Een Ecdysone Receptor gebaseerde enkelvoud Gene schakelaar voor bewuste expressie van transgenic met te verwaarlozen Leakiness, robuustheid en reversibiliteit

Het algemene doel van dit experiment is om transgeen expressie te moduleren door de toediening van de chemische inducer tebufenozide. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van cel- en moleculaire biologie, zoals wanneer je de expressie van een gen van belang op een gewenst tijdstip met een gewenste sterkte wilt stimuleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat door alle benodigde elementen voor transgeen expressie in één vector te combineren, transgeen expressie kan worden gestimuleerd door de toediening van de chemische inducer tebufenozide.

Na het subklonen van de EGFP of ANKRD13A transgenen volgens het tekstprotocol, bereid vier celkweekschalen voor met vers gepassageerde HEK 293 cellen in vijf milliliter DMEM aangevuld met vijf tot 10% FBS en antibiotica, die hierna als kweekmedium worden aangeduid. Houd de cellen op 37 graden Celsius. Wanneer de cellen 50 tot 60% dichtheid bereiken, voeg drie microliter transfectiereagens toe aan 200 microliter verdunningsvloeistof met het DNA.

Na de reactie 30 minuten bij kamertemperatuur te hebben laten incuberen, voeg de mengsel toe aan de HEK 293 cellen. Gebruik twee schalen voor transfectie en laat de andere twee onbehandeld als controles. Incubeer de cellen 12 tot 24 uur bij 37 graden Celsius.

Na de incubatie, voeg Teb toe aan een van de getransfecteerde monsters en aan een van de niet-getransfecteerde controles. Laat de andere twee monsters onbehandeld als experimentele controles. Incubeer de platen 12 tot 48 uur.

Als je de EGFP-insert gebruikt, analyseer de EGFP-expressie onder een fluorescerende microscoop. Anders, om de cellen te oogsten voor immunoblotting, spoel de cellen twee keer met ijskoud PBS. Gebruik vervolgens een celschraper om ze van de plaat te verwijderen en breng ze over in een 15-milliliter kegelbuisje.

Centrifugeer vervolgens de buisjes twee minuten bij 21.000 keer g en 18 tot 25 graden Celsius. Gooi na het weggegooien van het PBS 0,5 milliliter ijskoud zoogdier-eiwitextractie-reagens, of M-PER, en proteaseremmer toe aan het pellet. Resuspendeer de cellen met meerdere rondes pipetteren.

Incubeer vervolgens de celsuspensie 15 minuten bij 18 tot 25 graden Celsius en kamertemperatuur. Centrifugeer het cellysaat 10 minuten bij 21.000 keer g en vier graden Celsius. Breng vervolgens het waterige supernatant over in een verse 1,5-milliliter microcentrifugebuis en analyseer het door immunoblotting met de juiste antilichamen.

Om de Teb-stimuli te doven, verwijder het Teb-bevattende kweekmedium van de cellen en spoel de cellen twee keer met voorverwarmd PBS. Voeg vervolgens één milliliter 0,25% trypsin/EDTA toe en incubeer de cellen één minuut bij 37 graden Celsius. Voeg 10 milliliter voorverwarmd, Teb-vrij kweekmedium toe aan de cellen en gebruik een celschraper om ze te oogsten.

Breng de cellen over in een 15-milliliter kegelbuisje. Centrifugeer vervolgens de cellen twee minuten bij 21.000 keer g en 18 tot 25 graden Celsius. Resuspendeer de cellen in 50 milliliter voorverwarmd, Teb-vrij kweekmedium en breng vijf milliliter van de cellen over in drie verse 60-millimeter celkweekschalen.

Incubeer de cellen respectievelijk 24, 48 en 72 uur bij 37 graden Celsius. Ten slotte, oogst de cellen op verschillende tijdstippen en meet de expressieniveaus van het transgeen met behulp van immunoblotting. In dit experiment dat de activiteit en lekheid van pEUI-plus-EGFP evalueerde, vertoonden mock vector transfectanten geen fluorescent signaal, ongeacht de Teb-behandeling.

Echter, pEUI-plus-EGFP transfectanten werden progressief gevoelig voor de toenemende hoeveelheid Teb. Wat nog belangrijker is, pEUI-plus-EGFP transfectanten die niet met Teb werden behandeld, vertoonden geen detecteerbare EGFP-signalen. FLAG-gelabelde ANKRD13A werd gebruikt om de responsiefheid van pEUI-plus tegen Teb verder te valideren.

Zoals getoond in deze westerse blot met behulp van anti-FLAG antilichamen, vertoonden getransfecteerde HEK 293 cellen sterke ANKRD13A expressie na een 24-uurs behandeling met Teb. Bovendien toonde de afname van Teb de omkeerbaarheid van de pEUI-plus genswitch aan, aangezien ANKRD13A niet langer detecteerbaar was in cellen gekweekt zonder Teb. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in één uur worden uitgevoerd als deze goed wordt uitgevoerd.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat bijna het hele experiment onder kiemvrije omstandigheden moet worden uitgevoerd. Na dit protocol kunnen andere methoden, zoals het Tet-On of Tet-Off systeem, worden toegepast om twee verschillende transgenen differentieel tot expressie te brengen. Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg gebaand voor onderzoekers op het gebied van celbiologie om moleculaire fysiologie op cellulair niveau te onderzoeken.

Na het bekijken van deze video, zou je een goed begrip moeten hebben van hoe je de pEUI-plus genswitch vector kunt gebruiken om transgeen expressie op een gewenst tijdstip met een gewenste sterkte te induceren. Vergeet niet dat het werken met tebufenozide gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van een laboratoriumjas, altijd moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.