Gebruik van twee dimensionale semi-denatureren wasmiddel Agarose gelelektroforese te bevestigen grootte heterogeniteit van amyloïde of Amyloid-achtige vezels

Het algemene doel van deze tweedimensionale semi-denaturerende detergent agarose gel elektroforese is om de grootteheterogeniteit van amyloïde of amyloïde-achtige vezels te bevestigen die tijdens traditionele SDD-AGE worden gezien. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de amyloïde of eiwitaggregatievelden, zoals of de grootteheterogeniteit die tijdens traditionele SDD-AGE wordt gezien, de native toestand van de vezels in vivo is of het resultaat van eiwitdegradatie of dissociatie tijdens gelelektroforese. Het grote voordeel van deze techniek is dat deze gemakkelijk in het laboratorium kan worden uitgevoerd zonder gespecialiseerde apparatuur.

Er is geen extra apparatuur nodig buiten wat wordt gebruikt in traditionele SDD-AGE. Eerst zaai je de amyloïde producerende HT-29 colon kankercellen in een 10-centimeter weefselkweekschaal. Vervolgens incubeer je de cellen een nacht bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.

Zodra de cellen 80% confluency bereiken, gebruik je fosfaatgebufferde zoutoplossing om de cellen te wassen. Voeg vervolgens drie milliliter trypsine toe aan de cellen en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende drie minuten. Nadat de cellen zich hebben losgemaakt van de kweekschaal, voeg je 10 milliliter kweekmedium toe aan de plaat.

Breng vervolgens de celsuspensie over naar een 15-milliliter kegelbuis. Centrifugeer vervolgens de celsuspensie bij 1.000 keer g gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Na het centrifugeren aspireer je het medium en suspendeer je het celpellet opnieuw in vijf milliliter kweekmedium.

Tel de cellen met behulp van een celteller. Laat vervolgens twee kweekplaten een nacht bij 37 graden Celsius staan. Voeg vervolgens TSZ-reagentia toe aan een van de kweekschotels als behandeling.

Na ongeveer zes uur oogst je de cellen met behulp van een plastic schraper. Breng vervolgens de celsuspensie over in een 15-milliliter kegelbuis en centrifugeer bij 1.000 keer g gedurende drie minuten bij vier graden Celsius. Was vervolgens het celpellet twee keer met 10 milliliter ijskoud fosfaatgebufferde zoutoplossing en herhaal het centrifugatieproces.

Aspibeer vervolgens de PBS-oplossing en breng het celpellet over in een 1,5-milliliter microcentrifugebuis. Voeg 0,3 milliliter lysisbuffer toe aan het celpellet en incubeer op ijs gedurende 30 minuten. Centrifugeer vervolgens bij 20.000 keer g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius.

Het verkregen supernatant is het volledige cellysaat. Voeg aan het supernatant 4X SDD-AGE buffer toe om 20 microliter van drie microgram per microliter monster voor te bereiden. Incubeer het monster gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Om de gel voor te bereiden, voeg je twee gram agarosepoeder toe aan 200 milliliter TAE-buffer in een glazen beker. Verwarm vervolgens de beker in een magnetron om de agarose te smelten. Voeg vervolgens een milliliter 20%SDS toe tot een eindconcentratie van 0,1% Schud de beker voorzichtig.

Plaats vervolgens de vloeibare agarose op een 15-bij-14-centimeter gelplaat. Gebruik een enkele milliliterpipet om eventuele luchtbellen te verwijderen. Plaats vervolgens een 20-wels kam op de gel.

Voeg vervolgens ongeveer 60 microgram volledige cellysaat toe in de uiterste rechter baan van de gel. Laat de gel gedurende ongeveer vier uur draaien bij 60 volt met behulp van de TAE-buffer met 0,1%SDS als de loopbuffer. Om de gel in de tweede dimensie te laten lopen, draai je de gel voorzichtig 90 graden linksom.

Laat vervolgens de gel gedurende ongeveer vier uur draaien bij 60 volt. Voeg in een 20-bij-20-centimeter container 500 milliliter transferbuffer toe. Direct naast de container bereid je een stapel van vijf centimeter hoog papieren handdoeken voor.

Week vervolgens twee filterpapieren, elk met afmetingen van 14 bij 15 centimeter, in transferbuffer en plaats ze bovenop de stapel papieren handdoeken. Activeer een 14-bij-15-centimeter PVDF-membraan in methanol gedurende 30 seconden. Plaats na activering het membraan bovenop de filterpapieren en gebruik een roller om alle bubbels te verwijderen.

Het belangrijkste deel van de overdracht is ervoor zorgen dat er geen luchtbellen worden gevormd tussen de gel en het membraan. Spoel de gel met transferbuffer en leg hem op het membraan. Rol eventueel gevormde bubbels uit.

Gebruik vervolgens een plastic folie om de rand van de papieren handdoeken te bedekken die het dichtst bij de transferbuffercontainer ligt. Week vervolgens een stuk filterpapier met afmetingen van 15 bij 35 centimeter in de transferbuffer. Plaats het filterpapier zodat het ene uiteinde de bovenkant van de gel bedekt en het andere uiteinde in de transferbuffercontainer ligt.

Bedek de container met plastic folie en laat het een nacht bij kamertemperatuur staan. De volgende dag spoel je het membraan met 50 milliliter PBST in een 20-bij-20-centimeter container. Voeg vervolgens 20 milliliter 5%melk in PBST toe aan het membraan.

Laat vervolgens het membraan gedurende 30 minuten op kamertemperatuur op de rocker staan om te blokkeren. Pipet 10 microliter konijnenanti-MLKL antilichaam in 20 milliliter 5%melk in PBST. Voeg vervolgens het antilichaammenging toe aan het membraan.

Incubeer het membraan gedurende een nacht op de rocker bij vier graden Celsius. Was vervolgens het membraan met 20 milliliter PBST gedurende vijf minuten. Deze was wordt vijf keer herhaald.

Pipet vervolgens vier microliter anti-konijn-HRP-antilichaam in 20 milliliter 5%melk in PBST. Voeg het antilichaam toe aan het membraan. Laat de container met het membraan op de rocker staan bij kamertemperatuur gedurende twee uur.

Na twee uur was je het membraan vijf keer gedurende vijf minuten in 20 milliliter PBST. Voeg vervolgens verbeterd chemiluminescentie substraat toe aan het membraan. Blootstel vervolgens het me