td>Celcultuurflacon T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS-oplossing</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>1,5 ml buis</td><td>Extragene</td><td>Tube-170-C</td><td>RT</td></tr><tr><td>15 ml buis</td><td>Hyundai Micro</td><td>H20015</td><td>RT</td></tr><tr><td>12 wel plaat</td><td>SPL</td><td>30012</td><td>RT</td></tr><tr><td>MethoCult</td><td>StemCell technologies</td><td>4230</td><td>-20 C&deg;</td></tr><tr><td>Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT-poeder)</td><td>Sigma</td><td>M5622</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>LAS4000</td><td>GE Healthcare Technologies</td><td></td><td>RT</td></tr><tr><td>Benodigdheden voor sferoïdvormingstesten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500</td><td>-20 C&deg;</td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td>-20 C&deg;</td></tr><tr><td>Celcultuurflacon T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS-oplossing</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>Corning costar ultra low attachemnt 96 wel plaat</td><td>Corning</td><td>3474</td><td>RT</td></tr><tr><td>Microscopie</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>RT</td></tr><tr><td>Benodigdheden voor zebravis xenografts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500</td><td>-20 C&deg;</td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td>-20 C&deg;</td></tr><tr><td>Celcultuurflacon T25</td><td>SPL</td><td>70025</td><td>RT</td></tr><tr><td>Celcultuurflacon T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>Celcultuurflacon T175</td><td>SPL</td><td>71175</td><td>RT</td></tr><tr><td>1,5 ml buis</td><td>Extragene</td><td>Tube-170-C</td><td>RT</td></tr><tr><td>24 wel plaat</td><td>SPL</td><td>30024</td><td>RT</td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>SPL</td><td>10100</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS-oplossing</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71382</td><td>RT</td></tr><tr><td>Kaliumchloride (KCL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>RT</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat heptahydraat (MgSO4.7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td>RT</td></tr><tr><td>Calciumnitraat tetrahydraat (Ca(NO3)2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1396</td><td>RT</td></tr><tr><td>HEPES-oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>RT</td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaat (Tricaine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>RT</td></tr><tr><td>Fenolrode oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>RT</td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td>RT</td></tr><tr><td>1-fenyl-2-thioureum (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td>RT</td></tr><tr><td>CM-Dil kleurstof</td><td>Invitrogen</td><td>C7001</td><td>-20 C&deg;</td></tr><tr><td>Glazen capillair</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW 100F-4</td><td>RT</td></tr><tr><td>Micropipettrekker</td><td>Shutter instrument, USA</td><td>P-97</td><td>RT</td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV820</td><td>RT</td></tr><tr><td>Spuit</td><td>KOVAX</td><td>1ml</td><td>RT</td></tr><tr><td>Micro lader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>RT</td></tr><tr><td>Glazen plaat</td><td>Marienfeld</td><td>HSU-1000612</td><td>RT</td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscopie</td><td>Leica</td><td>DE/DM 5000B</td><td>RT</td></tr></tbody></table>

preklinische beoordeling van het topicale van de antikanker cumarine-ot48 door spheroïden, kolonie vorming assays en zebrafish xenografts

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

In vitro en in vivo pre-klinische screening van nieuwe therapeutische agenten zijn een essentieel onderdeel van de Geneesmiddelenontwikkeling kanker. Hoewel menselijke kanker cellijnen inspelen op de therapeutische bestanddelen in 2D (dimensionale) enkelgelaagde celculturen, werden 3D cultuur systemen ontwikkeld om te begrijpen van de werkzaamheid van geneesmiddelen in meer fysiologisch relevante modellen. In de afgelopen jaren, werd een paradigmaverschuiving waargenomen in de pre-klinisch onderzoek voor het valideren van de potentie van nieuwe moleculen in 3D cultuur systemen, preciezer het nabootsen van de communicatie van de tumor. Deze systemen karakteriseren de ziekte staat in een meer fysiologisch relevante wijze en helpen om beter mechanistische inzicht en begrip van de farmacologische werkzaamheid van een bepaalde molecule te winnen. Bovendien, met de huidige trend bij het verbeteren van in vivo modellen van kanker, zebravis heeft ontpopt als een belangrijk gewervelde model om te beoordelen in vivo de vorming van de tumor en studie van het effect van therapeutische agenten. Hier, we onderzocht de therapeutische werking van hydroxycoumarin OT48 alleen of in combinatie met BH3 mimetics in long kanker cellijn A549 met behulp van drie verschillende 3D cultuur systemen met inbegrip van de kolonie vorming assays (CFA), sferoïde vorming assay (SFA) en in vivo zebrafish xenografts.

In Figuur 2cel longkanker lijn A549 was uitgezaaid in MCBM aan vorm kolonies na behandeling met OT48 alleen of in combinatie met BH3 mimetische A1210477 bij de aangegeven concentraties. De resultaten toonden aan dat de combinatie aanzienlijk verminderd aantal, de grootte en de totale oppervlakte van de koloniën na 10 dagen incubatie.
In Figuur 3, A549 cellen werden beha...

Hier presenteren we de preklinische screening van antikanker coumarinen met behulp van 3D-cultuur en zebravissen.

Preklinische beoordeling van het topicale van de antikanker cumarine-OT48 door spheroïden, kolonie vorming Assays en Zebrafish Xenografts

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van geneesmiddelontdekking om het antikankereffect te identificeren en een beter mechanistisch inzicht te verkrijgen in nieuwe moleculen met behulp van in vitro en in vivo 3D-kweeksystemen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de verscheidenheid aan farmacologische effecten van verbindingen in een fysiologisch relevanter in vivo-model. Om te beginnen, plateer 20.000 A549-cellen per vierkante centimeter in 15 milliliters RPMI 1640-celkweekmedium, aangevuld met 10%FBS en 1% antibiotica, in een 75 vierkante centimeter fles.Incubeer de kweek bij 37 graden Celsius en 5%CO2. Op de dag van het experiment, gebruik een hemocytometer om de celconcentratie te bepalen. Verzamel 50.000 cellen in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis door centrifugatie bij 400g gedurende zeven minuten en suspendeer de cellen in 100 microliters steriele 1x PBS.Gebruik een multipipet om 1,1 milliliter semi-solid methylcellulose-gebaseerd medium, of MCBM, in buizen te doseren, en bereid voor elke conditie één buis voor. Voeg vervolgens 110 microliters FBS toe aan elke buis. Bewaar vervolgens 1000 cellen per milliliter.Pipet vervolgens 2,4 microliters van de stamcelonoplossing in de buizen met MCBM en FBS. Nadat de cellen zijn toegevoegd, houd de buizen verticaal en vortex ze op de hoogste snelheid gedurende één minuut om het MCBM en de cellen grondig te mengen. Voeg nu het testverbinding OT48 alleen of in combinatie met A1210477 toe aan de monsters.Bereid een aparte buis voor als controle voor het gebruikte oplosmiddel, zoals DMSO. Vortex de monsters vervolgens gedurende één minuut. Pipet voor elke assay één milliliter van het mengsel in het middelste putje van een 12-putjes kweekplaat.Gebruik vervolgens één milliliter steriel water of PBS om de lege putjes te vullen. Incubeer de platen bij 37 graden Celsius en 5%CO2 gedurende 10 dagen. Voeg vervolgens 200 microliters van een vijf milligram per milliliter MTT stakoplossing toe aan elk putje.Nadat de platen gedurende tien minuten zijn geïncubeerd, controleer op levensvatbare kolonies die violet zullen worden. Gebruik een witte achtergrondplaat om afbeeldingen vast te leggen met de volgende instellingen: Kies voor methode digitaliseren. Kies voor belichtingstype precisie.Kies voor belichtingstijd handmatig en één seconde. Kies voor gevoeligheid en resolutie hoge resolutie. Sla de vastgelegde afbeeldingen vervolgens op in TIFF-formaat.Kwantificeer met ImageJ-software levensvatbare kolonies door het menu afbeelding, type, 8-bit te selecteren. Selecteer menu aanpassen en drempel. Stel de drempel in op controle en houd deze constant voor alle omstandigheden.Selecteer vervolgens menu analyseren, analyseer deeltjes. Bewaar de gegevens en analyseer deze met een statistische software voor grafische weergave. Nadat de stamreagentia volgens het tekstprotocol zijn bereid, scheid een vrouwtje en een mannetje zebravis in een scheidingstank gevuld met UV-gesteriliseerd en gefilterd leidingwater bij 28,5 graden Celsius en plaats ze in het donker.Na 24 uur scheiding, verwijder de scheiding om paring te initiëren. Breng bevruchte eieren van de paringstank over naar een petrischaal met vijf milliliters verse Danios-oplossing. Gebruik vijf milliliters Danios-oplossing om de eieren drie keer te wassen door met behulp van een pipet voorzichtig de eieren te aspireren en ze over te brengen naar vijf milliliters verse oplossing.Incubeer vervolgens de eieren bij 28,5 graden Celsius gedurende acht uur. Verander naar Danios-oplossing met 0,03%PTU om pigmentatie te remmen en sorteer ondoorzichtige onbevruchte eieren om besmetting te voorkomen. 24 uur na de bevruchting, gebruik scherpe pincetten om de embryo's te decorioneren.Incubeer vervolgens de embryo's in Danios-oplossing met PTU tot 48 uur na de bevruchting. Nadat de A549-cellen zijn gezaaid en geïncubeerd met verbindingen volgens het tekstprotocol, voeg 24 uur voor het einde van de behandeling vier micromolar van de fluorescerende celtrackerkleurstof, CM-Dil, toe om de cellen te kleuren en incubeer ze gedurende twee uur. Na de incubatie, gebruik 0,05% Trypsin-EDTA om de cellen te trypsiniseren.Verdun vervolgens tien tot de zesde cellen in 50 microliters fenolrode PBS-oplossing voorafgaand aan injectie. Trek een glas capillair van 1,0 millimeter met de volgende programma-instellingen om micro-injectie van kankercellen uit te voeren: Gebruik een spuit om de capillair te snijden om een scherpe rand te produceren. Laad vervolgens de microcapillair met 20 microliters van de fenolrode celoplossing.Nadat de zebravissen volgens het tekstprotocol zijn verdoofd, injecteer 100 tot 200 cellen in de dooierzak door zes tot tien nanoliters via drie tot vijf injecties te injecteren. Micro-injecties moeten zeer voorzichtig en nauwkeurig worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat het juiste volume van de cellen wordt geïnjecteerd en injectiebeschadiging minimaal is en de kooldioxidedruk optimaal moet zijn om een fissuur lateraal te voorkomen. Laat de vissen na de injectie tien tot 30 minuten herstellen in vijf milliliters verse Danios-oplossing met PTU.Breng de vissen over in 24-putjes platen met één milliliter Danios PTU-oplossing en incubeer ze gedurende 72 uur bij 28,5 graden Celsius. Na de incubatie, na het verdoven van de vissen volgens het tekstprotocol, immobiliseer ze op een glazen plaat met een druppel 3% methylcellulose. Neem 5x fluorescerende beelden op bij een golflengte van 620 tot 750 nanometer.Gebruik ImageJ-software om de grootte van fluorescente tumoren te kwantificeren door analyse en meting te selecteren. Bewaar vervolgens de fluorescentiewaarden en analyseer ze met een statistische software voor grafische weergave. In dit experiment werd longkankercellijn A549 gezaaid in MCBM om kolonies te vormen na behandeling met OT48 alleen of in combina

preclinical-assessment-bioactivity-anticancer-coumarin-ot48-spheroids

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Deze video beschrijft de techniek om een van zebravispatiënt afgeleid xenograftmodel te maken. In het monsterprotocol beoordelen we de efficiëntie van de geneesmiddelen Gemcitabine en Navitoclax op het xenograftmodel van de pancreastumor.

Zebravis patiënt-afgeleide Xenograft (zPDX): een kankermodel

This video describes the colony formation assay, which helps determine lung cancer cells' ability to proliferate indefinitely and form individual colonies. We can analyze the effect of an anticancer agent on the colony-forming cells by analyzing the changes in the number and/or size of the resulting colonies.

Colony Formation Assay: Assessing the Efficacy of Anticancer Agents on Colony-Forming Lung Cancer Cells

This video describes the zebrafish xenograft assay to assess in vivo tumor formation and study the effect of therapeutic agents.

Zebrafish Xenograft Assay: A Method to Assess the Anti-cancer Efficacy of Therapeutics on Tumorigenicity in Zebrafish In Vivo

This video describes a method to screen for the melanoma modifying genes using a transgenic zebrafish tumor model. When injected with a melanoma-inducing miniCoopR vector, the zebrafish develops melanomas and can therefore be used to study the genetic factors affecting tumor development in zebrafish.

miniCoopR Vector-based Transgenesis: A Technique to Screen Melanoma-inducing Genes in Zebrafish Tumor Model

Een snelle manier om te screenen op melanoom modifiers met behulp van een zebravis autochtone tumor model gepresenteerd. Het maakt gebruik van de miniCoopR vector waarmee expressie van genen kandidaat melanoom in melanocyten. Een methode om melanoom-vrije overleving bochten, een invasie assay, een protocol voor antilichaam kleuring van schaal melanocyten en een melanoom transplantatie assay te verkrijgen zijn beschreven.

Screening op Melanoom Modifiers het gebruik van een zebravis Autochtone tumormodel

Deze werkwijze gebruikt zebravisembryo's efficiënt testen vasculaire invasieve vermogen van kankercellen. Fluorescerende kankercellen worden geïnjecteerd in de precardiac sinus of dooierzak ontwikkelende embryo's. cel kanker vasculaire invasie en extravasatie wordt beoordeeld via fluorescentie microscopie van de staart regio 24-96 uur later.

Het testen van de Vasculaire Invasieve Vermogen van kankercellen in zebravis (<em&gt; Danio Rerio</em&gt;)

Zebrafish xenograft modellen zorgen voor high-throughput drug screening en fluorescerende beeldvorming van menselijke kankercellen in een in vivo micro-omgeving. We ontwikkelden een workflow voor grootschalige, geautomatiseerde medicijnscreening op patiënt-afgeleide leukemiemonsters bij zebravissen met behulp van een geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop uitgeruste imaging unit.

Drug Screening van primaire patiënt afgeleid tumor Xenografts bij zebravissen

Hier bieden we een stapsgewijs protocol, met tips om xenograften te genereren en richtlijnen voor tumorgedragsanalyse, whole-mount immunofluorescentie en confocale beeldvorming kwantificering.

Generatie zebravislarven xenografts en tumorgedragsanalyse

Preklinische modellen zijn bedoeld om de kennis van kankerbiologie te vergroten en de werkzaamheid van de behandeling te voorspellen. Dit artikel beschrijft de generatie van op zebravissen gebaseerde patiënt-afgeleide xenografts (zPDXs) met tumorweefselfragmenten. De zPDXs werden behandeld met chemotherapie, waarvan het therapeutische effect werd beoordeeld in termen van celapoptose van het getransplanteerde weefsel.

Oprichting van zebravispatiënt-afgeleide xenografts van alvleesklierkanker voor chemosensitiviteitstests

Het huidige protocol beschrijft het genereren van 3D-tumorcultuurmodellen van primaire kankercellen en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen met behulp van cel-levensvatbaarheidstests en microscopische onderzoeken.

Het vaststellen van 3-dimensionale sferoïden uit van de patiënt afgeleide tumormonsters en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen

Dit protocol beschrijft een screeningprocedure voor geneesmiddelen bij zebravislarven 3-7 dagen na de bevruchting, gevolgd door morfologische beoordeling.

Screening van kleine moleculen en toxiciteitstesten bij zebravislarven in een vroeg stadium

Leer preklinische screening van antikankercumarines met 3D-cultuur en zebrafishmodellen. Deze methode biedt inzicht in farmacologische effecten en verbetert betrouwbaarheid van geneesmiddelonderzoek.

Preklinische beoordeling van het topicale van de antikanker cumarine-OT48 door spheroïden, kolonie vorming Assays en Zebrafish Xenografts (Video) | JoVE Journal

Preklinische beoordeling van het topicale van de antikanker cumarine-OT48 door spheroïden, kolonie vorming Assays en Zebrafish Xenografts

Meer video's verkennen