Name: Een Ecdysone Receptor gebaseerde enkelvoud Gene schakelaar voor bewuste expressie van transgenic met te verwaarlozen Leakiness, robuustheid en reversibiliteit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Leer transgenexpressie moduleren met het pEUI(+) genenschakelaarsysteem in HEK 293-cellen via tebufenozide-inductie. Deze methode biedt precieze controle over timing en sterkte van genactivatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken S-Y Choi (Chonnam National University) voor waardevolle opmerkingen en grondige lezing van onze manuscript. Dit werk werd gesteund door een fonds voor onderzoek van de Chungnam National University.

1. transgenic Subcloning
<ol><li>Kies een geschikte restrictie-enzym erkenning site (of sites) in de MCS-server voor pEUI(+) en subclone het gen van belang in de gewenste richting (Figuur 1). Opmerking: De ankyrin van EGFP of vlag epitoop-gelabeld Herhaal domein 13A subcloned (ANKRD13A) transgenic was in EcoRI site van het pEUI(+) vector met behulp van de polymerase van DNA van de T4 in een reeks - en Afbinding-onafhankelijke methode19klonen.</li>
	<li>Linearize de pEUI(+) met EcoRI gedurende 1 uur bij 37 ° C. Mix-50 ng/µL van gelineariseerde pEUI(+) met 40 ng/µL van het PCR-versterkte EGFP of ANKRD13A, en reageren met T4 DNA polymerase (1 U) voor 1 minuut bij kamertemperatuur (RT) voordat de incubatie op ijs voor 10 min. toevoegen 10 µL van het reactiemengsel rechtstreeks naar 100 µL DH10B bevoegde cellen voor de volgende transformatie experimenteren. Opmerking: Hoewel verschillende restrictie-enzym erkenning sites werden toegevoegd aan de MCS-server voor pEUI(+) (figuur 1B), raden we het target-gen subcloning in de EcoRI site, afbinding-onafhankelijke klonen technologie19,20.</li>
	<li>Controleer de invoegen door sequentiebepaling en vervolgens zuiveren het DNA met een kit voor de zuivering van DNA die geschikt is voor Transfectie.</li>
</ol>2. een voorbijgaande transfectie en Teb behandeling
<ol><li>Bereiden vier cel cultuur gerechten (60 mm doorsnede) met vers gepasseerd HEK293 cellen in 5 mL Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 5-10% foetale runderserum (FBS) en antibiotica (100 U/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine). Hierna, vertegenwoordigt "drager van de cultuur van de cel" of gewoon "voedingsbodem" de DMEM aangevuld met FBS en antibiotica. Handhaven van de cellen van de HEK293 bij 37 ° C.</li>
	<li>Transfect 1 µg gezuiverde DNA in de cellen van de HEK293 bij 50-60% dichtheid met behulp van 3 µL van transfectiereagens. Toevoegen van de transfectiereagens aan 200 µL verdunningsmiddel (DMEM zonder FBS en antibiotica) met het DNA. Na de incubatie van het reactiemengsel gedurende 30 minuten op RT, toevoegen het mengsel op de HEK-293-cellen op de schotel van cultuur. Twee gerechten gebruiken voor transfectie, en laat de andere twee onbehandeld als besturingselementen.</li>
	<li>Na 12-24 h van transfectie, Teb (eindconcentraties, 0.2 - 10 µmol) de transfected voorbeelden en toevoegen aan een van de besturingselementen niet-transfected. Laat de overige twee monsters onbehandeld als experimentele besturingselementen. Opmerking: De Teb stockoplossing (50 mM opgelost in dimethylsulfoxide) kan worden verdund in cel kweekmedium, DMEM of -fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met een geschikte concentratie alvorens toe te voegen aan de gekweekte cellen afhankelijk van de experimentele parameters. Echter, als gevolg van de lage oplosbaarheid van Teb in waterige oplossing, vermijdt voorbereiding van een master mix met een hoge concentratie van Teb in medium; in plaats daarvan, vervang het kweekmedium volledige cel met verse medium dat Teb op de gewenste concentratie.</li>
	<li>Cultiveren van de Teb behandeld en onbehandeld cellen gedurende 12-48 uur bij 37 ° C.</li>
	<li>Als met behulp van de EGFP invoegt, analyseren expressie van EGFP onder een fluorescente microscoop ( Figuur 2). Anders oogst de cellen voor een immunoblotting assay.<ol>
<li>Voor de immunoblotting assay, spoel de cellen tweemaal met ijskoude PBS en dan Schraap hen uit met behulp van een cel schraper.</li>
		<li>Voor het stapelen van de cellen, spin down de oogsten in een conische tube van 15 mL bij 21.000 x g gedurende 2 min bij 18-25 ° C (RT).</li>
		<li>Na de PBS volledig teruggooi, Voeg 0,5 mL ijskoud zoogdieren eiwitreagens extractie (M-PER), samen met proteaseinhibitor (5 µL van 100 x proteaseinhibitor cocktail), aan de pellet als de cellen worden gekweekt in een schotel van 60 mm.</li>
		<li>Resuspendeer de cellen met verschillende rondes van pipetteren, en vervolgens uit te broeden de zwevende cellen gedurende 15 minuten staan bij 18-25 ° C (RT).</li>
		<li>Draai de cel lysate bij 21.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.</li>
		<li>Breng de waterige bovendrijvende substantie in een tube van verse 1,5 mL microcentrifuge.</li>
		<li>Analyseer het supernatant door immunoblotting, volgende standaardprotocollen met passende antilichamen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. productie van stabiele HEK293 cellijnen met Genomic integratie van het pEUI(+) Gene Switch
<ol><li>Transfect 5-10 µg van het gezuiverde pEUI(+) met de transgenic in HEK293 cellen die heuvels van de 50-60% in een 90 mm diameter cel cultuur schotel, met behulp van 15-30 µL van het transfectiereagens. Toevoegen van de transfectiereagens aan 500 µL verdunningsmiddel (DMEM zonder FBS en antibiotica) met het DNA. Na de incubatie van het reactiemengsel gedurende 30 minuten op RT, voeg toe het mengsel aan HEK-293 cellen op de schotel van cultuur.</li>
	<li>Na de transfectie, toestaan dat de transfectants om te groeien en het uiten van de puromycin-resistentie genproducten onder niet-selectieve voedingsbodem (zonder puromycin) gedurende 24-48 uur bij 37 ° C.</li>
	<li>De cellen van de cultuur-schotels distantiëren door trypsinebehandeling. Na het verwijderen van het kweekmedium, spoel de transfectants met voorverwarmde PBS (37 ° C), voeg 1 mL 0,25% trypsine/ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) en incubeer gedurende 1 minuut bij 37 ° C. Na het blussen van de trypsine/EDTA door voorverwarmde kweekmedium (10 mL, 37 ° C) toe te voegen, het oogsten van de cellen met behulp van een cel schraper, gevolgd door centrifugeren in een conische tube van 15 mL bij 21.000 x g gedurende 2 min bij 18-25 ° C.</li>
	<li>Resuspendeer de transfectants in 50 mL voorverwarmde kweekmedium (37 ° C), en de overdracht 10 mL van de cellen tot 90 mm verse cel cultuur gerechten. Cultuur van de cellen bij 37 ° C tot 50-60% confluentie vóór de behandeling van puromycin (in het algemeen, dit duurt ongeveer 24-48 h).</li>
	<li>Cultiveren van de transfectants bij 37 ° C in de cel kweekmedium aangevuld met 3 µg/mL puromycin voor 3-4 weken. Tijdens de periode van de selectie, de cel-kweekmedium dat puromycin (3 µg/mL) elke 2-3 dagen om te handhaven selectiedruk wijzigen Wanneer de cellen volledig confluente, opgesplitst volgens de procedures in stappen 3.3-3.4, met puromycin-bevattende kweekmedium. Gooi de resterende cellen in het kweekmedium, indien niet nodig. Opmerking: Puromycin selectie voorwaarden moeten experimenteel vastgesteld worden voor specifieke celtypes. Wij 3 µg/mL puromycin gebruikt in cel kweekmedium; Dit was genoeg voor het opwekken van celdood in niet-transfected HEK293.</li>
	<li>Oogsten van de cellen van afzonderlijke kolonies, met behulp van een cilinder van klonen, en volg de instructies van de fabrikant.<ol>
<li>Gooi het kweekmedium cel. Spoel de plaat twee keer met voorverwarmde (37 ° C) PBS te verwijderen van de zwevende cellen.</li>
		<li>Gebruik steriel pincet en laat de klonen cilinder over de afzonderlijke kolonies.</li>
		<li>0,2 mL van 0,35% trypsine/EDTA toevoegen aan elke cilinder.</li>
		<li>Incubeer de schotel bij 37 ° C gedurende 1 minuut totdat de cellen vrijstaand zijn en voeg vervolgens een paar druppels van het kweekmedium voorverwarmde (37 ° C) naar de cilinders.</li>
		<li>De cellen van elke cilinder overbrengen aan individuele putjes van de plaat van een 6-well, met 2 mL gestolde voedingsbodem en 1 µg/mL van puromycin in elk putje. Opmerking: Wanneer de cellen confluente worden, schaal omhoog de cultuur. Nu kunnen de clone(s) worden vastgesteld.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Handhaven van individuele klonen in cel kweekmedium aangevuld met 1 µg/mL puromycin.</li>
	<li>Afzonderlijke kolonies valideren door het testen van hun gevoeligheid voor Teb behandeling (eindconcentratie, 10 µM) voor 24 h. Test het reactievermogen van de klonen aan de Teb door het analyseren van het niveau van de expressie van de transgenic met immunoblotting. Selecteer een gewenste kloon (of klonen). Cultiveren een Teb-behandeld en een onbehandelde monster in een kweekvloeistof voor 12-48 h bij 37 ° C voor het analyseren van het niveau van de inductie van de transgenic. Het niveau van de expressie van transgenic kan worden gemeten door middel van immunoblotting, volgens de procedures in stappen 2.5.1 - 2.5.7.</li>
</ol>4. uitputting van Teb
<ol><li>Doven de Teb prikkels door vervanging van Teb met cel kweekmedium met Teb-gratis medium. Opmerking: Het wordt aanbevolen ter vervanging van de groei-media zonder eerste voort de cellen op een nieuwe cultuur schotel. Residuele Teb lijkt vast te klampen aan de kunststof schotel en een sterke achtergrond uitdrukking van de transgenic zal ontlokken. Voordat de cellen op een nieuwe plaat van de cultuur voort, spoel de geoogste cellen verschillende malen met kweekmedium of PBS.<ol>
<li>De cellen van de cultuur-schotels distantiëren door trypsinebehandeling. Na de Teb met kweekmedium teruggooi, spoel de cellen Teb-gestimuleerd tweemaal met voorverwarmde PBS (37 ° C), voeg 1 mL van 0,25% trypsine/EDTA en incubeer gedurende 1 minuut bij 37 ° C. Na het blussen van de trypsine/EDTA door voorverwarmde Teb-vrije kweekmedium (10 mL, 37 ° C) toe te voegen, het oogsten van de cellen met behulp van een cel schraper, gevolgd door centrifugeren in een conische tube van 15 mL bij 21.000 x g gedurende 2 min bij 18-25 ° C.</li>
		<li>Resuspendeer de cellen in 50 mL voorverwarmde Teb-vrije kweekmedium (37 ° C) en 5 mL van de cellen overdracht in drie 60 mm verse cel cultuur gerechten. De cellen bij 37 ° C gedurende 24, 48 en 72 h respectievelijk cultuur.</li>
		<li>De cellen op verschillende tijdstippen van de oogst en het meten van het niveau van de expressie van de transgenic met behulp van immunoblotting. Opmerking: In deze experimentele omstandigheden werd de transgenic expressie niet detecteerbaar ongeveer 3 dagen na cultuur van de cellen in het Teb-gratis culturele medium (Figuur 3). Het niveau van de expressie van transgenic kan worden gemeten door immunoblotting, volgens stappen 2.5.1 - 2.5.7.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Rossi, F. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+inducible+gene+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in inducible gene expression systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 9 (5), 451-456 (1998).</li>
<li>Clackson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+gene+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Regulated gene expression systems.</a> Gene Ther. 7 (2), 120-125 (2000).</li>
<li>Suzuki, Y., Suzuki, Y. Gene regulatable lentiviral system. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSuzuki%2C+Y+%22Viral+Gene+Therapy%22">Viral Gene Therapy</a>. Xu, K. , InTech. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.intechopen.com/books/viralgene-therapy/gene-regulatable-lentiviral-vector-system">http://www.intechopen.com/books/viralgene-therapy/gene-regulatable-lentiviral-vector-system</a> 285-309 (2011).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).</li>
<li>Baron, U., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet+repressor-based+system+for+regulated+gene+expression+in+eukaryotic+cells%3A+principles+and+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances.</a> Methods Enzymol. 327, 401-421 (2000).</li>
<li>Hentges, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP%2FmTOR+is+required+for+proliferation+and+patterning+during+embryonic+development+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FRAP/mTOR is required for proliferation and patterning during embryonic development in the mouse.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (24), 13796-13801 (2001).</li>
<li>Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+FKBP.rapamycin.FRB+ternary+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex.</a> J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).</li>
<li>Seto, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin+and+mTOR%3A+a+serendipitous+discovery+and+implications+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Rapamycin and mTOR: a serendipitous discovery and implications for breast cancer.</a> Clin Transl Med. 1 (1), 29(2012).</li>
<li>Ulmann, A., Peyron, R., Silvestre, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+uses+of+mifepristone+%28MFP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Clinical uses of mifepristone (MFP).</a> Ann N Y Acad Sci. 761, 248-260 (1995).</li>
<li>Sitruk-Ware, R., Spitz, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+properties+of+mifepristone%3A+toxicology+and+safety+in+animal+and+human+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Contraception%22%5BJournal%5D)">Pharmacological properties of mifepristone: toxicology and safety in animal and human studies.</a> Contraception. 68 (6), 409-420 (2003).</li>
<li>Yao, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+ecdysone+receptor+is+the+product+of+EcR+and+ultraspiracle+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional ecdysone receptor is the product of EcR and ultraspiracle genes.</a> Nature. 366 (6454), 476-479 (1993).</li>
<li>Riddiford, L. M., Cherbas, P., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecdysone+receptors+and+their+biological+actions%5BTitle%5D)+AND+%22Vitam+Horm%22%5BJournal%5D)">Ecdysone receptors and their biological actions.</a> Vitam Horm. 60 (2000), 1-73 (2000).</li>
<li>Saez, E., Nelson, M. C., Eshelman, B., Banayo, E., Koder, A., Cho, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ligands+and+coligands+for+the+ecdysone-regulated+gene+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Identification of ligands and coligands for the ecdysone-regulated gene switch.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97 (26), 14512-14517 (2000).</li>
<li>Karzenowski, D., Potter, D. W., Padidam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+control+of+transgene+expression+with+ecdysone+receptor%3A+gene+switches+with+high+sensitivity+robust+expression%2C+and+reduced+size%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Inducible control of transgene expression with ecdysone receptor: gene switches with high sensitivity robust expression, and reduced size.</a> Biotechniques. 39 (2), 191-200 (2005).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecdysone+receptor-based+singular+gene+switches+for+regulated+transgene+expression+in+cells+and+adult+rodent+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther.+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Ecdysone receptor-based singular gene switches for regulated transgene expression in cells and adult rodent tissues.</a> Mol. Ther. Nucleic Acids. 5 (9), e367(2016).</li>
<li>Esengil, H., Chang, V., Mich, J. K., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+regulation+of+zebrafish+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Small-molecule regulation of zebrafish gene expression.</a> Nat Chem Biol. 3 (3), 154-155 (2007).</li>
<li>Padidam, M., Gore, M., Lu, D. L., Smirnova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical-inducible%2C+ecdysone+receptor-based+gene+expression+system+for+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Chemical-inducible, ecdysone receptor-based gene expression system for plants.</a> Transgenic Res. 12 (1), 101-109 (2003).</li>
<li>Knopf, F., Schnabel, K., Haase, C., Pfeifer, K., Anastassiadis, K., Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dually+inducible+TetOn+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dually inducible TetOn systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li>
<li>Jeong, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+sequence-+and+ligation-independent+cloning+as+a+rapid+and+versatile+cloning+method+for+functional+genomics+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">One-step sequence- and ligation-independent cloning as a rapid and versatile cloning method for functional genomics studies.</a> Appl Environ Microbiol. 78 (15), 5440-5443 (2012).</li>
<li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-fusion+assembly%3A+seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins%2C+modular+vectors%2C+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li>
<li>No, D., Yao, T. P., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecdysone-inducible+gene+expression+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (8), 3346-3351 (1996).</li>
<li>Sawada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+insecticidal+activity+of+benzoheterocyclic+analogues+of+N%27-benzoyl-N-%28tert-butyl%29benzohydrazide%3A+Part+1.+Design+of+benzoheterocyclic+analogues%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag+Sci%22%5BJournal%5D)">Synthesis and insecticidal activity of benzoheterocyclic analogues of N'-benzoyl-N-(tert-butyl)benzohydrazide: Part 1. Design of benzoheterocyclic analogues.</a> Pest Manag Sci. 59 (1), 25-35 (2003).</li>
<li>Lafont, R., Girault, J. P., Kerb, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excretion+and+metabolism+of+injected+ecdysone+in+the+white+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Excretion and metabolism of injected ecdysone in the white mouse.</a> Biochem Pharmacol. 37 (6), 1174-1177 (1988).</li>
<li>Carlson, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+and+biological+properties+of+methoxyfenozide%2C+a+new+insecticidal+ecdysteroid+agonist%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag+Sci%22%5BJournal%5D)">The chemical and biological properties of methoxyfenozide, a new insecticidal ecdysteroid agonist.</a> Pest Manag Sci. 57 (2), 115-119 (2001).</li>
<li>McConnell, M. J., Imperiale, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+adenovirus+and+its+use+as+a+vector+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Biology of adenovirus and its use as a vector for gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 15 (11), 1022-1033 (2004).</li>
<li>Gorell, E., Nguyen, N., Lane, A., Siprashvili, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+skin+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for skin diseases.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (4), a015149(2014).</li>
<li>Kotterman, M. A., Chalberg, T. W., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+Vectors+for+Gene+Therapy%3A+Translational+and+Clinical+Outlook%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook.</a> Annu Rev Biomed Eng. 17, 63-89 (2015).</li>
<li>Matsumoto, T., Yamaguchi, M., Kuzume, M., Matsumiya, A., Kumada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+gene+transfer+with+adenovirus+vector+via+the+spleen+safely+and+effectively+improves+posthepatectomized+conditions+in+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Insulin gene transfer with adenovirus vector via the spleen safely and effectively improves posthepatectomized conditions in diabetic rats.</a> J Surg Res. 110 (1), 228-234 (2003).</li>
<li>Han, J., McLane, B., Kim, E. H., Yoon, J. W., Jun, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remission+of+diabetes+by+insulin+gene+therapy+using+a+hepatocyte-specific+and+glucose-responsive+synthetic+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter.</a> Mol Ther. 19 (3), 470-478 (2011).</li>
</ol>

We hebben geen conflicten van belang aan dit verslag gerelateerde.

Het grootste nadeel van een binaire gen expressie schakeloptie is de noodzaak om tegelijkertijd leveren twee aparte plasmiden (bestuurder en effector) in de doelcel. Dit kan leiden tot een ongelijke verdeling van plasmiden en leiden tot een inconsistente reactie van de overgang naar de inductoren1,2,3. Een andere tekortkoming van de twee-vector systeem is dat een minimum van twee rondes van antibiotica selectie moeten identifice...

Verschillende parameters van de verschillende gen werden onderzocht voor hun vermogen om te precies regelen van transgenic expressie in celkweek en diermodellen, met wisselend succes1,2,3. Potentiële gene schakelaar systemen moeten beantwoorden aan verschillende strenge criteria, met inbegrip van: precieze directionele uitdrukking van de transgenic, dosering - en tijdafhankelijke responsiviteit inductoren, te verwaarlozen leakiness voor de promotor, omkeerbaarheid van transgenic activering door de inductor verwijdering en inductor toxiciteit niveaus draaglijk cellijnen en laboratorium dieren1,2,3. Verschillende kleine molecuul inductoren hebben benut, met inbegrip van tetracycline4,5, rapamycin6,7,8, Mifepriston9,10, en ecdysone11,12,13,14. In het algemeen, deze systemen vereisen minstens twee plasmiden met twee of drie afzonderlijke expressie eenheden, één of twee van die componeren een regelgevende element (inductor plasmide) die een klein molecuul inductor bindt te winnen van transcriptionele activiteit; en een ander plasmide (effector plasmide) met de transgenic onder toezicht van een regelgevende DNA regio waarmee de toegang van het regelgevende element inductor-gebonden. Het grootste nadeel van het binaire systeem is dat het vereist dat de daarmee gepaard gaande invoering van twee vectoren (inductor en effector) in de doelcel. In voorbijgaande transgenic expressie experimenten produceert de gelijktijdige transfectie van twee plasmiden onvermijdelijk een bevolking van cellen die afzonderlijk transfected met de inductor of de effector of mede transfected ongelijk. Bovendien, vereist het binaire systeem ten minste twee rondes van antibiotica selectie om vast te stellen stabiele cellijnen, die tijdrovend en moeizaam. Zo combineren alle onderdelen vereist voor transgenic expressie en verordening in een enkele vector zou ideaal te garanderen van de daarmee gepaard gaande uitdrukking van alle vereiste elementen in één cel en voor de regulering van transgenic expressie door behandeling met klein molecuul inductoren.
Om te overwinnen van de tekortkomingen van binaire gene schakelaars, ontwikkelde we recent een enkelvoud gene schakelaar, met behulp van een Drosophila melanogaster EcR gebaseerde gene afleidbare systeem15. Ecdysone bemiddelt genexpressie wanneer het zich bindt aan de EcR/ultraspiracle (USP) heterodimer, die op zijn beurt binding van de kassa tot DNA regelgevende elementen3,11 induceert. De gewervelde retinoid X receptor (RXR), een ortholog van insect USP, werft EcR om te vormen van een actieve transcriptionele activator16. Dus, voor de gerichte uitdrukking van een transgenic in gewervelde cellen of weefsel, de EcR en RXR moet mede uitgedrukt gelijktijdig voordat wordt gestimuleerd door ecdysone of haar agonisten. Aangezien de functie van de heterodimeric van de schakelaar EcR gebaseerde gen kan worden beïnvloed door de endogene RXR niveau, Padidam et al.. vervangen van de EcR DNA-bindende en activering domeinen met heterologe GAL4 DNA-bindende, herpes simplex virus eiwit vmw65 (VP16) activering domeinen gesmolten bij het EcR ligand-bindend domein, die vervolgens werd gereageerd op de endogene RXR en vormde een homodimer verwerven van transcriptionele activiteit17. De schakeloptie gene EcR gebaseerde is verder verbeterd door de aanleg van een chimeer eiwit samengesteld van minimale VP16 activering domein gecombineerd met GvEcR, die een homodimer gevormd en gelokaliseerd in het cytosol in het ontbreken van de ecdysone-agonist, Teb16, 18. Door binding aan Teb, veranderde de GvEcR haar subcellular localisatie van het cytosol tot de kern te herkennen een promotor van de hybride bestaat uit zebrafish E1b minimale promotor gecombineerd met een tien tandem herhaalde upstream activering sequenties (UASs) op gang te brengen de transcriptie van de target gene16.
Ter vereenvoudiging van de eerder gemelde EcR gebaseerde gene schakelt16,18, we de binaire eigenschappen van het systeem gecombineerd in een enkele vector uitgerust met alle vereiste elementen voor stimulerende transgenic expressie, en vervolgens aangewezen de nieuw gegenereerde vector, pEUI(+) (GenBank toetreding nummer: KP123436, figuur 1A)15. De effector reageren op het GvEcR-stuurprogramma (hierna rijder) bestaat uit tien tandem UAS herhaalt naast een minimale promotor van E1b, gevolgd door een meerdere klonen site (MCS) met EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI en AflII erkenning sequenties (figuur 1B). Bovendien, om de selectie van transfected cellen, een SV40 promotor-gedreven puromycin N-acetyl-transferase (PAC) gen werd geplaatst tussen de bestuurder en effector regio's te handhaven van stabiele cellijnen (Figuur 1).
Beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het voorbijgaande en stabiele modulatie van transgenic expressie met behulp van pEUI(+). Daarnaast bieden we gedetailleerde instructies voor een succesvol gebruik van Teb als een agonist van het ecdysone.

<table><tbody><tr><td>pEUI(+)</td><td>TransLab</td><td></td><td>De octrooi licentie werd overgedragen aan TransLab Inc.&nbsp;</td></tr><tr><td>Gene-Fect Transfection Reagent</td><td>TransLab</td><td>TLC-001</td><td></td></tr><tr><td>HEK293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Tebufenozide</td><td>Fluka</td><td>31652</td><td></td></tr><tr><td>Cloning cylinder</td><td>Sigma</td><td>CLS31668</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Corning</td><td>58-58-2</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Welgene</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Welgene</td><td>LM001-05</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Welgene</td><td>S001-01</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dish</td><td>SPL life science</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>mouse FLAG M2</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>anti-alpha tubulin antibody</td><td>Calbiochem</td><td>CP06</td><td></td></tr><tr><td>Cloning cylinder</td><td>Sigma</td><td>CLS31668</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410.1</td><td></td></tr><tr><td>M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent</td><td>Thermo Fisher</td><td>78505</td><td></td></tr><tr><td>100X Protease inhibitor Cock. III</td><td>T&amp;I</td><td>BPI-9200</td><td></td></tr></tbody></table>

een ecdysone receptor gebaseerde enkelvoud gene schakelaar voor bewuste expressie van transgenic met te verwaarlozen leakiness, robuustheid en reversibiliteit

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Nauwkeurige controle van transgenic expressie is wenselijk in biologische en klinische studies. Aangezien de binaire functie van momenteel werkzaam gen-switches de overdracht van twee therapeutische expressie eenheden gelijktijdig tot een enkele cel vereist, is de praktische toepassing van het systeem voor gentherapie echter beperkt. Ter vereenvoudiging van het systeem van de expressie transgenic, we genereerden een genen schakelaar uitgeroepen tot pEUI(+) omvat een complete set van transgenic expressie modules in een enkele vector. Bestaande uit het domein van GAL4 DNA-bindende en gemodificeerde EcR (GvEcR), een minimale VP16 activering domein gefuseerd met een GAL4 DNA-bindende domein, alsmede een gemodificeerde Drosophila ecdysone receptor (EcR), de nieuw ontwikkelde enkelvoud gene schakelaar is zeer inspelen op de administratie van een chemische inductor in een tijd - en dosis-afhankelijke manier. De pEUI(+)-vector is een potentieel krachtig hulpmiddel voor het verbeteren van de controle van transgenic expressie in zowel biologisch onderzoek en pre-klinische studies. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor modulatie van een voorbijgaande en stabiele transgenic uitdrukking pEUI(+) vector via de behandeling van tebufenozide (Teb). Daarnaast delen we belangrijke richtlijnen voor het gebruik van Teb als een chemische inductor.

De schakeloptie GvEcR gebaseerde enkelvoud gen is afgebeeld in figuur 1A. De pEUI(+)-vector is geoptimaliseerd voor gereglementeerde transgenic expressie door de behandeling met Teb. De effector regio van pEUI(+) bestaat uit een 10xUAS en een E1b minimale promotor gevolgd door een MCS met EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI en AflII restrictie-enzym erkenning sites. Een SV40 poly(A) signaal is toegevoegd achter de MCS (figuur 1B). Een ...

Hier presenteren we een protocol voor de modulatie van transgenic expressie pEUI(+) enkelvoud gene schakeloptie door tebufenozide behandeling.

Een Ecdysone Receptor gebaseerde enkelvoud Gene schakelaar voor bewuste expressie van transgenic met te verwaarlozen Leakiness, robuustheid en reversibiliteit

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

Het algemene doel van dit experiment is om transgeen expressie te moduleren door de toediening van de chemische inducer tebufenozide. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van cel- en moleculaire biologie, zoals wanneer je de expressie van een gen van belang op een gewenst tijdstip met een gewenste sterkte wilt stimuleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat door alle benodigde elementen voor transgeen expressie in één vector te combineren, transgeen expressie kan worden gestimuleerd door de toediening van de chemische inducer tebufenozide.Na het subklonen van de EGFP of ANKRD13A transgenen volgens het tekstprotocol, bereid vier celkweekschalen voor met vers gepassageerde HEK 293 cellen in vijf milliliter DMEM aangevuld met vijf tot 10% FBS en antibiotica, die hierna als kweekmedium worden aangeduid. Houd de cellen op 37 graden Celsius. Wanneer de cellen 50 tot 60% dichtheid bereiken, voeg drie microliter transfectiereagens toe aan 200 microliter verdunningsvloeistof met het DNA.Na de reactie 30 minuten bij kamertemperatuur te hebben laten incuberen, voeg de mengsel toe aan de HEK 293 cellen. Gebruik twee schalen voor transfectie en laat de andere twee onbehandeld als controles. Incubeer de cellen 12 tot 24 uur bij 37 graden Celsius.Na de incubatie, voeg Teb toe aan een van de getransfecteerde monsters en aan een van de niet-getransfecteerde controles. Laat de andere twee monsters onbehandeld als experimentele controles. Incubeer de platen 12 tot 48 uur.Als je de EGFP-insert gebruikt, analyseer de EGFP-expressie onder een fluorescerende microscoop. Anders, om de cellen te oogsten voor immunoblotting, spoel de cellen twee keer met ijskoud PBS. Gebruik vervolgens een celschraper om ze van de plaat te verwijderen en breng ze over in een 15-milliliter kegelbuisje.Centrifugeer vervolgens de buisjes twee minuten bij 21.000 keer g en 18 tot 25 graden Celsius. Gooi na het weggegooien van het PBS 0,5 milliliter ijskoud zoogdier-eiwitextractie-reagens, of M-PER, en proteaseremmer toe aan het pellet. Resuspendeer de cellen met meerdere rondes pipetteren.Incubeer vervolgens de celsuspensie 15 minuten bij 18 tot 25 graden Celsius en kamertemperatuur. Centrifugeer het cellysaat 10 minuten bij 21.000 keer g en vier graden Celsius. Breng vervolgens het waterige supernatant over in een verse 1,5-milliliter microcentrifugebuis en analyseer het door immunoblotting met de juiste antilichamen.Om de Teb-stimuli te doven, verwijder het Teb-bevattende kweekmedium van de cellen en spoel de cellen twee keer met voorverwarmd PBS. Voeg vervolgens één milliliter 0,25% trypsin/EDTA toe en incubeer de cellen één minuut bij 37 graden Celsius. Voeg 10 milliliter voorverwarmd, Teb-vrij kweekmedium toe aan de cellen en gebruik een celschraper om ze te oogsten.Breng de cellen over in een 15-milliliter kegelbuisje. Centrifugeer vervolgens de cellen twee minuten bij 21.000 keer g en 18 tot 25 graden Celsius. Resuspendeer de cellen in 50 milliliter voorverwarmd, Teb-vrij kweekmedium en breng vijf milliliter van de cellen over in drie verse 60-millimeter celkweekschalen.Incubeer de cellen respectievelijk 24, 48 en 72 uur bij 37 graden Celsius. Ten slotte, oogst de cellen op verschillende tijdstippen en meet de expressieniveaus van het transgeen met behulp van immunoblotting. In dit experiment dat de activiteit en lekheid van pEUI-plus-EGFP evalueerde, vertoonden mock vector transfectanten geen fluorescent signaal, ongeacht de Teb-behandeling.Echter, pEUI-plus-EGFP transfectanten werden progressief gevoelig voor de toenemende hoeveelheid Teb. Wat nog belangrijker is, pEUI-plus-EGFP transfectanten die niet met Teb werden behandeld, vertoonden geen detecteerbare EGFP-signalen. FLAG-gelabelde ANKRD13A werd gebruikt om de responsiefheid van pEUI-plus tegen Teb verder te valideren.Zoals getoond in deze westerse blot met behulp van anti-FLAG antilichamen, vertoonden getransfecteerde HEK 293 cellen sterke ANKRD13A expressie na een 24-uurs behandeling met Teb. Bovendien toonde de afname van Teb de omkeerbaarheid van de pEUI-plus genswitch aan, aangezien ANKRD13A niet langer detecteerbaar was in cellen gekweekt zonder Teb. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in één uur worden uitgevoerd als deze goed wordt uitgevoerd.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat bijna het hele experiment onder kiemvrije omstandigheden moet worden uitgevoerd. Na dit protocol kunnen andere methoden, zoals het Tet-On of Tet-Off systeem, worden toegepast om twee verschillende transgenen differentieel tot expressie te brengen. Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg gebaand voor onderzoekers op het gebied van celbiologie om moleculaire fysiologie op cellulair niveau te onderzoeken.Na het bekijken van deze video, zou je een goed begrip moeten hebben van hoe je de pEUI-plus genswitch vector kunt gebruiken om transgeen expressie op een gewenst tijdstip met een gewenste sterkte te induceren. Vergeet niet dat het werken met tebufenozide gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van een laboratoriumjas, altijd moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

an-ecdysone-receptor-based-singular-gene-switch-for-deliberate

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Fenotypische variatie voor de kenmerken kan het gevolg zijn van mutaties in cis-regulerende element (CRE) sequenties die de controle genexpressie patronen. Methoden afgeleid voor gebruik in Drosophila melanogaster kan kwantitatief vergelijken met het niveau van de ruimtelijke en temporele patronen van genexpressie gemedieerd door gewijzigde of natuurlijk voorkomende CRE varianten.

Kwantitatieve vergelijking van Cis-Regulatory Element (CRE) Activiteiten in transgene Drosophila melanogaster</em

Source: Berens, C. et al. Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the use of an inducible expression system to identify where the bacterial effector protein CaeB disrupts the host apoptotic cascade. It outlines the steps for transfecting CaeB-expressing cells with a tetracycline-responsive system to induce pro-apoptotic gene expression in order to identify the point of...

Transfection of an Inducible Gene Expression System into Cells Expressing a Bacterial Effector Protein

This video demonstrates the tetracycline, or Tet-On, gene expression system in a mouse model. In the presence of doxycycline, a tetracycline derivative, the Tet-On system consisting of reverse tetracycline-controlled transactivator protein becomes activated and expresses the gene of interest.

Inducible Tet-On Regulatable System-Based Gene Expression In Vivo: A Tetracycline-Induced Gene Expression System for Target Gene Transcription Activation in Mouse Model

Dit protocol beschrijft een experimentele procedure voor de snelle bouw van kunstmatige transcriptiefactoren (ATF) met verwante GFP verslaggevers en kwantificering van de ATFs mogelijkheid om GFP-expressie te stimuleren via flowcytometrie.

Rapid Synthese en Screening van chemisch geactiveerde transcriptie Factoren met GFP gebaseerde Reporters

De hier beschreven methode wordt gebruikt om de apoptotische signaleringskaskade te induceren in gedefinieerde stappen om de activiteit van een anti-apoptotisch bacterieel effector-eiwit te onderzoeken. Deze methode kan ook worden gebruikt voor inductieve expressie van pro-apoptotische of toxische eiwitten, of voor het onderzoeken van interferentie met andere signaalwegen.

Het toepassen van een induceerbare Expression Systeem om interferentie van bacteriële virulentiefactoren met intracellulaire signalering Studie

Het bestuderen van ionkanalen via een heteroloog tot expressie brengen systeem is uitgegroeid tot een kern techniek in het biomedisch onderzoek. In dit manuscript presenteren we een tijd efficiënte methode om strak ionkanaal expressie te komen door het uitvoeren transiënte transfectie onder controle van een induceerbare promoter.

Controleerbaar Ion Channel Expression door middel Induceerbare tijdelijke transfectie

Hier presenteren we een methode voor het genereren van weefsel toepassingsspecifieke binaire transcriptie systemen in Drosophila door vervanging van de eerste codering exon van genen met transcriptie stuurprogramma's. De CRISPR/Cas9 gebaseerde methode plaatst een transactivator reeks onder de endogene regulering van een vervangen gen, en bijgevolg vergemakkelijkt transctivator expressie uitsluitend in gen-specifieke Spatio patronen.

Een efficiënte strategie voor het genereren van weefsel toepassingsspecifieke binaire transcriptie systemen in Drosophila door het bewerken van het genoom

Hier presenteren we een protocol voor de ontwikkeling van een dominant-negatieve afleidbare systeem, waarin elk eiwit kan voorwaardelijk worden geïnactiveerd door omkeerbaar overexpressing een dominant-negatieve mutant versie van het.

Afleidbare en omkeerbare Dominant-negatief (DN) eiwit remming

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn voor het genereren van een modelsysteem waarin de transcriptie van een endogene gen van belang voorwaardelijk kan worden gecontroleerd in de levende dieren of cellen met behulp van verbeterde lac -onderdrukker en/of tet activator systemen.

In vivo toepassing van het systeem van de afstandsbediening voor de manipulatie van de endogene genexpressie

Het betrouwbaar controleren van lichtgevoelige zoogdiercellen vereist de standaardisatie van optogenetische methoden. In de richting van dit doel schetst deze studie een pijplijn van gencircuitconstructie, celtechnologie, optogenetische apparatuur en verificatietests om de studie van door licht geïnduceerde genexpressie te standaardiseren met behulp van een negatief feedback optogenetisch gencircuit als casestudy.

Betrouwbare engineering en controle van stabiele optogenetische gencircuits in zoogdiercellen

Deze studie beschrijft een methode voor experimenten met hoge doorvoer met behulp van een 3D-geprinte LED-array om licht-induceerbare genexpressie in HEK293T cellen te optimaliseren.

Snelle optimalisatie van een licht-induceerbaar systeem om de genexpressie van zoogdieren te beheersen

Leer transgenexpressie moduleren met het pEUI(+) genenschakelaarsysteem in HEK 293-cellen via tebufenozide-inductie. Deze methode biedt precieze controle over timing en sterkte van genactivatie.

Een Ecdysone Receptor gebaseerde enkelvoud Gene schakelaar voor bewuste expressie van transgenic met te verwaarlozen Leakiness, robuustheid en reversibiliteit (Video) | JoVE Journal

Een Ecdysone Receptor gebaseerde enkelvoud Gene schakelaar voor bewuste expressie van transgenic met te verwaarlozen Leakiness, robuustheid en reversibiliteit

Meer video's verkennen