Generatie van menselijke nasale epitheliale cel spheroïden voor geïndividualiseerde Cystic Fibrosis Transmembrane huidgeleiding Regulator studie

Het doel van deze procedure is om menselijke nasale celsferoïden te genereren die uiteindelijk kunnen worden gebruikt als een assay voor functionele CFTR-studies. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het cystic fibrosis-veld, zoals het beoordelen van de respons van een individueel subject op CFTR-altererende geneesmiddelen in een ex vivo modelsysteem. Het grote voordeel van deze techniek is dat een groot aantal sferoïds wordt gegenereerd in een relatief korte tijdspanne vanuit een klein nasocellenmonster, wat uitgebreide tests mogelijk maakt.

De procedure wordt gedemonstreerd door Lauren Strecker en Jessica Moncivaiz, technici uit mijn laboratorium. Na het verwerken en uitbreiden van humane nasale epitheel- of HNE-cellen op feederfibroblasten volgens het protocol in de tekst, breng je eerder voorbereide expansiemedium, differentiatiemedium, 0,1% Trypsin EDTA-oplossing en steriel PBS gedurende 30 minuten op kamertemperatuur. Gebruik vervolgens 70% ethanol om de containers te reinigen en breng ze over naar een schone bioveiligheidscabinet.

In het bioveiligheidskabinet, gebruik je een Pasteur-pipet die aan een vacuümlijn is bevestigd om het medium uit HNE-kweek te aspireren en weg te gooien. Gebruik vervolgens met een schone serologische pipet vijf milliliter PBS om de schaal te wassen door de buffer toe te voegen, te schudden en te aspireren. Voeg vijf milliliter 0,1% Trypsin EDTA-oplossing toe aan de kweek en plaats deze terug in de incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende vijf minuten.

Controleer vervolgens onder een omgekeerde microscoop bij vier tot 10X of de cellen loslaten van de schaal, rond worden en zweven. Tik voorzichtig op de zijkant van de kweekschaal om de cellen los te maken en indien nodig, incubeer de schaal nogmaals gedurende vijf minuten totdat de meeste cellen loslaten. Vervolgens gebruik je met een 10 milliliter serologische pipet vijf milliliter expansiemedium in de schaal en verzamel je alle vloeistof in een gelabelde steriele 50 milliliter conische buis.

Als er na drie rondes trypsinisatie nog cellen aan de kweekschaal blijven hechten, gebruik je een steriele celschraper om de resterende cellen voorzichtig los te maken en met vijf milliliter expansiemedium, was je de schraper en de schaal en verzamel je de inhoud in dezelfde gelabelde conische buis. Centrifugeer de buis gedurende vijf minuten bij 360 keer g in vier graden Celsius. Aspireer het supernatant en gebruik één milliliter expansiemedium om het celpelletje te resuspenderen.

Gebruik vervolgens een hemocytometer om de cellen te tellen. Ontdooi de basement membrane matrix op ijs volgens de instructies van de fabrikant. Scheid een geschikt aantal differentieel trypsiniseerde passagecellen voor een eindconcentratie van 500.000 cellen per milliliter van de matrix.

Voor een vier-wel plate gebruik je 200.000 cellen en verzamel ze in een 1,5 milliliter buis. Centrifugeer vervolgens het celmengsel bij niet meer dan 360 keer g gedurende vijf minuten. Gebruik vervolgens een één milliliter pipet om het medium volledig en voorzichtig te aspireren en weg te gooien, zorg ervoor dat je het cellenpelletje niet verstoort.

Houd de buis met cellen op ijs wanneer je het niet actief aan het hanteren bent. Gebruik een één milliliter pipettip om 100 microliter van de basement membrane matrix per geplande put toe te voegen aan de cellen. Terwijl je de pipettip niet volledig leegzuigt om de introductie van luchtbellen te voorkomen, pipetteer je op en neer om de cellen voorzichtig en grondig te resuspenderen.

Beweeg snel om stolling van de matrix te voorkomen. Gebruik een schoon stel schaar om de distale drie tot vier millimeter van een 200 microliter pipettip af te knippen. Pipetteer vervolgens voorzichtig en langzaam een 100 microliter druppel van het celmatrixmengsel in het midden van elke put, zorg ervoor dat de druppel sfeervormig blijft en de zijkanten van de put niet raakt.

Incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide totdat deze stevig is. Pipetteer vervolgens voorzichtig 500 microliter differentiatiemedium in elke put, zorg ervoor dat je de matrixdruppel niet verstoort. Zorg ervoor dat het medium de druppel net bedekt en voeg indien nodig meer toe.

Om HNE sferoïds te kweken, gebruik je met een één milliliter pipettip voorzichtig alle medium uit de put te aspireren terwijl je de matrix vermijdt, die de sferoïds zal vernietigen. Voeg vervolgens met een nieuwe één milliliter pipettip en terwijl je de matrix niet raakt of verstoort, voorzichtig 500 microliter differentiatiemedium toe aan de put rond de matrix. Blijf de sferoïds incuberen en vervang het differentiatiemedium drie keer per week zoals net gedemonstreerd.

Evalueer dagelijks de sferoïdmorfologie onder een omgekeerde microscoop bij 20X vergroting. Sferoïds zouden zich binnen drie tot vijf dagen na het plateren moeten vormen en binnen ongeveer 10 dagen volwassenheid moeten bereiken. HNEs zouden zich binnen 72 uur na het zaaien aan de kweekschaal moeten hechten en kleine eilandjes moeten vormen.

Voorbeelden van goede en slechte eilandvorming na een week worden hier getoond. Eilandjes zouden zich moeten uitbreiden om de schaal te bedekken gedurende een periode van 15 tot 30 dagen. Binnen de eerste drie tot vier dagen van de kweek, zouden kleine cystische structuren zich in de matrix moeten beginnen te vormen en gedurende ongeveer 10 dagen moeten rijpen.

Als gezaaid bij de beschreven dichtheid, zullen succesvolle culturen 50 tot 100 sferoïds per matrixdruppel bevatten. De lumina kunnen relatief helder zijn zoals bij wild-type CFTR of gevuld met cellulair puin en slijm zoals bij CF sferoïds. Het maskeren om het luminale gebied van de sferoïds af te bakenen wordt in deze twee panelen gedemonstreerd.

Hier worden voorbeelden getoond van slecht gevormde onsuccesvolle sferoïdcultuur. Zoals geïllustreerd in deze grafieken uit functionele assays, zouden sferoïds van subjecten met wild-type CFTR binnen een uur moeten zwellen wanneer gesti