Eenvoudig en effectief beheer en visualisatie van deeltjes in de bloedsomloop van kleine vissen met behulp van nier injectie

Het algemene doel van deze procedure is om een techniek te demonstreren voor het introduceren van microdeeltjes in het circulatoire systeem van volwassen zebravissen door injectie in de visnier. De geïntroduceerde microdeeltjes worden verder gevisualiseerd in de vaten door een eenvoudige techniek van intravitale beeldvorming in de viskieuwen. Deze procedure kan worden gebruikt, bijvoorbeeld, om herhaalde metingen van visbloed pH in vivo uit te voeren door de introductie van micro-ingekapselde fluorescerende sondes voor pH.

Om dit te doen, wordt in de eerste fase de pH-gevoelige kleurstof SNARF-1 geconjugeerd met dextran in de semi-permeabele polyelektrolytschellak ingekapseld met behulp van een laag-voor-laag benadering. De fluorescerende kleurstof wordt mede-geprecipiteerd in poreuze calciumcarbonaat microkernen, en de kernen worden bedekt met meerdere lagen van tegengesteld geladen niet-biodegradeerbare polymeren en bovendien bedekt met een biocompatibel polymeer dat polyethyleenglycol bevat. Vervolgens worden calciumcarbonaat kernen opgelost om gehele microcapsules te verkrijgen die SNARF-1 omvatten.

In de tweede fase van de visanesthesie en fixatie worden voorbereide microcapsules direct in de nier van het dier geïnjecteerd om de ingekapselde kleurstof in het viscirculatoire systeem af te leveren. Vervolgens is minimale chirurgie nodig om de kieuwdeksel te verwijderen en de capillairen van de viskieuwen te ontblooten. Dan kan de visualisatie van microcapsules in het bloed en het opnemen van het fluorescentiespectrum in vivo worden gedaan door intravitale microscopie om de bloed-pH te controleren.

Wanneer de injectie goed wordt uitgevoerd, is het mogelijk om fluorescerende microcapsules in de viskieuwen onmiddellijk na de procedure te observeren. Het spectrum van de fluorescentie van de ingekapselde sonde kan worden opgenomen met behulp van een spectrometer gekoppeld aan een fluorescerende microscoop. SNARF-1 heeft twee emissiepieken, en de verhouding tussen twee golflengten die overeenkomen met die pieken kan worden gebruikt om pH te meten.

De voorgestelde procedure maakt het mogelijk om fluorescerende microcapsules in het viscirculatoire systeem te brengen en de fluorescentie in visbloed in vivo op afstand te controleren. In het geval van fysiologisch onderzoek is het belangrijkste voordeel van deze methode herhaalde metingen van bloedparameters in kleine laboratoriumdieren, die meestal moeilijk uit te voeren zijn. Als een lichtgevoelige fluorescerende sonde wordt gebruikt, is het raadzaam om de hele procedure in een lichtverminderde ruimte uit te voeren.

Meng twee milliliter oplossing van een gekozen polymeer-gebonden fluorescerende kleurstof hier, SNARF-1-dextran, met 0,6 milliliter van een een molaire calciumchloride-oplossing en 0,6 milliliter van een een molaire natriumcarbonaat-oplossing onder snelle roeren. In deze stap worden poreuze calciumcarbonaat microkernen die de fluorescerende kleurstof omvatten, gesynthetiseerd. Na vijftien seconden roeren, breng de suspensie over naar twee milliliter microbuizen en centrifugeer gedurende vijftien seconden om calciumcarbonaat microkernen te bezinken.

Gooi het supernatant weg, was de kernen met ongeveer twee milliliter gedeïoniseerd water en schud de suspensie op. Herhaal de centrifugatie en wasprocedure drie keer. Incubeer de suspensie gedurende een minuut in een ultrasoon bad om de aggregatie van de microkernen te verminderen.

Resuspendeer de calciumcarbonaat microkernen in ongeveer twee milliliter van een oplossing van vier microgram per milliliter van het kationische polymeer PAH om de eerste polymeerlaag op de templates af te zetten. Houd de microkernen in de pH-oplossing gedurende ongeveer vijf minuten met constant schudden. Na vijftien seconden centrifugeren, gooi het supernatant met ongebonden PAH weg en was de microkernen met water drie keer door meerdere centrifugatie- en wasstappen.

Herhaal dezelfde procedure met een oplossing van vier milligram per milliliter van anionisch polymeer PSS om de tweede polymeerlaag op de templates af te zetten. Vlak voordat de volgende laag wordt toegevoegd, is het raadzaam om een minuut incubatie in een ultrasoon bad toe te passen. Herhaal sequentieel de afzetting van kationische en anionische polymeren zes keer om een 12-laags microcapsules-schellak te verkrijgen.

Incubeer vervolgens microkernen met schellen in de polyethyleenglycol-gegrafte poly-L-lysine gedurende ten minste twee uur. Was vervolgens de bedekt microkernen eenmaal met water door sequentiële centrifugatie en resuspendatie. Los tenslotte de calciumcarbonaat templates op in twee milliliter van een 0,1 molaire EDTA-oplossing, aangepast tot een pH van ongeveer 7,1, om holle microcapsules te verkrijgen.

Gooi het supernatant weg na 45 seconden centrifugeren, en herhaal het wassen met EDTA twee keer. Gooi het supernatant weg na 45 seconden centrifugeren, en voeg twee milliliter zoutoplossing toe. Herhaal wascentrifugeer-stappen met zoutoplossing drie keer.

Onderzoek de grootteverdeling en concentratie van de bereide microcapsules in een hemocytometer onder een fluorescerende microscoop. Gebruik ImageJ of gelijkwaardige software voor grootteanalyse van de deeltjes. Bewaar verkregen ingekapselde sonde in het donker.

Om het optisch systeem voor te bereiden, plaats de vereiste set fluorescerende filters in de fluorescerende microscoop volgens de kenmerken van de toegepaste fluorescerende kleurstof, en zet de fluorescerende lamp aan. Trek de hendel naar de oogstukken. Verbind de optische vezel aan het ene uiteinde naar de spectrometer en aan het andere uiteinde naar een collimator.

Gebruik adapters om de collimator in het brandpunt van de camerabuis of een andere beschikbare poort van de fluorescerende microscoop te spelen. Voor kalibratie van de bereide microcapsules, plaats ongeveer vijf microliter van de microcapsule-suspensie op een microscoopglas en droog de druppel op een donkere plaats. Zet de spectrometer aan.

Voer het spectrometer besturingsprogramma uit, en bereid de spectrometer voor metingen. Om de spectrale kenmerken van de micro-ingekapselde SNARF-1 te kalibreren, gebruik een serie buffers met verschillende pH. Laat ongeveer 10 microliter natriumbuffer vallen op de gedroogde microcapsules met SNARF-1, en dek het af met een dekglas.

Plaats een glazen plaatje op de microscoop-trap. Lokal