Microinjection van Western maïswortelboorder, Diabrotica virgifera virgifera, embryo's voor Germline transformatie of CRISPR/Cas9 genoom bewerking
27 april 2018
Hier presenteren we protocollen voor het verzamelen en microinjecting precellular westelijke maïs rootworm embryo's bestemd voor de uitoefening van functionele-genomic assays zoals germline transformatie en CRISPR/Cas9-genoom bewerken.
Het algemene doel van dit Microinjectieprotocol is om het genoom van de Western Corn Rootworm te modificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de biologie van Western Corn Rootworm en hun vermogen om sneller plaagbestrijdingsmethoden zoals BT Toxin en RANI te overwinnen. Naast Western Corn Rootworms, kan deze methode ook worden toegepast op vergelijkbare soorten, zoals Southern en Northern Rootworms.
Ik had voor het eerst het idee voor deze methode toen ik werd gevraagd om te helpen met injectie-gebaseerde RANI in Western Corn Rootworm in de jaren 90. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn bij deze methode worstelen. Omdat het kweken van Western Corn Rootworms in het laboratorium arbeidsintensief is.
En de overlevingspercentages blijven laag met behulp van de huidige technologie. Verkrijg tussen de 500 en 1.000 niet-diapauzeerende rootworm-volwassenen van een betrouwbaar bedrijf of onderzoekslaboratorium. En huisvest ze in kooitje van 30 kubieke centimeter.
Bewaar het standaard kunstmatige rootworm-dieet in voedselopslagcontainers ongeveer een centimeter diep. Ongebruikt dieet kan gedurende maximaal twee maanden worden bewaard bij vier graden Celsius. Om de rootworm te voeden, laad 100 centimeter Petri-schalen met 10 tot 15 gram dieet.
Laad één schaal met voedsel in elke rootworm-kooi. En vul deze aan wanneer de voorraad opraakt of het dieet uitdroogt. Houd ook een waterreservoir van 300 milliliter, bedekt met een katoenen bal, in elke kooi als waterbron.
Ververs het water wanneer het opraakt. Houd de gekooide rootworm op 26 graden Celsius met 60% vochtigheid en een 14/10 lichtcyclus in een insectenkweekincubator. Stel de lichten uit op een later tijdstip op de dag, zoals middernacht, zodat eieren worden gelegd vóór de ochtendwerkuren.
Verzamel eerst de embryo's. Laad voor een eierverzameloppervlak een 100 millimeter Petri-schaal met 30 milliliter 1% agar en water. Plaats vervolgens een enkele laag filterpapier op de agar, gevolgd door vier lagen kaasdoek.
Elke laag moet op maat worden gesneden. Plaats vervolgens zo laat in de dag mogelijk de eierverzamelplaat in de rootworm-kooi en bedek deze met een tent van aluminiumfolie. Vervolgens, verwijder de volgende ochtend de eierverzamelkamer.
Gebruik een pincet om één laag kaasdoek tegelijk op te pakken en plaats in een 500 milliliter beker gevuld met water. Was de eieren van het kaasdoek door in het water te draaien. Gebruik vervolgens een bulbpijp om de eieren over te brengen naar een andere beker met water als een wasstap.
Voer twee of drie wasbeurten op deze manier uit. Deponeer vervolgens de schoongemaakte eieren op filterpapier met zo min mogelijk water. Bereid vervolgens een dia voor door een stuk zwart filterpapier plat op de dia te plakken om het contrast te verbeteren.
Bestrijk vervolgens fijne lijnen van niet-toxisch lijm op het papier dat wordt gebruikt om de eieren vast te zetten. Houd de lijm onder de omtrek van een ei. Terwijl de lijm nat is, gebruik een fijn penseel om de eieren op de lijmlijn te plaatsen.
Houd ten minste de afstand van één ei tussen elke ei. Bereid meerdere lijnen eieren per dia voor. De eieren moeten nu binnen 30 minuten worden geïnjecteerd.
Combineer nu het helperplasmide, donorplasmide en fenolrode buffer. Gebruik hoge kwaliteit, supergewonden plasmiden gemaakt met een endotoxine-vrije commerciële kit. Voortex kort om te mengen.
En draai vervolgens de deeltjes drie minuten bij maximale snelheid neer. Vul vervolgens getrokken borosilicaatglazen naalden met 0,5 tot 1 microliter injectieoplossing. Zorg ervoor dat eventuele bellen worden verwijderd.
Bevestig vervolgens de injectienaald aan de micromanipulator. Nu, indien nodig, onder de microscoop, breek voorzichtig de verzegelde naaldtip af met een fijn pincet of door de tip voorzichtig in een glazen barrière te brengen. Probeer de kleinst mogelijke opening te maken die injectieoplossing vrijgeeft.
Voordat je de rootworm-eieren injecteert, gebruik een fijne verfkwast om het oppervlak van een tot drie voorbereide eieren voorzichtig nat te maken met steriel water. Injecteer vervolgens de bevochtigde embryo's. Steek voorzichtig de naald in het midden van het embryo en injecteer een kleine hoeveelheid oplossing.
Begin met het gebruik van 10 tot 13 psi druk en pas de druk naar behoefte aan. Droge embryo's hebben een duidelijk ronde vorm, door elk embryo vooraf met water te bevochtigen, verandert hun vorm en verzachten de eischelpen, waardoor de naald gemakkelijk kan penetreren. Een succesvol geïnjecteerd embryo zal een kleine hoeveelheid rode kleur hebben.
Als een ei beschadigd is, er vreemd uitziet of niet kan worden geïnjecteerd, verpletter het dan of verwijder het van de dia. Nadat alle eieren zijn geïnjecteerd, verplaats het filterpapier met de eieren erop naar een 1% agar-schaal. Vervolgens verzegel de schaal met paraffinefolie en incubeer deze op 26 graden Celsius totdat de larven uitkomen.
12 dagen na injectie, begin elke dag twee weken lang te controleren op larven. Breng de larven over met een fijn penseel naar een kweekdoos met ontkiemde maïs en aarde om ze onder standaard omstandigheden op te voeden. Germline-transformatie van rootworm werd geprobeerd door co-injectie van een transposase dragend plasmide met een transposon dragend plasmide in pre-cellulaire embryo's.
Bij de 26 overlevenden werd elke EFP-expressie gebruikt om te screenen op insertie van donorelement. Hoewel thoracent nakomelingen werden geïdentificeerd, bleek het screenen van rootworm-embryo's met de intense lichtbron dodelijk te zijn. De volgende ronde van germline-transformatie gebruikte een rood fluoresceringseiwitgen dat werd aangedreven door een constitutief actief promotor van Drosophila melanogaster.
De overlevingspercentages verbeterden, maar er werd slechts één DS-rood positieve larve geregistreerd. Vervolgens werden embryo's micro-geïnjecteerd met alleen buffer of met helper en thorescentie-gemarkeerde donor DNA
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een micro-injectieprotocol gericht op het modificeren van het genoom van de westerse maïswortelboormot. De methode faciliteert functionele-genomische assays, waaronder kiemlijn-transformatie en CRISPR/Cas9-genoomredactie, die essentieel zijn voor het begrijpen van resistentiemechanismen bij plagen.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Genetische modificatie
- Entomologie
- Functionele genomica
Achtergrond
- De westelijke maïswortelboormot is een belangrijke landbougplaag.
- Inzicht in de biologie ervan is cruciaal voor de ontwikkeling van effectieve strategieën voor plaagbestrijding.
- Het laboratoriumkweek van deze insecten is arbeidsintensief en uitdagend.
- Eerdere methoden waren niet in staat om hun genoom effectief te modificeren.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar micro-injectieprotocol te ontwikkelen voor embryo's van de westerse maïs wortelboorder.
- Om CRISPR/Cas9-genoommodificatie mogelijk te maken voor functioneel-genomische studies.
- Om het begrip van resistentiemechanismen van plagen tegen bestrijdingsmethoden te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Micro-injectie van precellulaire embryo's.
- Toepassing van CRISPR/Cas9 voor genoomredactie.
- Functioneel-genomische assays om genetische modificaties te beoordelen.
- Vergelijkende analyse met soortgelijke wortela nematode-soorten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle modificatie van het genoom van de westelijke maïsbewortelboormot.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van de methode op zuidelijke en noordelijke wortelboormotten.
- Inzichten in de biologie van wortelboormotten en hun resistentie tegen BT-toxine.
- Opstelling van een protocol dat door onderzoekers kan worden gebruikt.
Conclusies
- Het micro-injectieprotocol is een waardevolle tool voor genetische studies bij wortelboorders.
- Het biedt een basis voor toekomstig onderzoek naar strategieën voor plaagbestrijding.
- Verdere studies zijn nodig om het volledige potentieel van deze methode te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Het vestigen van stabiele mogelijkheden voor genetische modificatie in plaagsoorten maakt een mechanistische risicobeperking van doelwitvalidatie mogelijk en ondersteunt het voorspellend vertrouwen in strategieën voor resistentiebeheer. Deze microinjectiemethode biedt een fundamenteel instrument voor functionele genomica bij de westerse maïsbeitelaar, wat sequentie-onafhankelijke onderzoeken en kiemlijnmodificatie faciliteert. Dergelijke mogelijkheden zijn essentieel voor vroege ontdekkingsworkflows, waarbij inzicht in genfuncties bijdraagt aan de prioritering van doelen voor plaagbestrijding en de identificatie van lead-candidates.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om genfuncties te onderzoeken via kiemlijn-transformatie en CRISPR/Cas9-editing om targets te valideren die betrokken zijn bij resistentiemechanismen.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare methode voor het genereren van mutante stammen om de fenotypische gevolgen van gen-disruptie te beoordelen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert genetisch gemodificeerde systemen voor kwantitatieve fenotypische screening van gen-knockouts of edits.
- Operationele waarde: Ondersteunt assay-standaardisatie via embryo-microinjectieprotocollen die consistente transformatieresultaten opleveren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Maakt de ontwikkeling van ziekterevante systemen mogelijk door stammen te creëren met bewerkte resistentiegenen om mechanismen van adaptatie aan bestrijdingsstrategieën te bestuderen.
- Operationele waarde: Faciliteert translationele continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door het vaststellen van erfelijke genetische modificaties.
Pipeline- en workflowintegratie
De methode kan worden geïntegreerd in vroege discovery-workflows door targetvalidatie en lead-identificatie mogelijk te maken via functionele genomische assays in een plaagmodel-systeem.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door nauwkeurige genomische modificaties mogelijk te maken voor het bestuderen van de functie van resistentiegenen.
- Screening: Maakt de voorbereiding van gevalideerde biologische systemen mogelijk voor downstream toepassingen van compound- of genetische screening.
- Analytics: Biedt kwantitatieve read-outs, zoals de expressie van fluorescentiemarkers, om de efficiëntie van editing en kiemlijnoverdracht te beoordelen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit door het vestigen van stabiele mutante lijnen voor studies naar resistentiemechanismen.
- Enterprise hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor genetische modificatie dat toepasbaar is op verschillende wortelvreet-soorten en resistentiegen-targets.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid bij doelwitvalidatie door middel van directe functionele beoordeling van genbewerkingen in vivo.
- Operationele waarde: Standaardisatie en schaalbaarheid van embryo-microinjectie voor high-throughput genetische modificatie-inspanningen.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen bij de prioritering van doelwitten door het verminderen van mechanische ambiguïteit in resistentiewegen.
- Impact op portfolio: Risicogebaseerde bevordering van doelwitten op basis van gevalideerde functionele genomica-gegevens van gemodificeerde stammen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in insectenembryologie en microinjectietechnieken voor het hanteren van precellulaire embryo's.
- Afhankelijk van micromanipulatie-infrastructuur en de mogelijkheid om borosilicaatnaaldjes voor te bereiden.
- Vereist gestandaardiseerde kweekprotocollen om gesynchroniseerde, niet-diapauzerende embryo's voor injectie te verkrijgen.
- Omvat optimalisatie van de injectiedruk en de samenstelling van de oplossing om embryonale letaliteit te minimaliseren.
- Beperkt door lage overlevings- en uitkomstpercentages, waardoor grote startaantallen embryo's nodig zijn om voldoende gemodificeerde lijnen te verkrijgen.
