Name: Gebruik van twee dimensionale semi-denatureren wasmiddel Agarose gelelektroforese te bevestigen grootte heterogeniteit van amyloïde of Amyloid-achtige vezels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Leer hoe u twee-dimensionale semi-denaturerende agarose gelelektroforese gebruikt om de grootteheterogeniteit van amyloïde vezels te bevestigen. Deze methode onderzoekt of variaties inherent zijn aan de vezels of ontstaan tijdens elektroforese.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door een fellowship voor S.H.-A. NIH-/ NCATS (TL1TR001104), een stichting Welch verlenen (I-1827) en een subsidie van de R01 van NIGMS (RGM120502A) voor Z.W. Z.W. is de Virginia Murchison Linthicum geleerde in medisch onderzoek en preventie van kanker en onderzoek instituut van Texas geleerde (R1222).

1. voorbereiding van de monsters
<ol><li>Cultuur 2 x 106 amyloid HT-29 dikke darm kankercellen in een schaal 10-cm weefselkweek in 10 mL van de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) met 10% foetale runderserum en penicilline-streptomycine produceren. Cultuur cellen overnachting in een incubator 37 ° C met 5% CO2.<ol>
<li>Nadat de cellen tot 80% confluentie groeien, wassen de cellen met 10 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg 3 mL trypsine oplossing en Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 minuten.</li>
		<li>Nadat de cellen volledig gedissocieerde uit de schotel zijn, voeg toe 10 mL gestolde voedingsbodem en de cellen met een pipet 10 mL overbrengen in een conische buis 15 mL. Centrifugeer de cellen bij 1.000 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Het medium gecombineerd, resuspendeer de cellen in 5 mL gestolde voedingsbodem en met behulp van een cel counter cellen tellen. Plaat 2 x 106 cellen in elk van de twee 10-cm schotels.</li>
		<li>De cellen te houden en te herstellen 's nachts in een incubator 37 ° C met 5% CO2toestaan. Behandeling toepassen op een schotel voor het opwekken van de vorming van amyloids met 20 ng/mL Tumornecrosefactor-alfa (TNF-α), 100 nM Smac-mimetische en 20 µM pan-caspase-remmer Z-VAD-FMK11. De combinatie wordt afgekort als TSZ. Behandelen de andere schotel met voertuig als een besturingselement.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Na de juiste lengte van de tijd, meestal 6 h, oogsten de cel lysate.<ol>
<li>Schraap de cellen uit de plaat met een kunststof schraper en een 10-mL pipet gebruiken om te zetten in een conische buis 15 mL. Centrifugeer de cellen bij 1.000 x g gedurende 3 min bij 4 ° C.</li>
		<li>De cellen 2 keer wassen door resuspending in 10 mL ijs koud PBS en centrifugeren bij 1.000 x g gedurende 3 min bij 4 ° C. De PBS-oplossing gecombineerd. Opmerking: Het proces kan hier onderbroken worden door bevriezing van de cel pellet in vloeibare stikstof en slaan op ˗80 ° C voor maximaal 1 maand.</li>
		<li>De cel pellet overbrengen naar een 1.5-mL microcentrifuge buis en incubeer in 0.3 mL lysisbuffermengsel gedurende 30 minuten op het ijs. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C. De bovendrijvende substantie is de hele cel lysate. Opmerking: Het proces kan hier onderbroken worden door op te slaan van het monster bij-20 ° C voor tot enkele maanden.</li>
		<li>De eiwitconcentratie meten door een analyse van Bradford volgens protocol van de fabrikant. Voeg 4 x SDD-leeftijd laden buffer te bereiden 20 µL van 3 µg/µL monster en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. opstellen en uitvoeren van Gels
<ol><li>Voeg 2 g agarose tot 200 mL voor 1 x Tris-acetaat buffer (TAE) in een bekerglas van glas en warmte in een magnetron te smelten de agarose. Voeg 1 mL 20% SDS voor een uiteindelijke concentratie van 0,1% SDS. Swirl zorgvuldig te mengen. Wees voorzichtig niet te bellen na de toevoeging van de SDS genereren.</li>
	<li>Giet de agarose-oplossing in een gel-plaat van 15 cm x 14 cm. Gebruik een 1 mL pipet te elimineren alle bubbels. Plaats een 20-well kam boven.</li>
	<li>Eerste dimensie: Pipetteer 60 µg van hele cel lysate in de extreem-rechtse rijstrook. Uitvoeren van de gel op 60 V voor ongeveer 4 h (totdat de kleurstof voorzijde ongeveer ¾ door de gel is) met behulp van de TAE met 0,1% SDS als de lopende buffer.</li>
	<li>Tweede dimensie: zorgvuldig draaien de gel 90° linksom(Figuur 2). Stel de gel op 60 V voor ongeveer 4 uur. Opmerking: De algemene lopende voorwaarde is 4 V/cm gel lengte. Het is belangrijk dat de lopende voorwaarden precies hetzelfde voor de eerste en tweede dimensie zijn.</li>
</ol>3. overdracht
<ol><li>Gebruik de capillaire overdrachtmethode om de eiwitten overbrengen in een Polyvinylideenfluoride (PVDF) difluoride membraan (Figuur 2B).<ol>
<li>Voeg 500 mL buffer van de overdracht aan een ongeveer 20 x 20 cm container. Het maken van een 5-cm hoge stapel papieren handdoeken naast de container. De oppervlakte van de bovenkant van de stack moet groter zijn dan de afmetingen van de gel.</li>
		<li>Doordrenk een filtreerpapier 14 x 15 cm in overdracht buffer en plaats boven aan de stapel papier handdoek. Zorg om te plaatsen op het papier met geen rimpels of bellen. Herhaal met een ander stuk filtreerpapier.</li>
		<li>Activeren van een membraan PVDF 14 x 15 cm in methanol voor 30 s laag dan het op het filtreerpapier verzorgen met een roller te verwijderen alle bubbels. Spoel de gel af met overdracht buffer en het laag op de top van het membraan, opnieuw uitrollen van alle bubbels.</li>
		<li>Betrekking hebben op de rand van het dichtst bij de container van overdracht buffer met plastic wrap keukenpapier. Het is belangrijk dat de papieren brug gebouwd in de volgende stap niet in direct contact met de stapel papier handdoek komt.</li>
		<li>Geniet van een stuk van 15 x 35 cm filtreerpapier in overdracht buffer en plaats het zodat één uiteinde de bovenkant van de gel bestrijkt en het andere uiteinde in de container van overdracht buffer. Herhaal met een andere brug.</li>
		<li>Bedek de container met plastic wrap en laat 's nachts bij kamertemperatuur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. westelijke bevlekken detectie
<ol><li>Spoel het membraan met 50 mL PBS met 0,05% Tween-20 (PBST) in een container van 20 cm × 20 cm. Voeg 20 mL 5% melk in PBST. Rock bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten om te blokkeren.</li>
	<li>Pipetteer 10 µL konijn anti-MLKL antistof in 20 mL 5% melk in PBST en toevoegen aan de container. Incubeer op rocker's nachts bij 4 ° C.</li>
	<li>Het membraan in 20 mL PBST voor 5 min. Herhaal 5 keer wassen.</li>
	<li>Pipetteer 4 µL van anti-rabbit-HRP tot 20 mL 5% melk in PBST en toevoegen aan de container. Incubeer op rocker bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.</li>
	<li>Het membraan in 20 mL PBST voor 5 min. Herhaal 5 keer wassen.</li>
	<li>Verbeterde Chemiluminescentie substraat (ECL) toevoegen en blootstellen aan X-ray films volgens protocol van de fabrikant.</li>
</ol>

<ol><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature medicine. 10, 10-17 (2004).</li>
<li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146, 448-461 (2011).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIP1%2FRIP3+necrosome+forms+a+functional+amyloid+signaling+complex+required+for+programmed+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis.</a> Cell. 150, 339-350 (2012).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLKL+forms+disulfide+bond-dependent+amyloid-like+polymers+to+induce+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).</li>
<li>Uptain, S. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+as+protein-based+genetic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+microbiology%22%5BJournal%5D)">Prions as protein-based genetic elements.</a> Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).</li>
<li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Sipe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomenclature+2014%3A+Amyloid+fibril+proteins+and+clinical+classification+of+the+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid+%3A+the+international+journal+of+experimental+and+clinical+investigation+%3A+the+official+journal+of+the+International+Society+of+Amyloidosis%22%5BJournal%5D)">Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis.</a> Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).</li>
<li>Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Studies+of+Amyloid+Proteins+at+the+Molecular+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level.</a> Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).</li>
<li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687906120030">Methods in Enzymology</a>. 412, Academic Press. 33-48 (2006).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+mediates+necrosis+signaling+downstream+of+RIP3+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase.</a> Cell. 148, 213-227 (2012).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha.</a> Cell. 137, 1100-1111 (2009).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

De meest kritische aspect van de 2D SDD-leeftijd is dat de voorwaarden van de elektroforese hetzelfde voor de eerste en tweede dimensie zijn. De capaciteit om te ontdekken een scherpe diagonale lijn van 45 ° (hetgeen aangeeft dat geen dissociatie of aantasting heeft plaatsgevonden) hangt af van de vezels die migreren op identieke wijze tijdens beide electrophoreses. Met behulp van verschillende omstandigheden, bijvoorbeeld het wijzigen van de spanning of de lengte van de runtime zal het verdoezelen van deze resultaten. O...

De vorming van amyloïde vezels te wijten aan het eiwit misfolding is al lang bekend een rol te spelen in de pathologische aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer, ziekte van Parkinson en de ziekte van Huntington1. Meer recentelijk, de vorming van amyloïde of amyloid-achtige vezels is gebleken om een deel van signaalroutes bij de mens, met inbegrip van tijdens anti-virale ingeboren immune reactie2 en necroptosis3,4, en in lagere organismen zoals gist5,6. De mogelijkheid om op te sporen van deze vezels in het lab is daarom belangrijk. Momenteel zijn er drie belangrijke manieren om amyloid en amyloid-achtige vezels te detecteren: het gebruik van kleurstoffen, EM en SDD-leeftijd.
Het gebruik van kleurstoffen, zoals Congo rood of Thioflavin T, biedt het voordeel dat ze snel en gemakkelijk aantoonbaar met behulp van microscopie of spectroscopie7. Detectie door microscopie, in het geval van Congo rood, biedt echter geen specificiteit waarover eiwitten bestaan uit de vezels, of de grootte van de vezels. Ook biedt het gebruik van de spectroscopie te detecteren Congo rood of Thioflavin T binding aan eiwitcomplexen alleen een positief of negatief resultaat.
EM biedt sluitend bewijs van de aanwezigheid van vezels en ook kwantitatieve informatie over de vezel lengte en diameter8. Deze methode vereist echter zeer strenge zuivering. Bovendien, is EM een gespecialiseerde techniek die gebruik maakt van dure apparatuur.
SDD-leeftijd is gebruikt voor het detecteren van SDS-resistente mega Dalton eiwitcomplexen met inbegrip van amyloïde of amyloid-achtige vezels. Het biedt vele voordelen. Ten eerste, het is niet vereist voor de zuivering van de vezels en is gemakkelijk te peform9. Ten tweede, het biedt kwalitatieve informatie over de grootte van de vezels, met inbegrip van de relatieve grootte en hoeveelheid van de vezel heterogenicity. Ten slotte, omdat het westelijke bevlekken kan worden uitgevoerd na elektroforese, het is gemakkelijk om het detecteren van de aanwezigheid van een eiwit waarvoor er een antilichaam is, hoewel hierbij moet worden opgemerkt dat omdat SDD-leeftijd semi-denatureren is, sommige epitopes verborgen die blijven kunnen compliceert detectie door antilichaam.
Onlangs, receptor interactie proteïne kinase 1 (RIPK1) en 3 (RIPK3) gemeld aan formulier amyloïde vezels om te dienen als signalering platformen tijdens necroptosis, een geprogrammeerde vorm van necrose3. Terwijl het bestuderen van deze vezels, toonde ons lab dat een ander necroptosis-geassocieerde proteïne, gemengde afkomst kinase domein-achtige (MLKL), ook amyloid-achtige vezels4gevormd. Echter, bij onderzoek met de SDD-leeftijd, de grootte van de vezels MLKL verscheen onderscheiden van de RIPK1 en RIPK3 vezels, die leek identiek aan elkaar (Figuur 1). Dit was onverwacht omdat het is bekend dat MLKL aan RIPK1/RIPK3 bindt om te vormen de necroptosis signalering complex genaamd de necrosome10.
Er zijn ten minste twee verklaringen. Ten eerste, twee totaal verschillende amyloid-achtige vezels kunnen vormen tijdens de necroptosis, een met RIPK1/RIPK3 en de andere met MLKL. Ten tweede, is slechts één type van amyloid-achtige vezels die met RIPK1/RIPK3/MLKL kan worden gevormd tijdens de necroptosis, maar de associatie van MLKL met de andere eiwitten zwak genoeg dat het distantieert tijdens SDD-leeftijd.
Om aan te pakken dit, stellen wij voor het uitvoeren van een tweedimensionale (2D) SDD-leeftijd. SDD-leeftijd-stable amyloid of amyloid-achtige vezels zal hetzelfde patroon migratie hebben tijdens de eerste en de tweede dimensie elektroforese. Dit is aantoonbaar zijn na overdracht van de eiwitten naar een membraan en het uitvoeren van een westelijke vlek. Stabiele vezels zal een scherpe diagonaal patroon vertonen. Elke afwijking hiervan zou suggereren dat de vezels ondergaan veranderingen als gevolg van de SDS-elektroforese.

<table><tbody><tr><td>gelelektroforese-eenheid</td><td>Fisher</td><td>HE99XPRO</td><td>apparaten voor gel uitvoering.</td></tr><tr><td>agrose</td><td>VWR</td><td>97062-250</td><td>Voor agarosegel.</td></tr><tr><td>papieren toren</td><td>Fisher</td><td>19-120-2484</td><td>voor overdracht</td></tr><tr><td>filterpapier</td><td>VWR</td><td>21427-386</td><td>voor overdracht</td></tr><tr><td>PVDF-membraan</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0177</td><td>voor overdracht</td></tr><tr><td>blokkerende melkpoeder</td><td>Bio-Rad</td><td>1706404XTU</td><td>voor blokkering in Western blot</td></tr><tr><td>MLKL-antilichaam</td><td>Genetex</td><td>GTX107538</td><td>konijn anti-MLKL-antilichaam</td></tr><tr><td>RIPK1-antilichaam</td><td>BD Biosciences</td><td>610459</td><td>muis anti-RIPK1-antilichaam</td></tr><tr><td>RIPK3-antilichaam</td><td>geschenk van Dr. Xiaodong Wang</td><td></td><td>konijn anti-RIPK3. Zie referentie 11.</td></tr><tr><td>anti-Konijn-HRP</td><td>Sigma</td><td>A6154</td><td>secundair antilichaam</td></tr><tr><td>ECL</td><td>Fisher</td><td>WBKLS0500</td><td>Western chemiluminescent HRP-substraat</td></tr><tr><td>X-ray film</td><td>Fisher</td><td>F-BX810</td><td>voor Western blot-resultaat</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>voor celkweek</td></tr><tr><td>foetaal bovien serum</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>voor celkweek</td></tr><tr><td>penicilline-streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>voor celkweek</td></tr><tr><td>Trypsinoplossing</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>voor celkweek</td></tr><tr><td>PBS voor weefselkweek</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td>voor celkweek</td></tr><tr><td>recombinant TNF</td><td>gemaakt in ons lab</td><td></td><td>voor het induceren van necroptose. Zie referentie 11.</td></tr><tr><td>smac-mimetiek</td><td>geschenk van Dr. Xiaodong Wang</td><td></td><td>voor het induceren van necroptose. Zie referentie 11.</td></tr><tr><td>ZVAD-FMK</td><td>ApexBio</td><td>A1902</td><td>voor het induceren van necroptose. Zie referentie 11.</td></tr><tr><td>Cell Counter</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td>Model TC20; voor het tellen van cellen</td></tr><tr><td>Pierce&trade; BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>voor het meten van eiwitconcentratie in cellysaten</td></tr><tr><td>Cell lifter</td><td>Fisher</td><td>07-200-364</td><td>om cellen uit het schaaltje te verwijderen</td></tr><tr><td>Lysis Buffer (1 L)</td><td></td><td></td><td>20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (protease en fosfaatremmers naar wens)</td></tr><tr><td>10X TAE (1 L)</td><td></td><td></td><td>48,4 g Tris-base 11,42 mL ijzerazijnzuur 20 mL 0,5M EDTA pH 8 ddH20 tot 1 L</td></tr><tr><td>4X SDD-AGE loading buffer (50 mL)</td><td></td><td></td><td>5 mL 10X TAE 10 mL glycerol 4 mL 20% SDS 0,5 mL 10% broomfenolblauw 31 mL ddH2O</td></tr><tr><td>TBS Transfer Buffer (1 L)</td><td></td><td></td><td>20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O</td></tr><tr><td>PBST Wash Buffer (1 L)</td><td></td><td></td><td>100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20</td></tr><tr><td>10X PBS (10 L)</td><td></td><td></td><td>800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 voeg ddH2O toe tot 10 L</td></tr></tbody></table>

gebruik van twee dimensionale semi-denatureren wasmiddel agarose gelelektroforese te bevestigen grootte heterogeniteit van amyloïde of amyloid-achtige vezels

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Amyloïde of amyloid-achtige vezels zijn geassocieerd met vele ziekten bij de mens, en zijn nu belangrijk voor vele signaalroutes wordt ontdekt. De mogelijkheid om de vorming van deze vezels onder verschillende experimentele omstandigheden gemakkelijk te detecteren is van essentieel belang voor het begrijpen van hun potentiële functie. Veel methoden zijn gebruikt voor het detecteren van de vezels, maar niet zonder nadelen. Elektronenmicroscopie (EM) of kleuring met Congo rood of Thioflavin T vaak wordt bijvoorbeeld vereist dat de zuivering van de vezels. Aan de andere kant, maakt semi-denatureren wasmiddel agarose gelelektroforese (SDD-leeftijd) de ontdekking van de SDS-resistente amyloid-achtige vezels in de cel extracten zonder zuivering. Bovendien, staat het de vergelijking van het verschil van de grootte van de vezels. Wat nog belangrijker is, kan het worden gebruikt om te identificeren specifieke proteïnen binnen de vezels door het westelijke bevlekken. Het is minder tijdrovend en meer gemakkelijk toegankelijk is voor een groter aantal labs. Resultaten van de SDD-leeftijd blijkt vaak variabele mate van heterogeniteit. Het doet de vraag rijzen of het deel van de heterogeniteit voortvloeit uit de dissociatie van het eiwit complex tijdens de elektroforese in aanwezigheid van SDS. Om deze reden hebben we een tweede dimensie van de SDD-leeftijd om te bepalen als de heterogeniteit van de grootte gezien in SDD-leeftijd echt een resultaat van vezel heterogeniteit in vivo en niet een gevolg van afbraak of dissociatie van een aantal van de eiwitten tijdens is dienst elektroforese. Met deze methode kunt snelle en kwalitatieve bevestiging dat de amyloïde of amyloid-achtige vezels niet gedeeltelijk tijdens het proces van de SDD-leeftijd distantieert zijn.

Na necroptosis inductie bleek RIPK1 en RIPK3 bijna identiek amyloid-achtige patronen (rijstroken 2 en 4, Figuur 1). Meer heterogene waren echter MLKL vezels en leek te zijn kleiner dan RIPK1/RIPK3 vezels (lane 6, Figuur 1). Dat gevraagd ons de 2D SDD-leeftijd-methode om de mogelijkheid MLKL vormt RIPK1/RIPK3-onafhankelijke vezels of MLKL gewoon distantieert van de grote RIPK1/RIPK3/MLKL-vezels tijdens SDD-leeftijd te ontwikkelen....

Hier gebruiken we de Elektroforese van het gel van de tweedimensionale semi-denatureren agarose bevestigen de aanwezigheid van amyloid-achtige vezels van heterogene grootte en uitsluiten van de mogelijkheid dat de heterogeniteit van grootte te wijten aan de dissociatie van de amyloïde vezels tijdens de gel is lopend proces.

Gebruik van twee dimensionale semi-denatureren wasmiddel Agarose gelelektroforese te bevestigen grootte heterogeniteit van amyloïde of Amyloid-achtige vezels

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Het algemene doel van deze tweedimensionale semi-denaturerende detergent agarose gel elektroforese is om de grootteheterogeniteit van amyloïde of amyloïde-achtige vezels te bevestigen die tijdens traditionele SDD-AGE worden gezien. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de amyloïde of eiwitaggregatievelden, zoals of de grootteheterogeniteit die tijdens traditionele SDD-AGE wordt gezien, de native toestand van de vezels in vivo is of het resultaat van eiwitdegradatie of dissociatie tijdens gelelektroforese. Het grote voordeel van deze techniek is dat deze gemakkelijk in het laboratorium kan worden uitgevoerd zonder gespecialiseerde apparatuur.Er is geen extra apparatuur nodig buiten wat wordt gebruikt in traditionele SDD-AGE. Eerst zaai je de amyloïde producerende HT-29 colon kankercellen in een 10-centimeter weefselkweekschaal. Vervolgens incubeer je de cellen een nacht bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.Zodra de cellen 80% confluency bereiken, gebruik je fosfaatgebufferde zoutoplossing om de cellen te wassen. Voeg vervolgens drie milliliter trypsine toe aan de cellen en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende drie minuten. Nadat de cellen

use-two-dimensional-semi-denaturing-detergent-agarose-gel

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

SDD-AGE is een nuttige techniek voor de detectie en karakterisering van amyloid-achtige polymeren in de cellen. Hier laten we zien een aanpassing dat maakt deze techniek vatbaar is voor grootschalige toepassingen.

Screening op Amyloid Aggregation door semi-denaturerende Detergent-agarosegelelektroforese

This video demonstrates the separation procedure of heparan sulfates isolated from mouse lung tissue using polyacrylamide gel electrophoresis.

Polyacrylamide Gel Electrophoresis: An Analytical Technique to Detect Heparan Sulfates of Varying Chain Lengths Isolated from Mouse Lung Tissue

This video demonstrates a denaturing polyacrylamide-based separation technique for proteins. This technique helps in the preliminary identification of proteins based on their molecular weights.

Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis for Protein Analysis: A Technique to Separate and Visualize Proteins Based on Molecular Weight

This video demonstrates the two-dimensional semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis-based separation of amyloid fibers. The technique separates the polymorphic amyloid aggregates based on their heterogeneous size.

Two-Dimensional Semi-Denaturing Agarose Gel Electrophoresis: A Technique to Separate Polymorphic Amyloids Fibers Based on Size Heterogeneity

In this video, we demonstrate a two-dimensional gel electrophoresis method that separates individual proteins from a complex protein mixture obtained from tumor tissues of human nonfunctional pituitary adenoma (NFPA). The proteins are separated based on their electric charge in the first dimension and further separated based on molecular weights in the second dimension.

Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis: A Separation Technique for Analysis of Proteins in Complex Protein Mixture Based on Charge and Molecular Weight

Dit rapport beschrijft technieken om gesulfateerde glycosaminoglycanen (GAG's) uit biologische monsters te isoleren en te zuiveren en een polyacrylamidegel-elektroforesebenadering om hun grootte te benaderen. GAG's dragen bij aan de weefselstructuur en beïnvloeden signaleringsprocessen via elektrostatische interactie met eiwitten. GAG-polymeerlengte draagt bij aan hun bindingsaffiniteit voor verwante liganden.

Detectie van glycosaminoglycanen door polyacrylamide gel-elektroforese en zilverkleuring

Dit protocol demonstreert isolatie van één vezel uit gevriesdroogde menselijke skeletspier- en vezeltypeclassificatie volgens Myosin heavy chain (MHC) isovorm met behulp van de dot blotting-techniek. Geïdentificeerde MHC I- en II-vezelmonsters kunnen vervolgens verder worden geanalyseerd op vezeltype-specifieke verschillen in eiwitexpressie met behulp van western blotting.

Vezeltype-identificatie van menselijke skeletspieren

Dit artikel beschrijft een eenvoudig en snel protocol om de oligomere toestand van het dynamin-achtige GTPase MxA-eiwit uit lysaten van menselijke cellen te evalueren met behulp van een combinatie van niet-denaturerende PAGE met western blot-analyse.

Karakterisering van Multi-subunit eiwitcomplexen of Human MxA het gebruik van niet-denaturerende Polyacrylamide Gel-elektroforese

Een protocol wordt gepresenteerd voor de productie van tRNA (UUU) en de analyse van tRNA (UUU) in complex met het enzym TcdA door middel van agarose gel retardatie assays.

Proteïne-tRNA Agarose Gel Retardatie Assays voor de analyse van de<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -threonylcarbamoyladenosine TcdA-functie

Dit protocol beschrijft de scheiding van functionele mitochondriale elektronen transportketen complexen (Cx) IV en supercomplexen daarvan door gebruik te maken van natieve elektroforese om informatie over hun montage en structuur te onthullen. De inheemse gel kan onderworpen worden aan immunoblotting, in-gel assays, en zuivering door elektroelutie om individuele complexen verder te karakteriseren.

Analyse van supercomplexen van de Mitochondrial Electron Transport Chain met Native Electrophoresis, In-gel Assays, en Electroelution

Leer hoe u twee-dimensionale semi-denaturerende agarose gelelektroforese gebruikt om de grootteheterogeniteit van amyloïde vezels te bevestigen. Deze methode onderzoekt of variaties inherent zijn aan de vezels of ontstaan tijdens elektroforese.

Gebruik van twee dimensionale semi-denatureren wasmiddel Agarose gelelektroforese te bevestigen grootte heterogeniteit van amyloïde of Amyloid-achtige vezels (Video) | JoVE Journal

Gebruik van twee dimensionale semi-denatureren wasmiddel Agarose gelelektroforese te bevestigen grootte heterogeniteit van amyloïde of Amyloid-achtige vezels

Meer video's verkennen