Name: Microinjection van Western maïswortelboorder, Diabrotica virgifera virgifera, embryos voor Germline transformatie of CRISPR/Cas9 genoom bewerking (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Leer micro-injectie van Western Corn Rootworm embryo's voor CRISPR/Cas9-genoombewerking en kiembaantransformatie. Deze methode ondersteunt functioneel-genomisch onderzoek naar resistentiemechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door een subsidie van de Monsanto mais Rootworm kennis Research Program, nummer AG/1005 (aan MDL en YC) en start-up middelen verlenen aan MDL van NCSU. FC werd gesteund door subsidies van Monsanto's maïs Rootworm kennis Research Program (AG/1005) en de National Science Foundation, toekennen nummer MCB-1244772 (MDL). De auteurs verklaren geen concurrerende belangen. FC en MDL bedacht en ontworpen van de experimenten; FC, PW en SP uitgevoerd de experimenten; FC en MDL geanalyseerd de resultaten; en FC, NG en MDL schreef het manuscript. Wij danken Teresa O'Leary en William Klobasa Stephanie Gorski voor hun deskundige hulp bij bevolkingsonderzoek WCR. Wij danken ook Dr. Wade French (USDA-ARS, North Central Agricultural Research Laboratory, Brookings, SD) voor de overbrenging van eieren lab kolonies en verstrekken van fokken protocollen vast te stellen.

1. kolonie-niveau fokken van WCR volwassenen
<ol><li>Verkrijgen van een voldoende hoeveelheid WCR volwassenen (500-1000) van een betrouwbare bedrijf of research laboratory (Zie Tabel van materialen voor een voorbeeld) en in een kooi van 30 cm3 plaatsen. Opmerking: Gebruik van een niet-diapausing-stam wordt sterk aanbevolen.</li>
	<li>Bereiden van kunstmatige voeding WCR volgens protocol van de fabrikant en giet een 1 cm dikke laag in een 38 oz-container (Zie Tabel van materialen). Na het mengen, opslaan van ongebruikte dieet bij 4 ° C voor maximaal 2 maanden.</li>
	<li>Zet een petrischaal (100 x 15 mm) met volwassen dieet (10-15 g) in een 30 cm3 kooi. Voeg meer dieet als het eten lage of droog is.</li>
	<li>Zet een kolf (300 mL) met water, bedekt met een katoenen bal, die wordt gebruikt om het op zijn plaats houden een katoen-roll (6 "x 3/8"), om te dienen als een waterbron. Het water veranderen wanneer het draait laag.</li>
	<li>WCR bij 26 ° C met 60% vochtigheid te handhaven en een 14:10-lichte fietsen in een insect fokken incubator.</li>
</ol>2. de embryo's worden verzameld en uitlijning
<ol><li>Maak een ei inzamelingskamer 1% agar in water met een steriel 100 x 15 mm2 petrischaal. Bewaren bij 4 ° C na de agar stolt.</li>
	<li>Nieuw vastgestelde eieren te verzamelen, plaats een enkellaags filtreerpapier, gevolgd door 4 lagen van kaasdoek (elke cut formaat) op het oppervlak van de agar (figuur 1A). Opmerking: Kaasdoek kan worden hergebruikt, nadat hij gewassen in bleekmiddel en gesteriliseerde met autoclaaf, maar het is niet nodig om dit te doen voor het eerste gebruik. Filtreerpapier mogen niet worden hergebruikt en hoeft niet te worden gesteriliseerd.</li>
	<li>Plaats van ei collectie plaat in WCR kooi zo laat in de dag mogelijk (einde van de werkdag) en bedek met een zilverpapier tent. Laat 's nachts. Opmerking: Met de lichten op van 10.00 tot 12 uur (14u) vertragingen ei leggen, waardoor de collectie van jongere eieren voor microinjection zonder lab personeel inzamelingskamer in kooi 's avonds laat plaatsen.</li>
	<li>Verwijder de inzamelingskamer ei rond de 8 of 9 uur</li>
	<li>Gebruik pincet te halen 1 laag kaasdoek op een tijd en plaats in een bekerglas (500 mL) water. Het wassen van eieren af kaasdoek door zachtjes roeren (figuur 1B en 1 C).</li>
	<li>Gebruik een pipet lamp eieren overbrengen naar een andere bekerglas (500 mL) water. Herhaal 2-3 x om de eieren schoon te maken.</li>
	<li>Gebruik de pipet lamp overdracht van eieren op filterpapier (Figuur 1 d) terwijl het minimaliseren van de hoeveelheid water "Carry-over".</li>
	<li>Zwarte filtreerpapier snijd in reepjes zo breed als een glasplaatje en de tape stevig aan de dia om te controleren of legt het papier plat (figuur 2A). Opmerking: Zwarte filtreerpapier verbetert zichtbaarheid onder de Microscoop door het verminderen van de hoeveelheid gereflecteerd licht.</li>
	<li>Niet-toxisch lijmen (Zie Tabel van materialen voor een voorbeeld) om het koffiefilter in fijne lijntjes (figuur 2B). Houd de lijm lijnen dunner beeldscherm mogelijk dan de diameter van een ei te voorkomen dat je de eieren bedekt met lijm.</li>
	<li>Gebruik een fijne borstel zachtjes overstappen WCR eieren één voor één hun filtreerpapier op de lijn van de lijm. Probeer de om eieren te leggen op de lijm voordat het droogt uit en houden van ten minste één ei de afstand tussen elk ei.</li>
	<li>Injectie efficiëntie maximaliseren door het plaatsen van meerdere tekstregels eieren op een filtreerpapier dia (Figuur 3).</li>
	<li>Nadat alle eieren zijn neergelegd op het filtreerpapier, wacht u totdat alle de lijm voordat microinjection droogt. Opmerking: Voor germline transformatie en voor CRISPR/Cas9-gemedieerde genoom bewerken, injecteren alle embryo's tegen de middag (12 uur) zodat de oudste embryo niet meer dan 19 uur oud is. Voor RNAi is er echter geen tijdslimiet omdat, in WCR, dsRNA kan verplaatsen tussen cellen. In feite, voor RNAi, zou kunnen veroudering embryo's resulteren in betere overlevingskans van de patiënt.</li>
</ol>3. voorbereiding van de ANI van de plasmide en injectie naalden
<ol><li>Bereiden van kwalitatief hoogwaardige supercoiled plasmide DNA met behulp van een endotoxine-vrije commerciële kit (Zie Tabel van materialen voor een voorbeeld).</li>
	<li>Ter voorbereiding van de oplossing voor injectie, de concentratie van elke plasmide controleren en deze vervolgens combineren helper plasmide (eindconcentratie is 250 ng/µL), donor plasmide (eindconcentratie is 750 ng/µL) en fenol red buffer (20% eindconcentratie). Vortex de oplossing kort en Centrifugeer gedurende 3 minuten op maximale snelheid te precipiteren deeltjes die de naald verstoppen kunnen.</li>
	<li>Trekken van borosilicaatglas naalden (od 1 mm, I.D. 0.58 mm, lengte 10 cm) met een trekker van de micropipet van het type van Flaming/bruin. Voor opslag, veilige getrokken naalden op dubbelzijdige plakband in een petrischaal of andere duidelijke container. Opmerking: Voor de micropipet trekker systeem, de instellingen die worden gebruikt zijn: warmte = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100.</li>
	<li>Aanvulling funderingsput de naald van de injectie met behulp van een micro-loader tip (Zie Tabel van materialen) Pipetteer 0,5 - 1,0 µL neer binnen de naald, in de buurt van het tapse einde. Bubbels uit het topje van de naald verwijderen als een optreedt.</li>
	<li>Plaats de injectie naald in de kaarthouder van de naald.</li>
	<li>Open het puntje van de naald door zachtjes breken met een fijn paar pincet, of zachtjes raken/te slepen de tip op de dia dekglaasje aan of glas. Opmerking: Het doel is om de kleinste opening waarmee nog de mix van de injectie te komen (kleinere openingen in het algemeen vereisen hogere druk van de injectie). Schuine naalden nodig niet deze stap omdat ze al open.</li>
</ol>4. microinjection en na injectie zorg
<ol><li>Met behulp van een fijn penseel, zorgvuldig nat van het oppervlak van 1-3 eieren met steriel water, invoegen de naald en het injecteren van de oplossing. Injecteren elk ei voordat het oppervlak droogt. Kijk voor de verschijning een kleine hoeveelheid rood in eieren tijdens injectie om aan te geven van de succesvolle microinjection. Crush of verwijderen van alle eieren die kijken beschadigd, leeg, of anders niet kunnen worden geïnjecteerd. Opmerking: Hoewel injectie druk op basis van boring breinaalden varieert, 10-13 psi is een goed uitgangspunt.</li>
	<li>Nadat alle eieren worden geïnjecteerd, verwijder het koffiefilter uit het glasplaatje.</li>
	<li>Breng het filter op het oppervlak van een 1% agar schotel (zie hierboven).</li>
	<li>Gebruik plastic paraffine film te verzegelen van de schotel, en in een insect van de 26 ° C incubator fokken voor 12 dagen. Opmerking: De paraffine film voorkomt kruisbesmetting van schimmel tussen gerechten. Iedere andere behandeling om te voorkomen dat schimmel en bacteriële groei kan echter het voortbestaan van de geïnjecteerde embryo's verminderen.</li>
</ol>5. het kweken en broedeieren van embryo 's
<ol><li>Starten van de controle van embryo's twaalf dagen na injectie voor de pas uitgekomen larven en blijven dagelijks voor de komende 2 weken.</li>
	<li>Overdracht van larven, met een fijne borstel, met een steigerend doos met gekiemde maïs en de bodem. Opmerking: Schimmel kan groeien in de agar schotel, maar larven nog steeds in de meeste gevallen zal uitkomen. Kijk voor larven zorgvuldig binnen de mal om ze alle te vangen. Sommige larven kunnen bewegen om het deksel van de schotel en zou komen te zitten in de condensatie.</li>
	<li>Larven bij 26 ° C na standaard WCR fokken methoden25aan de achterkant.</li>
</ol>

<ol><li>Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+and+Invasiveness+of+Western+Corn+Rootworm%3A+Intensifying+Research+on+a+Worsening+Pest%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest.</a> Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).</li>
<li>Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-evolved+resistance+to+Bt+maize+by+western+corn+rootworm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Field-evolved resistance to Bt maize by western corn rootworm.</a> PLoS One. 6 (7), e22629(2011).</li>
<li>Gray, M. E., Levine, E., Oloumi-Sadeghi, H. <a target="_blank" href="https://www.cabdirect.org/cabdirect/abstract/19991107592">Adaptation to crop rotation: western and northern corn rootworms respond uniquely to a cultural practice.</a> Recent research developments in entomology. 2, 19-31 (1998).</li>
<li>Meinke, L. J., Siegfried, B. D., Wright, R. J., Chandler, L. D. <a target="_blank" href="https://digitalcommons.unl.edu/entomologyfacpub/87/">Adult Susceptibility of Nebraska Western Corn Rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) Populations to Selected Insecticides.</a> Journal of Economic Entomology. 91 (3), 594-600 (1998).</li>
<li>Roselle, R., Anderson, L., Simpson, R., Webb, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoselle%2C+R+%22Annual+report+for+1959%2C+cooperative+extension+work+in+entomology%22">Annual report for 1959, cooperative extension work in entomology</a>. , University of Nebraska Extension. Lincoln, NE. (1959).</li>
<li>Wright, R., Meinke, L., Siegfried, B. Corn rootworm management and insecticide resistance management. Proceedings. , 45-53 (1996).</li>
<li>Baum, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+coleopteran+insect+pests+through+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Control of coleopteran insect pests through RNA interference.</a> Nat Biotechnol. 25 (11), 1322-1326 (2007).</li>
<li>Velez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+for+Successful+Parental+RNAi+as+An+Insect+Pest+Management+Tool+in+Western+Corn+Rootworm%2C+Diabrotica+virgifera+virgifera%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Parameters for Successful Parental RNAi as An Insect Pest Management Tool in Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> Genes (Basel). 8 (1), (2016).</li>
<li>Alves, A. P., Lorenzen, M. D., Beeman, R. W., Foster, J. E., Siegfried, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+as+a+method+for+target-site+screening+in+the+Western+corn+rootworm%2C+Diabrotica+virgifera+virgifera%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">RNA interference as a method for target-site screening in the Western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> J Insect Sci. 10, 162(2010).</li>
<li>Rangasamy, M., Siegfried, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+RNA+interference+in+western+corn+rootworm+Diabrotica+virgifera+virgifera+LeConte+%28Coleoptera%3A+Chrysomelidae%29+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Validation of RNA interference in western corn rootworm Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae) adults.</a> Pest Management Science. 68 (4), 587-591 (2012).</li>
<li>Khajuria, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parental+RNA+interference+of+genes+involved+in+embryonic+development+of+the+western+corn+rootworm%2C+Diabrotica+virgifera+virgifera+LeConte%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Parental RNA interference of genes involved in embryonic development of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte.</a> Insect Biochem Mol Biol. 63, 54-62 (2015).</li>
<li>Cooley, L., Kelley, R., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+mutagenesis+of+the+Drosophila+genome+with+single+P+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Insertional mutagenesis of the Drosophila genome with single P elements.</a> Science. 239 (4844), 1121-1128 (1988).</li>
<li>Robertson, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+genomic+source+of+P+element+transposase+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 118 (3), 461-470 (1988).</li>
<li>Spradling, A. C., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+Cloned+P+Elements+into+Drosophila+Germ+Line+Chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transposition of Cloned P Elements into Drosophila Germ Line Chromosomes.</a> Science. 218 (4570), 341-347 (1982).</li>
<li>O'Kane, C. J., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+in+situ+of+genomic+regulatory+elements+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Detection in situ of genomic regulatory elements in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (24), 9123-9127 (1987).</li>
<li>Lukacsovich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-tagging+gene+trap+of+novel+genes+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Dual-tagging gene trap of novel genes in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 157 (2), 727-742 (2001).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Gene+Expression+as+a+Means+of+Altering+Cell+Fates+and+Generating+Dominant+Phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted Gene Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Horn, C., Offen, N., Nystedt, S., Hacker, U., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac-based+insertional+mutagenesis+and+enhancer+detection+as+a+tool+for+functional+insect+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">piggyBac-based insertional mutagenesis and enhancer detection as a tool for functional insect genomics.</a> Genetics. 163 (2), 647-661 (2003).</li>
<li>Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+targeted+mutagenesis+of+Drosophila+with+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).</li>
<li>Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+cipher+governs+DNA+recognition+by+TAL+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors.</a> Science. 326 (5959), 1501(2009).</li>
<li>Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+chromosomal+cleavage+and+mutagenesis+in+Drosophila+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).</li>
<li>Jeggo, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+breakage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA breakage and repair.</a> Adv Genet. 38, 185-218 (1998).</li>
<li>Gantz, V. M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+The+mutagenic+chain+reaction%3A+a+method+for+converting+heterozygous+to+homozygous+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations.</a> Science. 348 (6233), 442-444 (2015).</li>
<li>Windbichler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+homing+endonuclease-based+gene+drive+system+in+the+human+malaria+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito.</a> Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).</li>
<li>Branson, T. F., Jackson, J. J., Sutter, G. R. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jee/article-abstract/81/1/410/935020">Improved Method for Rearing Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera, Chrysomelidae).</a> Journal of Economic Entomology. 81 (1), 410-414 (1988).</li>
<li>Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+superfamily+genes+in+Tribolium+castaneum+and+the+use+of+a+Tubulin+promoter+to+drive+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression.</a> Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 749-755 (2008).</li>
<li>Chu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+western+corn+rootworm%2C+Diabrotica+virgifera+virgifera%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> Insect Mol Biol. , (2017).</li>
<li>Ingolia, T. D., Craig, E. A., McCarthy, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+three+copies+of+the+gene+for+the+major+Drosophila+heat+shock+induced+protein+and+their+flanking+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sequence of three copies of the gene for the major Drosophila heat shock induced protein and their flanking regions.</a> Cell. 21 (3), 669-679 (1980).</li>
<li>Berghammer, A. J., Klingler, M., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+marker+for+transgenic+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A universal marker for transgenic insects.</a> Nature. 402 (6760), 370-371 (1999).</li>
<li>Branson, T. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1570-7458.1976.tb02591.x/abstract">The selection of a non-diapause strain of Diabrotica virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae).</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 19 (2), 148-154 (1976).</li>
<li>Handel, K., Grunfelder, C. G., Roth, S., Sander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tribolium+embryogenesis%3A+a+SEM+study+of+cell+shapes+and+movements+from+blastoderm+to+serosal+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Tribolium embryogenesis: a SEM study of cell shapes and movements from blastoderm to serosal closure.</a> Dev Genes Evol. 210 (4), 167-179 (2000).</li>
<li>Handler, A. M., James, A. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHandler%2C+AM+%22Insect+transgenesis%3A+methods+and+applications%22">Insect transgenesis: methods and applications</a>. , CRC Press. (2000).</li>
<li>Lorenzen, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac-based+insertional+mutagenesis+in+Tribolium+castaneum+using+donor%2Fhelper+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">piggyBac-based insertional mutagenesis in Tribolium castaneum using donor/helper hybrids.</a> Insect Mol Biol. 16 (3), 265-275 (2007).</li>
<li>Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+CRISPR-mediated+gene+targeting+and+transgene+replacement+in+the+beetle+Tribolium+castaneum%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum.</a> Development. 142 (16), 2832-2839 (2015).</li>
<li>Phuc, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late-acting+dominant+lethal+genetic+systems+and+mosquito+control%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control.</a> BMC Biol. 5, 11(2007).</li>
<li>Horn, C., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgene-based%2C+embryo-specific+lethality+system+for+insect+pest+management%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A transgene-based, embryo-specific lethality system for insect pest management.</a> Nat Biotechnol. 21 (1), 64-70 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hoewel microinjection van WCR met dsRNAs met het oog op RNAi gerapporteerde9, dit is het eerste protocol bij het vaststellen van beste praktijken voor het microinjecting van de precellular WCR embryo's, een kritische proces voor het uitvoeren van germline transformatie en/of CRISPR/Cas9 genoom bewerken in deze soort. Succesvolle microinjection van WCR embryo's is afhankelijk van vele factoren, zoals transformatie efficiëntie. Hieronder besproken zijn enkele van de belangrijke kwesties invloed op h...

Westerse maïswortelboorder (WCR), Diabrotica virgifera virgifera, is een belangrijke plaag van maïs1. Interessant, WCR lijkt te overwinnen van de controle maatregelen sneller dan meest agrarische plagen omdat ze niet alleen fysiologisch maar ook gedragsgestoorde2,3,4,5, passen 6. het afgelopen decennium, RNA-interferentie (RNAi), een krachtige functioneel genomisch tool, heeft onderzocht als een potentiële beheermethode voor WCR7,8, en is ook gebruikt als een middel om te studeren gene functie9. Terwijl RNAi wordt vaak uitgevoerd door microinjection van double-stranded RNA (dsRNA) bij andere diersoorten, is injectie gebaseerde RNAi echter zeldzaam in WCR. In feite zijn er slechts enkele rapporten van RNAi via microinjection van dsRNA in WCR9. De reden is dat WCR hoge niveaus van gene vechtpartij via ingestie van dsRNA7,10 bereiken kan, zelfs het toelaat van de studie van embryonale effecten door dsRNA vervoederen aan de moeder11. Terwijl deze methode WCR een uitstekend onderwerp voor functionele genoom analyse via RNAi maakt, is het vooruitgang op de ontwikkeling van methodologieën voor embryonale microinjection in deze soort vertraagd.
Ondanks de kracht van RNAi zijn er een paar nadelen. Niet alle genen reageren bijvoorbeeld even op RNAi. Deze variabiliteit kunnen interpreteren van de resultaten van een functionele genomica assay moeilijker. Ook RNAi voorbijgaande aard is en genereert geen erfelijke mutaties. Aan de andere kant, kan germline transformatie, een ander functioneel genomisch hulpmiddel, erfelijke mutaties via het invoegen van een gemarkeerde transposons element in het genoom12,13genereren. Dit maakt germline transformatie een uitstekend hulpmiddel voor het maken van gemuteerde stammen voor gebruik in genetische langetermijnstudies. Transformatie kan ook worden gebruikt om te redden van een mutatie door het leveren van een functionele kopie van het gen tot een mutant genoom14. Bovendien is germline transformatie de hoeksteen van een grote verscheidenheid van moleculaire genetische technieken. Naast uitsparen en/of redden van de genfunctie, kan germline transformatie worden gebruikt voor enhancer overlapping15, gene overlapping16, ectopische expressie Gal4 gebaseerde17en genoom-brede mutagenese18.
Meer recentelijk, gereedschappen waarmee geavanceerde genoom bewerken zijn ontwikkeld. Deze tools omvatten transcriptie Activator-Like Effector nucleasen (TALEN) en de CRISPR/Cas9-nuclease systeem19,20. Het voordeel van deze nieuwe instrumenten is dat ze onderzoekers de mogelijkheid bieden voor het opwekken van een double-stranded DNA pauze op bijna elke plek binnen bijna elke genoom. Zodra geïnduceerde, deze onderbrekingen kunnen worden gerepareerd via niet-homologe weerszijden toe te treden, die kan introduceren verwijderingen of inserties in het beoogde gen, of via homologie geleide reparatie, die in het bijzijn van een gemodificeerde constructie, kan katalyseren de vervanging van de gehele genen of de genetische gebieden21,22. Echter, deze methoden vereisen microinjection van DNA, RNA en/of eiwit in zeer jonge embryo's.
Nog belangrijker is, in tegenstelling tot de dsRNAs gebruikt voor RNAi, nucleïnezuren en proteïnen gebruikt voor germline kruisen transformatie en genoom bewerken niet gemakkelijk celmembranen. Daarom, microinjection van de ANI van de plasmide, mRNAs, en/of eiwitten moet plaatsvinden tijdens de syncytieel blastoderm fase (dat wil zeggen voordat het insect embryo cellularizes). Dit maakt de timing van injecties een kritieke factor. Bijvoorbeeld bij Drosophila melanogastermoeten embryo's binnen twee uur na ei12 leggenworden geïnjecteerd. Daarom moet de ontwikkeling van een succesvolle embryonale microinjection protocol voor WCR rekening houden met de beste voorwaarden voor vrouwelijke leggen van eieren, evenals de beste methode voor het verzamelen van voldoende hoeveelheden van precellular embryo's.
Een poging om een breed scala aan moleculaire genetische hulpmiddelen te oefenen op WCR biologie vereist de ontwikkeling van methoden voor het verzamelen en microinjecting van de precellular WCR embryo's. Hier voorzien wij gedetailleerde instructies, samen met tips en trucs, om anderen transformatie gebaseerde technieken gebruiken in WCR onderzoek te helpen. Naast uitbreiding van transgene technologieën tot WCR voor gebruik in functionele genomic studies, deze technieken ook in staat stellen krachtige nieuwe pest controlestrategieën zoals gen station23,24 te worden getest in dit economisch belangrijke Pest.

<table><tbody><tr><td>Qualitative Filter Paper (Black)</td><td>Ahlstrom</td><td>8613-0900</td><td>Voor ei-micro-injectie</td></tr><tr><td>1 oz Containers&nbsp;</td><td>Anny's Plastic Tableware</td><td>ASET101</td><td>Eicontainer</td></tr><tr><td>Drosophila Agar Type II</td><td>Apex</td><td>66-103</td><td>Substraat voor WCR eierlegschaal</td></tr><tr><td>Featherweight Forceps&nbsp;</td><td>Bioquip</td><td>4748</td><td>Handelen van larven en poppen&nbsp;</td></tr><tr><td>Clorox Regular-Bleach1</td><td>Clorox</td><td>44600-30770</td><td>Maïs en gerechten wassen</td></tr><tr><td>Trucker's Favorite Yellow</td><td>Coor Farm Supply</td><td>502</td><td>Maïs voor het voeren van WCR</td></tr><tr><td>Microinjection System (Homemade)</td><td>NA</td><td>Onderdelen &amp; instructies op aanvraag beschikbaar</td><td>Controleert injectiedruk (0-20 psi)</td></tr><tr><td>Elmer's Non-toxic Glue</td><td>Elmer's Products, Inc.</td><td>E304</td><td>Lijm eieren op filterpapier</td></tr><tr><td>epTIPS Microloader Tips</td><td>Eppendorf</td><td>C2554691</td><td>Aanvullen van naaldbelasting tips</td></tr><tr><td>Falcon Tissue Culture Dishes</td><td>Falcon</td><td>25383-103</td><td>Spruiten maïs /150 x 25 mm</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp;Quantitative-Grade Filter Paper Circles</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47576C</td><td>Agarschaal maken voor eierleg/9cm</td></tr><tr><td>Sparkleen</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-320-4</td><td>Vaatwerk wassen</td></tr><tr><td>Plain Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-549-3</td><td>Houd filterpapier en eieren voor micro-injectie</td></tr><tr><td>Western Corn Rootworm w/o Pollen Substitute</td><td>Frontier Agricultural Sciences&nbsp;</td><td>F9766B</td><td>Kunstmatige voeding voor volwassen WCR</td></tr><tr><td>Cotton Balls, Large</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-101</td><td>Fles sluiten</td></tr><tr><td>Globe Scientific 3.0 mL Small Bulb Transfer Pipettes</td><td>Globe Scientific</td><td>137035</td><td>Verzamel en breng eieren over</td></tr><tr><td>Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope&nbsp;</td><td>Leica</td><td>M165 FC&nbsp;</td><td>WCR screening</td></tr><tr><td>DsRed Filter Set for Fluorescence Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>DSR</td><td>Excitatiever: 510-560 nm, emissiever: 590-650 nm</td></tr><tr><td>EGFP filter</td><td>Leica</td><td>GFP2</td><td>Excitatiever: 440&ndash;520 nm, emissiever: 510 nm</td></tr><tr><td>BugDorm</td><td>MegaView Science</td><td>DP1000_5P</td><td>Kooi voor volwassen kolonie</td></tr><tr><td>Miniature Paint Brush</td><td>MyArtscape</td><td>MAS-102-MINI</td><td>Liner 2/0&nbsp;</td></tr><tr><td>Joystick Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td>Micromanipulator en naaldhouder</td></tr><tr><td>Microscope XY Stage</td><td>Olympus</td><td>265515</td><td>Microscoopstandaard (aanpassing voor gebruik met stereoscoop)</td></tr><tr><td>Grade 90 Cheesecloth</td><td>Online Fabric Store</td><td>CHEE90</td><td>Voor eierleg</td></tr><tr><td>Plastic paraffin film&nbsp;</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td>PM-996</td><td>Agardisch afsluiten na micro-injectie/Rolgrootte 4 in. x 125 ft</td></tr><tr><td>Percival Incubator</td><td>Percival&nbsp;</td><td>I41VLH3C8</td><td>WCR groeiende kamer (incubator voor insectenkweek)</td></tr><tr><td>Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks</td><td>VWR</td><td>4980-300-PK</td><td>Watercontainer voor volwassen kolonie&nbsp;</td></tr><tr><td>Griffin Low Form Beakers</td><td>VWR</td><td>1000-600-PK</td><td>Voor eiwas</td></tr><tr><td>Braided Cotton Rolls</td><td>Richmond Dental Cotton Co.</td><td>605-3599</td><td>Gebruik in watervoorziening voor volwassen kolonie&nbsp;</td></tr><tr><td>Petri Dishes (35x10mm)</td><td>SIGMA</td><td>CLS430588-500EA</td><td>Voor dieetplaten</td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Sigma</td><td>143-78-8</td><td>Micro-injectiebuffer</td></tr><tr><td>Laser-based Micropipiette Puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-2000/G</td><td>Naaldtrekker/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100</td></tr><tr><td>Premium Topsoil</td><td>The Scotts Company</td><td>71130758</td><td>Grond voor cron groei</td></tr><tr><td>Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags</td><td>United States Plastic Corporation</td><td>48342</td><td>Agardisch in zak na micro-injectie/5x7</td></tr><tr><td>Petri Dishes (100x15m)</td><td>VWR</td><td>89038-968</td><td>Agardisch maken voor eierleg/ 100 x 15 mm</td></tr><tr><td>6 oz Containers</td><td>Webstaurantstore</td><td>128E506</td><td>WCR enkele paar paringskamer&nbsp;</td></tr><tr><td>38 oz Containers</td><td>Webstaurantstore</td><td>128NC888</td><td>Kweekbak voor larven/38 oz</td></tr><tr><td>ChoiceHD 16 oz. Microwavable Translucent Plastic Deli Container</td><td>Webstaurantstore</td><td>128HRD16</td><td>Kweekbak voor larven/16 oz</td></tr><tr><td>Microinjection Scope&nbsp;</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>WILD-M8</td><td>Micro-injectiescoop uitgerust met een XY-stand</td></tr><tr><td>Standard Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>Micro-injectienaalden</td></tr><tr><td>Adult Western Corn Rootworms</td><td>North Centeral Aqricultural reasearch Laboratory</td><td>Non-diapase strain</td><td>Aanvraag van Dr. Bryan Wade French's lab</td></tr><tr><td>Plasmid DNA Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td>Zuivering van injectieklare plasmide-DNA's</td></tr></tbody></table>

microinjection van western maïswortelboorder, diabrotica virgifera virgifera, embryo's voor germline transformatie of crispr/cas9 genoom bewerking

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

De westerse maïswortelboorder (WCR) is een belangrijke plaag van maïs en staat bekend om zijn vermogen om snel aanpassen aan de pest beheersstrategieën. RNA-interferentie (RNAi) is een krachtig hulpmiddel voor de studie van biologie van de WCR gebleken, heeft maar zijn beperkingen. Specifiek, RNAi zelf voorbijgaande aard is (d.w.z. niet leidt tot een langdurige Mendelian inheritance van het bijbehorende fenotype), en het vereist de opeenvolging van DNA van het doel-gen weten. De laatste kan worden beperkt als het fenotype van belang wordt gecontroleerd door slecht bewaard gebleven, of zelfs nieuwe genen, omdat identificeren nuttige doelen zou worden uitdagend, zo niet onmogelijk. Dus, het aantal gereedschappen in de WCR genomic gereedschapset moet worden uitgebreid door de ontwikkeling van methoden die gebruikt kunnen worden maken van stabiele gemuteerde stammen en schakelen sequence-onafhankelijke onderzoeken van de WCR-genoom. Hierin, detailleren wij de methoden voor het verzamelen en microinject van de precellular WCR embryo's met nucleic zuren. Terwijl de hierin beschreven protocollen zijn gericht op het creëren van transgene WCR, kan CRISPR/Cas9-genoom bewerken ook worden uitgevoerd met behulp van dezelfde protocollen, met het enige verschil is de samenstelling van de oplossing die is geïnjecteerd in de embryo's.

Een belangrijke overweging bij het ontwikkelen van dit protocol werd het stadium van de embryonale ontwikkeling ten tijde van microinjection. In het bijzonder vereist germline omzetting microinjection van ANI voorafgaand aan embryonale cellularization. Dit is omdat het DNAS-systeem niet gemakkelijk kruisen celmembranen. Pogingen om te visualiseren van de stadia van embryonale ontwikkeling WCR met behulp van een nucleaire vlek mislukten omdat dechorionation van WCR embryo's in wezen alle v...

Hier presenteren we protocollen voor het verzamelen en microinjecting precellular westelijke maïs rootworm embryo's bestemd voor de uitoefening van functionele-genomic assays zoals germline transformatie en CRISPR/Cas9-genoom bewerken.

Microinjection van Western maïswortelboorder, Diabrotica virgifera virgifera, embryo's voor Germline transformatie of CRISPR/Cas9 genoom bewerking

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Het algemene doel van dit Microinjectieprotocol is om het genoom van de Western Corn Rootworm te modificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de biologie van Western Corn Rootworm en hun vermogen om sneller plaagbestrijdingsmethoden zoals BT Toxin en RANI te overwinnen. Naast Western Corn Rootworms, kan deze methode ook worden toegepast op vergelijkbare soorten, zoals Southern en Northern Rootworms.Ik had voor het eerst het idee voor deze methode toen ik werd gevraagd om te helpen met injectie-gebaseerde RANI in Western Corn Rootworm in de jaren 90. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn bij deze methode worstelen. Omdat het kweken van Western Corn Rootworms in het laboratorium arbeidsintensief is.En de overlevingspercentages blijven laag met behulp van de huidige technologie. Verkrijg tussen de 500 en 1.000 niet-diapauzeerende rootworm-volwassenen van een betrouwbaar bedrijf of onderzoekslaboratorium. En huisvest ze in kooitje van 30 kubieke centimeter.Bewaar het standaard kunstmatige rootworm-dieet in voedselopslagcontainers ongeveer een centimeter diep. Ongebruikt dieet kan gedurende maximaal twee maanden worden bewaard bij vi

microinjection-western-corn-rootworm-diabrotica-virgifera-virgifera

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Deze video beschrijft micro-injection, een veelgebruikte methode om transgene C. elegans stammen te creëren.  In het voorbeeld zien we micro-injection gebruikt om een ribonucleoproteïne (RNP) complex voor CRISPR-bases genbewerking te introduceren.

Gonad Microinjection: Een methode van samengestelde levering direct in de kiembaan van C. elegans

De mediterrane fruitvlieg (Ceratitis capitata) (Diptera: Tephritidae) is een wereldwijde plaag in de landbouw. Een dieper begrip van zijn biologie is cruciaal voor het beheersen van fruitvliegpopulaties en daarmee het verminderen van de economische impact. Micro-injectie van embryo's is een fundamenteel hulpmiddel dat zowel transformatie van de kiemlijn als reverse genetica studies in deze soort mogelijk maakt.

Levering van nucleïnezuren door middel van Embryo micro-injectie in de Worldwide Landbouw Pest Insect,<em&gt; Middellandse-Zeevlieg</em

Microinjection van Nasonia vitripennis embryo's is een essentiële methode voor het genereren van de wijzigingen van het erfelijk genoom. Hier beschreven is een gedetailleerde procedure voor microinjection en transplanteren van Nasonia vitripennis embryo's, die toekomstige genoom manipulatie in dit organisme aanzienlijk zal vergemakkelijken.

Embryo Microinjection en transplantatie techniek voor Nasonia vitripennis genoom manipulatie

Dit protocol beschrijft micro-injectieprocedures voor Culex quinquefasciatus embryo's die zijn geoptimaliseerd om te werken met CRISPR/Cas9 genbewerkingstools. Deze techniek kan efficiënt site-specifieke, erfelijke, kiembaanmutaties genereren die kunnen worden gebruikt voor het bouwen van genetische technologieën in deze onderbelichte ziektevector.

Embryo micro-injection technieken voor efficiënte site-specifieke mutagenese in Culex quinquefasciatus

We bieden een gedetailleerd protocol voor het fokken, micro-injectie van eieren en voor een efficiënte paring van de firebrat Thermobia domestica om mutante stammen te genereren en te onderhouden na genoombewerking.

Ei micro-injectie en efficiënte paring voor genoombewerking in de Firebrat Thermobia domestica

Hier beschrijven we methoden voor efficiënte pop- en volwassen injecties in Nasonia vitripennis als toegankelijke alternatieven voor embryomicro-injectie, waardoor functionele analyse van genen van belang mogelijk is met behulp van RNA-silencing via RNA-interferentie (RNAi) of gen knock-out via CRISPR / Cas9 genoombewerking.

Pupal en volwassen injecties voor RNAi en CRISPR Gen editing in Nasonia vitripennis

Dit protocol beschrijft de stappen van CRISPR/Cas9 gerichte mutagenese bij zandvliegen: embryoverzameling, injectie, insectenopfok en identificatie, evenals selectie van mutaties van belang.

Zandvlieg (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection voor CRISPR/Cas9 Mutagenese

Veel kenmerken van insectenesocialiteit zijn afhankelijk van communicatie binnen de kolonie en arbeidsverdeling. Genetische manipulatie van belangrijke regulerende genen in mierenembryo's via micro-injectie en CRISPR-gemedieerde mutagenese geeft inzicht in de aard van altruïstisch gedrag bij eusociale insecten.

Embryo-injecties voor CRISPR-gemedieerde mutagenese in de mier Harpegnathos saltator

Hier wordt een protocol gepresenteerd van Helicoverpa armigera (Hübner) embryo micro-injectie en knock-out mutant identificatie gemaakt door CRISPR / Cas9 genoombewerking. Gemuteerde insecten maken verder onderzoek naar genfunctie en interactie tussen verschillende genen in vivo mogelijk.

Embryo Microinjectie en Knockout Mutant Identificatie van CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

Hierin staan protocollen voor het verzamelen en micro-injecteren van precellulaire maïsplanthopperembryo's met als doel hun genoom te wijzigen via CRISPR/Cas9-gebaseerde genoombewerking of voor de toevoeging van gemarkeerde transponeerbare elementen door kiembaantransformatie.

Micro-injectie van Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryo's voor CRISPR/Cas9 Genome Editing

Dit artikel demonstreert CRISPR-Cas9-gemedieerde genoomengineering in Steinernema hermaphroditum, een entomopathogene (EPN: insect-parasitaire) nematode en een opkomend genetisch model. De beschreven technologie is nuttig voor het creëren van mutanten, waardoor genfuncties in de nematodebiologie kunnen worden opgehelderd die relevant zijn voor mutualistische en parasitaire symbiose.

CRISPR-Cas9-gebaseerde mutagenese in de entomopathogene nematode Steinernema hermaphroditum en het onderhoud van mutante lijnen

Leer micro-injectie van Western Corn Rootworm embryo's voor CRISPR/Cas9-genoombewerking en kiembaantransformatie. Deze methode ondersteunt functioneel-genomisch onderzoek naar resistentiemechanismen.

Microinjection van Western maïswortelboorder, Diabrotica virgifera virgifera, embryos voor Germline transformatie of CRISPR/Cas9 genoom bewerking (Video) | JoVE Journal

Microinjection van Western maïswortelboorder, Diabrotica virgifera virgifera, embryo's voor Germline transformatie of CRISPR/Cas9 genoom bewerking

Meer video's verkennen