Name: Gen-gerichte willekeurige mutagenese Heterochromatin-destabiliserende proteasoom mutanten in Fission gist selecteren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Leer gerichte willekeurige mutagenese voor heterochromatin-destabilisatie in splijtgist. Deze methode identificeert mutaties in essentiële genen zoals rpt4+ en onthult mechanismen van epigenetische regulatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financiering van de steun voor dit project werd verstrekt door de fundamentele wetenschap Research Program via de nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) gefinancierd door het ministerie van wetenschap en ICT (2016R1A2B2006354).

1. voorbereiding van de Media
<ol><li>Bereiden gistextract met supplementen (YES), ja zonder adenine (ja lage Ade), Pombe Glutamate medium (PMG12) en PMG zonder adenine (PMG-Ade) door het mengen van de componenten, zoals beschreven in tabel 1. Ja-Ade (lage Ade) en de PMG-Ade platen al dezelfde componenten, maar de adenine is weggelaten uit de laatste.<ol>
<li>Gebruik de volgende zout (50 x) voorraad: 52.5 g/L MgCl2·6H2O, 2 g/L CaCl2·2H2O, 50 g/L KCl, 2 g/L Na2dus4 in gedestilleerd water. Filter steriliseren met behulp van een filter van 0.22-µm porie-grootte en bewaren bij 4 ° C.</li>
		<li>Gebruik de volgende vitamine (1, 000 x) voorraad: 1 g/L pantothenaat, 10 g/L inositol, nicotinezuur 10 g/L en 10 mg/L Biotine in gedestilleerd water. Filter steriliseren met behulp van een filter van 0.22-µm porie-grootte en bewaren bij 4 ° C.</li>
		<li>Gebruik het volgende mineraal (10, 000 x) voorraad: 5 g/L boorzuur, 4 g/L MnSO4, 4 g/L ZnSO4·7H2O, 2 g/L FeCl2·4H2O, 0,4 g/L MoO3, 1 g/L KI, 0,4 g/L CuSO4·5H2O , 10 g/L citroenzuur in gedestilleerd water. Filter steriliseren met behulp van een filter van 0.22-µm porie-grootte en bewaren bij 4 ° C. Nota: Ja opgietvloeistof kan worden gemaakt door het weglaten van de agar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Autoclaaf het medium en het afkoelen tot onderstaande 60 ° C al roerend met een roer-bar, tegen het tarief van 200 rpm.</li>
	<li>Ja + G418 (geneticin) platen, voegt toe 1 mL/L G418-stockoplossing aan het ja-medium.<ol>
<li>Gebruik de volgende G418 (1, 000 x) voorraad: 100 mg/mL G418 in gedestilleerd water. Filter steriliseren met behulp van een 0.22-µm poriegrootte filter, aliquoot om 1,5 mL centrifuge buizen, en sla bij-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Roer voor een ander 5-10 min en aliquot de media in 90-mm petrischalen (1 L voor middellange aliquots tot ongeveer 40 petrischalen. Opslaan van de platen bij 4 ° C.</li>
</ol>2. klonen van rpt4 + en zijn 5' / 3' UTRs
<ol><li>Uitvoeren van PCR inleidingen p1 en p2 (figuur 1A) met behulp van kernsplijting gist genomic DNA (gDNA) als de sjabloon in een totaal volume van 50 µL (~ 1 µg DNA, 20 U enzym, 1 x reactie buffer), en toepassing van de cycli van de reactie beschreven in tabel 2 van het versterken van een 3,315-base paar (bp) fragment bestaande uit rpt4 + en zijn 5' / 3' UTRs. Het zuiveren van het PCR-product met behulp van een zuivering kit13 volgens de aanwijzingen van de fabrikant (figuur 1A).</li>
	<li>Verteren de pBlueScript KS(-) vector14 en de versterkte fragment van DNA met rpt4 + met zijn 5' / 3' UTRs met BamH1 en Xho1 in een totaal volume van 20 µL (~ 1 µg DNA, 20 U enzym, 1 x spijsvertering buffer) bij 37 ° C in een waterbad voor 16-18 h (figuur 1B).</li>
	<li>Gel zuiveren de verteerd vector (1,2% agarose gel) en DNA invoegen door uitvoeren van TAE gebaseerde agarose gelelektroforese (100 V, 1 h), middendoor van de DNA-bands van de gewenste maten en het DNA met een gel extractie kit15isoleren.</li>
	<li>Afbinden van de vector en DNA invoegen met behulp van T4 DNA ligase door het uitvoeren van een 20-µL afbinding reactie met 50-100 ng van de vector DNA, een ~ 3-voudig molaire overmaat van het DNA invoegen, 400 U T4 DNA ligase en 1 x afbinding buffer. Incubeer dit mengsel bij 18 ° C gedurende 16-18 h.</li>
	<li>De ligaturen DNA transformeren in 100 µL van E. coli DH5α door het toepassen van warmte schok voor 70 s bij 42 ° C. Voeg 1 mL LB en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C voor herstel. Uitvoeren van centrifugeren (13,800 x-g), negeren de supernatant, plaat alle de getransformeerde E. coli cellen op LB-ampicilline (LA) platen en Incubeer bij 37 ° C gedurende 16 uur.</li>
	<li>Kies 4-8 kolonies met tandenstokers en 's nachts groeien bij 37 ° C in 3 mL LA medium.</li>
	<li>De plasmiden isoleren met een plasmide zuivering kit16 gebruikt volgens protocol van de fabrikant en het uitvoeren van de spijsvertering van het beperkingsenzym analytische met 5 µL van het geïsoleerde plasmide, 5 U van elke restrictie-enzym (BamH1 en Xho1) en 1 x beperking buffer. Incubeer het reactiemengsel bij 37 ° C in een waterbad voor 3 h. bevestigen het klonen door kandidaat-plasmiden sequencing.</li>
</ol>3. invoering van de Stille Mutatie (Xho1 beperkingsplaats)
<ol><li>Het ontwerp van een paar 33-bp inleidingen (p3 en p4) die de gewenste mutatie in de anders bijkomende opeenvolging bevatten.</li>
	<li>Uitvoeren van PCR met hifi-polymerase17 (Figuur 1 c) in een totaal volume van 25 µL (10 ng van gekloonde plasmide, 2 µL van 10 pmol primer mix, 2 U enzym, 1 x reactie buffer) met de fietsen parameters vermeld in tabel 3.</li>
	<li>De sjabloon plasmide met Dpnik in een totaal volume van 20 µL (20 U enzym, 1 x spijsvertering buffer) bij 37 ° C in een water bad voor 1 h verteren.</li>
	<li>Transformeren, propageren, isoleren en het volgnummer van de plasmide met de Stille mutatie, zoals beschreven in stappen 2.5-2.7. Opmerking: De Stille mutatie kan ook worden ingevoerd via een klonen methode die het mogelijk maakt voor het verbinden van meerdere fragmenten van DNA in een enkele reactie18.</li>
</ol>4. de willekeurige mutagenese voor rpt4 + door foutgevoelige PCR
<ol><li>Vergissing-geneigd PCR, met behulp van de plasmide met de Stille Mutatie (Xho1 website) uit te voeren als de sjabloon, inleidingen p5 en p6, een totaal volume van 50 µL (de hoeveelheid sjabloon gedefinieerd in stap 4.1.1, 2 µL van 10 pmol primer mix, 2.5 U enzym, 1 x reactie buffer) , en een speciale polymerase die is ontworpen voor het genereren van een hoge fout tarief19 (Figuur 1 d). PCR uitvoeren zoals beschreven in tabel 2.<ol>
<li>4-5 µg sjabloon plasmide gebruiken om te controleren de mutatiefrequentie 1 bp/KB (kilobase). Opmerking: Een hoge concentratie (> 500 ng/µL) van de plasmide, die kan worden verkregen met behulp van een mini prep kit20, vereist is.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gebruik de gelelektroforese van het te bevestigen van een PCR-product van 2670 bp (1,2% agarose gel). Gel zuiveren deze PCR-product zoals beschreven in stap 2.5.</li>
</ol>5. bereiding van Fusion PCR fragmenten (KAN, 3' UTR)
<ol><li>Het uitvoeren van PCR met behulp van pFA6a-KANMX621 als de sjabloon, de inleidingen p7 en de p8, en de voorwaarden vermeld in tabel 4 te verkrijgen van het fragment marker (KAN). Gel zuiveren het resulterende 1.480-bp-fragment, zoals beschreven in stap 2.5 (figuur 1E).<ol>
<li>Controleer als de stop codon van het gen voor mutatie en de codering regio van de aangrenzende gen gericht worden gescheiden door meer dan 500 bp. De endogene terminator mag niet worden gebruikt wanneer deze regio minder dan 500 is bp; de ADH -terminator moet daarentegen worden gebruikt in plaats van de endogene terminator. De wijzigingen van de protocol vereist voor het gebruik van de ADH -terminator worden gepresenteerd in tabel 5. Opmerking: Deze wijzigingen zijn alleen van toepassing wanneer de ADH -terminator, die beschikbaar in het plasmide pFA6a-3 ha-KANMX6 is, wordt gebruikt in plaats van de endogene terminator.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR uitvoeren met de gekloonde rpt4 +-met vector als sjabloon en inleidingen p9 en p10 in een totaal volume van 50 µL (20 ng van de gekloonde plasmide, 2 µL van 10 pmol primer mix, 2 U enzym, 1 x reactie buffer), met behulp van de voorwaarden gepresenteerd in tabel 6. Gel zuiveren het verkregen 506-bp 3'-UTR fragment (figuur 1E).</li>
</ol>6. generatie van de constructie van de transformatie door fusie PCR (figuur 1E)
<ol><li>De 3 fragmenten (mutagenized rpt4 +KAN en de 3' UTR) op 50 ng/µL voor te bereiden.</li>
	<li>Uitvoeren van fusion die PCR van de drie met behulp van primers p11 en p12, fragmenten zoals beschreven in tabel 7. (Het protocol voor fusion PCR is een wijziging van het oorspronkelijke protocol22.) Het zuiveren van het grote 4,398-bp PCR product.<ol>
<li>Gebruik rpt4 +: KAN:3'UTR fragmenten in een verhouding van 1:3:1 voor optimale resultaten. Opmerking: Het totale bedrag van het DNA invoegen mag niet hoger zijn dan 500 ng. De aanbevolen hoeveelheid rpt4 +: KAN:3'UTR is 50 ng:150 ng:50 ng. De mutagenized regio is ongeveer 1,6 kb, zodat het minimumaantal gist kolonies, dat zou goed zijn voor alle mogelijke combinaties van elke basis wordt gemuteerd tot de andere drie 1.600 x 3 = 4800 kolonies. Omdat een reactie van de transformatie levert meestal 400-500 kolonies, ten minste 10 Reacties waard van fusion PCR bouwen nodig is. Deze behoefte kan worden voldaan doordat gewoon de reactie bedrag (dat wil zeggen, het aantal PCR buisjes) met een factor tien.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. transformatie van kernsplijting gist door Electroporation (figuur 1F)
<ol><li>Inoculeer gist tot 10 mL van Ja middellange tot verzadiging door het voor meer dan 16 h aan het broeden.</li>
	<li>Verdun de cellen tot een optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van 0.2 in 200 mL ja voedingsbodem en Incubeer bij 30 ° C met schudden voor 5-6 h, OD600 = 0,6 - 0,8.</li>
	<li>Concentreren cellen OD600 = 30, afzien vier 50 mL conische buizen en chill op het ijs gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Oogsten van de cellen door het uitvoeren van centrifugeren bij 1.050 x g gedurende 3 minuten bij 4 ° C. Plaats de buizen en 10 electro-cuvettes op ijs. Voer de stappen uit 7.3-7,8 op ijs.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en voeg toe 15 mL 1,2 M sorbitol. Voorzichtig schudden de buizen om resuspendeer de cellen.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen bij 1050 x g gedurende 3 min bij 4 ° C.</li>
	<li>Herhaal stap 7.4 en 7.5. Verwijder het supernatant. 500 µL van 1,2 M sorbitol toevoegen aan elke buis en resuspendeer de cellen verzamelen van alle cellen in een 15-ml conische buis.</li>
	<li>Toevoegen van 1,2 M sorbitol tot 2,4 mL (OD600 = 10 per 0,2 mL). Houd de buis op ijs.</li>
	<li>Voeg 200 µL van sorbitol-geschorst cellen (zorg ervoor dat ze volledig zijn geschorst) een EP-buis met de fusion PCR construeren, meng goed en overbrengen van het monster naar een electro-cuvette.</li>
	<li>Electroporate de cellen met de volgende opties: schimmels, ShS (2.00kV, 1 puls).</li>
	<li>600 µL van 1,2 M sorbitol toevoegen aan elke electro-cuvette voor een totaal volume van 800 µL, en verspreidde zich vervolgens de cellen op vier ja platen (200 µL/plaat). Tien electro-cuvettes zal afzien tot 40 Ja platen.</li>
	<li>Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 24 uur.</li>
	<li>Het uitvoeren van replica beplating aan ja + G418 en Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 3 dagen.</li>
</ol>8. selectie van de Heterochromatin-destabiliserende mutanten en zoeken naar valse positieven
<ol><li>Voor elke ja + G418 plaat, verrichten replica beplating aan ja-Ade (lage Ade) en de PMG-Ade (No Ade) platen. Incubeer de platen van de replica voor 1-2 dagen bij 30 ° C, tot enkele van de kolonies op de ja-Ade platen een rode verkleuring (figuur 1G tonen).</li>
	<li>Ja-Ade en PMG-Ade platen en selecteer de cellen die Toon roze of wit op de ja-Ade-plaat en groeien ook op de plaat PMG-Ade vergelijken. Selecteer kolonies zonder groei op PMG-Ade, niet zoals ze valse positieven (bijvoorbeeld als gevolg van zijn dat de cassette KAN is geïntegreerd op de site van een doelsoort elders in het genoom).</li>
	<li>Ongeveer 1 x 105 cellen kiezen uit elke kolonie en incubeer in 10 µL van SPZ oplossing bevattende 2,5 mg/mL zymolyase 100 T bij 37 ° C gedurende ten minste 30 min. gebruik 1 µL van deze oplossing uit te voeren als de startende sjabloon voor PCR (Figuur 1 H) van de kolonie.<ol>
<li>SPZ (50 mL) maken door het mengen van 30 mL 2 M sorbitol, 4.05 mL 1 M Na2HPO4, 0,95 mL NaH2PO4 en 15 mL gedestilleerd water (laatste pH, 7.5). Monsters (5 mL) kunnen worden aangevuld met zymolyase en opgeslagen in 500-µL aliquots bij-20 ° C tot gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uitvoeren van elektroforese van het gel (1,2% agarose gel, 180V, 20 min) om te visualiseren van de resultaten van + de PCR van de kolonie. Selecteer reacties die vertonen PCR bands van de juiste afmetingen en verteren 5 µL van elk reactieproduct met XhoI (4 U enzym, 1 x spijsvertering buffer, waterbad 37 ° C, 1 h) op het scherm uit valse positieven (Figuur 1 H).</li>
	<li>Voer de Elektroforese van het gel om te visualiseren van de XhoI -digests (1,2% Agarose gel, 180 V, 20 min). Mark de kolonies waarvan PCR producten worden gesneden door XhoI, en hen een patch aan ja + G418 platen (figuur 1I).</li>
	<li>GDNA uit de kernsplijting gistcellen isoleren en sequencing van het PCR producten23uit te voeren. Vergelijk de verkregen opeenvolging met de volgorde van de wild-type te identificeren van mutaties (figuur 1I).</li>
	<li>Direct opnieuw in te voeren de mutation(s) aan wild-type cellen door hen met fusion constructies versterkt door PCR van mutantcellen23om te zetten. Kunt spotten bevestigen het fenotype in de nieuw gemaakte mutantcellen (figuur 1J).<ol>
<li>Fusion transformatie construct kan gemakkelijk worden versterkt door PCR inleidingen p1 en p10 gebruik de genomic DNA van mutanten als de sjabloon in een totaal volume van 50 µL (~ 1 µg DNA, 20 U enzym, 1 x reactie buffer), en de toepassing van de cycli van de reactie beschreven in tabel 2 . Transformatie van de constructie kan worden gedaan door het volgen van de stappen 7.1-7.13.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Pritchard, L., Corne, D., Kell, D., Rowland, J., Winson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+model+of+error-prone+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">A general model of error-prone PCR.</a> J Theor Biol. 234 (4), 497-509 (2005).</li>
<li>Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+induced+by+ultraviolet+light%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Mutations induced by ultraviolet light.</a> Mutat Res. 571 (1-2), 19-31 (2005).</li>
<li>Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetic+analysis+of+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods Enzymol. 194, 795-823 (1991).</li>
<li>Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+evolution+of+novel+traits+in+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid evolution of novel traits in microorganisms.</a> Appl Environ Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).</li>
<li>Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+DNA+shuffling+works%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">How DNA shuffling works.</a> Science. 293 (5528), 237(2001).</li>
<li>Sahu, P. P., Sharma, N., Puranik, S., Chakraborty, S., Prasad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+26S+Proteasome+subunit+RPT4a+regulates+ToLCNDV+transcription+and+activates+hypersensitive+response+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Tomato 26S Proteasome subunit RPT4a regulates ToLCNDV transcription and activates hypersensitive response in tomato.</a> Sci Rep. 6, 27078(2016).</li>
<li>Xu, Q., Singer, R. A., Johnston, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sug1+modulates+yeast+transcription+activation+by+Cdc68%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sug1 modulates yeast transcription activation by Cdc68.</a> Mol Cell Biol. 15 (11), 6025-6035 (1995).</li>
<li>Bhat, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+19S+proteasome+ATPase+Sug1+plays+a+critical+role+in+regulating+MHC+class+II+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription.</a> Mol Immunol. 45 (8), 2214-2224 (2008).</li>
<li>Chang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Gal4+activation+domain+binds+Sug2+protein%2C+a+proteasome+component%2C+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Gal4 activation domain binds Sug2 protein, a proteasome component, in vivo and in vitro.</a> J Biol Chem. 276 (33), 30956-30963 (2001).</li>
<li>Ekwall, K., Cranston, G., Allshire, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fission+yeast+mutants+that+alleviate+transcriptional+silencing+in+centromeric+flanking+repeats+and+disrupt+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Fission yeast mutants that alleviate transcriptional silencing in centromeric flanking repeats and disrupt chromosome segregation.</a> Genetics. 153 (3), 1153-1169 (1999).</li>
<li>Grewal, S. I., Jia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin revisited.</a> Nat Rev Genet. 8 (1), 35-46 (2007).</li>
<li>Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aForsburg%2C+SL+%22Forsburg+Lab+Recipes%3A+Fission+Yeast+Media%22">Forsburg Lab Recipes: Fission Yeast Media</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/media.html">http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/media.html</a> (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22QIAquick+PCR+Purification+Kit%22">QIAquick PCR Purification Kit</a>. , Qiagem. Venlo, Netherlands. Available from
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-pcr-purification-kit/#orderinginformation">https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-pcr-purification-kit/#orderinginformation</a> (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22pBlueScript+II+Vector%22">pBlueScript II Vector</a>. , Aglint. Santa Clara, CA. Available from
 <a target="_blank" href="http://www.genomics.agilent.com/en/Cloning-Vectors/pBlueScript-II-Vectors/?cid=AG-PT-115&">http://www.genomics.agilent.com/en/Cloning-Vectors/pBlueScript-II-Vectors/?cid=AG-PT-115&</a> (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22QIAquick+Gel+Extraction+Kit%22">QIAquick Gel Extraction Kit</a>. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-gel-extraction-kit/#orderinginformation">https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-gel-extraction-kit/#orderinginformation</a> (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22QuickGene+SP+Kit+Plasmid+Kit+II+%28SP-PL2%29%22">QuickGene SP Kit Plasmid Kit II (SP-PL2)</a>. , Wako Chemicals GmbH. Fuggerstraße 12 41468 Neuss, Germany. Available from
 <a target="_blank" href="https://www.wako-chemicals.de/en/product/quickgene-sp-kit-plasmid-kit-ii-sp-pl2">https://www.wako-chemicals.de/en/product/quickgene-sp-kit-plasmid-kit-ii-sp-pl2</a> (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22PfuUltra+High-fidelity+DNA+Polymerase%22">PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase</a>. , Aglient. Santa Clara, CA. Available from
 <a target="_blank" href="http://www.genomics.agilent.com/en/High-Fidelity-PCR-Enzymes/PfuUltra-II-Fusion-HS-DNA-Polymerase/?cid=AG-PT-136">http://www.genomics.agilent.com/en/High-Fidelity-PCR-Enzymes/PfuUltra-II-Fusion-HS-DNA-Polymerase/?cid=AG-PT-136</a> (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Gibson+Assembly+Master+Mix%22">Gibson Assembly Master Mix</a>. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/products/e2611-gibson-assembly-master-mix#Product%20Information">https://www.neb.com/products/e2611-gibson-assembly-master-mix#Product%20Information</a> (2017).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22GeneMorph+II+Random+Mutagenesis+Kits%22">GeneMorph II Random Mutagenesis Kits</a>. , Agilent. Santa Clara, CA. Available from
 <a target="_blank" href="http://www.genomics.agilent.com/en/Random-Mutagenesis/GeneMorph-II/?cid=AG-PT-171&tabId=AG-PR-1057">http://www.genomics.agilent.com/en/Random-Mutagenesis/GeneMorph-II/?cid=AG-PT-171&tabId=AG-PR-1057</a> (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Plasmid+Plus+Midi+Kit%22">Plasmid Plus Midi Kit</a>. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from
 <a target="_blank" href="http://www.biocompare.com/9956-Assay-Kit/4640391-QIAGEN-Plasmid-Plus-Midi-Kit-25/">http://www.biocompare.com/9956-Assay-Kit/4640391-QIAGEN-Plasmid-Plus-Midi-Kit-25/</a> (1999).</li>
<li>Bahler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+modules+for+efficient+and+versatile+PCR-based+gene+targeting+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe.</a> Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).</li>
<li>Szewczyk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+PCR+and+gene+targeting+in+Aspergillus+nidulans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fusion PCR and gene targeting in Aspergillus nidulans.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3111-3120 (2006).</li>
<li>Nurse, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNurse%2C+P+%22Fission+Yeast+Handbook%22">Fission Yeast Handbook</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://wolflab.squarespace.com/s/Fission-Yeast-Handbook-Nurse-Lab.docx">https://wolflab.squarespace.com/s/Fission-Yeast-Handbook-Nurse-Lab.docx</a> (2000).</li>
<li>Seo, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+19S+proteasome+is+directly+involved+in+the+regulation+of+heterochromatin+spreading+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The 19S proteasome is directly involved in the regulation of heterochromatin spreading in fission yeast.</a> J Biol Chem. , (2017).</li>
<li>Tang, N. H., et al. <a target="_blank" href="https://peerj.com/preprints/3377/">Generation and characterisation of temperature sensitive mutants of genes encoding the fission yeast spindle pole body.</a> PeerJ Preprints. 5, e3377v3371(2017).</li>
<li>Rasooly, A., Weisz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+antibacterial+activities+of+phloxine+B+and+other+halogenated+fluoresceins+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro antibacterial activities of phloxine B and other halogenated fluoresceins against methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (11), 3650-3653 (2002).</li>
<li>Wilson, D. S., Keefe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+mutagenesis+by+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Random mutagenesis by PCR.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 8. Unit 8 (2001).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Willekeurige mutagenese via foutgevoelige PCR is een krachtig hulpmiddel voor het genereren van een diverse pool van mutanten in een bepaalde regio. Deze techniek is vooral handig voor studies die willen beoordelen van de functie van een eiwit onder een specifieke omstandigheden. Bijvoorbeeld, gebruikt wij hierin foutgevoelige PCR ter beoordeling van de functie van de 19S proteasoom subeenheid, Rpt4, in heterochromatin onderhoud. Door het variëren van de regio gericht door de foutgevoelige PCR en aanpassing van de voorwa...

Voorwaartse genetica is een klassieke methode waarin onderzoekers zoeken natuurlijk voorkomende mutanten die weer een bepaalde fenotype en genetische analyses uitvoeren. In omgekeerde genetica, mutaties worden ingevoerd in een gen van belang en het fenotype is onderzocht. In het laatste geval, wordt willekeurige mutagenese van een target-gen vaak gebruikt voor het genereren van een pool van mutanten die vervolgens voor de gewenste fenotypen, zoals temperatuur gevoeligheid zijn geselecteerd of gewijzigd enzymatische activiteit. Verschillende methoden kunnen worden gebruikt om willekeurige mutagenese, met inbegrip van foutgevoelige PCR1; UV bestraling2; chemische mutagenen, zoals ethyl methanesulfonate (EMS) of waterstofnitriet3; het gebruik van tijdelijke mutator stammen, zoals die over het uitdrukken van mutD5 4; en DNA schuifelen5.
Hier beschrijven we een omgekeerde-genetica strategie waarin we gebruik maken van foutgevoelige PCR voor het genereren van mutant zwembaden voor een doel-gen in de kernsplijting gist. Zoals men wel kan van de naam raden, genereert deze methode mutaties doordat opzettelijk fouten tijdens PCR. In tegenstelling tot andere methoden mutagenese kan foutgevoelige PCR de gebruiker te definiëren van de regio te worden mutagenized. Dit maakt het handig bij inspanningen om te bestuderen van de functie van een eiwit/domein van belang.
Om aan te tonen deze procedure willekeurige mutagenese, wij hierin rpt4 +, die de 19S proteasoom subeenheid codeert, als voorbeeld gebruiken. Rpt4 heeft aangetoond dat proteolyse-zelfstandige functies in organismen met uitzondering van kernsplijting gist6,7,8,9, en een defect in proteolyse indirecte effecten kan veroorzaken door een wijziging van de eiwitten niveaus. Wij, daarom gescreend voor mutanten die geactiveerd proteolyse-onafhankelijke veranderingen, met het doel van het onderzoek naar de functie van het proteasoom op heterochromatin.
Vergissing-geneigd PCR kan worden toegepast op elk gen-gebied door het afstemmen van de locatie waarop de primers binden. Mutanten die de gewenste fenotypische verandering vertonen kunnen worden geïdentificeerd met passende verslaggevers. Hier, we gebruikt een ade6 + verslaggever ingevoegd op de centromeer 1 buitenste herhaling (otr) regio10. Constitutieve heterochromatin wordt gevormd om deze regio11, zodat de ade6 + -verslaggever is het zwijgen opgelegd in de voorwaarde van de wild-type; Dit wordt aangegeven door rode kolonies10. Een mutatie die de constitutieve heterochromatin op de centromeer destabiliseert zal leiden tot de uitdrukking van de ade6 + verslaggever, die als witte kolonies is gevisualiseerd.

<table><tbody><tr><td>1. Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-10KG</td><td></td></tr><tr><td>Gist extract</td><td>BD Biosciences</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>JUNSEI</td><td>87070-0310</td><td></td></tr><tr><td>Adenine sulfate</td><td>ACR</td><td>16363-0250</td><td></td></tr><tr><td>Uracil&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8125</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05108.0050</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>JUNSEI</td><td>19015-0350</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull;7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63140</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12095</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phthalate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6758-500g</td><td></td></tr><tr><td>Inositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7508-50G</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7634-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4&bull;7H2O&nbsp;</td><td>JUNSEI</td><td>83060-031</td><td></td></tr><tr><td>FeCl2&bull;4H2O</td><td>KANTO</td><td>CB8943686</td><td></td></tr><tr><td>Sodium molybdate dihydrate</td><td>YAKURI</td><td>31621</td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td>JUNSEI</td><td>80090-0301</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4&bull;5H2O</td><td>YAKURI</td><td>09605</td><td></td></tr><tr><td>D-myo-inositol</td><td>MP biomedicals</td><td>102052</td><td></td></tr><tr><td>Pantothenate</td><td>YAKURI</td><td>26003</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4126-500G</td><td></td></tr><tr><td>(NH4)2SO4&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418-100G</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biobasic</td><td>D0012</td><td></td></tr><tr><td>G418, geneticin</td><td>LPS</td><td>G41805</td><td></td></tr><tr><td>2. Enzymreacties</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase</td><td>Aglient</td><td>600380</td><td>Voor gerichte mutagenese</td></tr><tr><td>GeneMorphII Random mutagenese Kit</td><td>Aglient</td><td>200500</td><td>Voor foutgevoelige PCR</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>Thermo Fisher</td><td>F-530L</td><td>Voor fusie-PCR</td></tr><tr><td>Ex Taq&nbsp;DNA Polymerase</td><td>Takara</td><td>RR001b</td><td>Voor algemene PCR</td></tr><tr><td>BamH1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>Xho1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Dpn1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>3. Uitrusting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Velveteen vierkant, zwart</td><td>VWR</td><td>89033-116</td><td>Voor replica</td></tr><tr><td>Replica-plating tool</td><td>VWR</td><td>25395-380</td><td>Voor replica</td></tr><tr><td>MicroPulser Electroporator</td><td>Biorad</td><td>1652100&nbsp;</td><td>Voor transformatie van fissiegist</td></tr><tr><td>Electroporation Cuvettes, 0,2 cm opening</td><td>Biorad</td><td>1652086&nbsp;</td><td>Voor transformatie van fissiegist</td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>Bioer</td><td>BYQ6078</td><td>Voor fusie-PCR ramp-reactie&nbsp;</td></tr></tbody></table>

gen-gerichte willekeurige mutagenese heterochromatin-destabiliserende proteasoom mutanten in fission gist selecteren

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Willekeurige mutagenese van een target-gen wordt vaak gebruikt om te identificeren van mutaties die opbrengst van het gewenste fenotype. Van de methoden die kunnen worden gebruikt om willekeurige mutagenese, foutgevoelige PCR is een handige en efficiënte strategie voor het genereren van een diverse pool van mutanten (dwz., een mutant bibliotheek). Vergissing-geneigd PCR is de methode van keuze wanneer een onderzoeker wil muteren van een vooraf gedefinieerde regio, zoals de codering regio van een gen terwijl andere genomic regio's onaangetast. Nadat de mutant bibliotheek wordt versterkt door foutgevoelige PCR, moet het worden gekloond in een geschikte plasmide. De grootte van de bibliotheek gegenereerd door foutgevoelige PCR wordt beperkt door de efficiëntie van de klonen stap. Echter in de kernsplijting gist, Schizosaccharomyces pombe, kan de klonen stap worden vervangen door het gebruik van een zeer efficiënte one-step fusie PCR voor het genereren van constructies voor transformatie. Mutanten van gewenste fenotypen kunnen vervolgens worden geselecteerd met behulp van passende verslaggevers. Hier beschrijven we deze strategie in detail, nemen als voorbeeld, een verslaggever aan centromeric heterochromatin ingevoegd.

De verworven mutanten van het Rpt4 door het volgen van de procedures die worden beschreven in afbeelding 1 kunnen door de beoordeling van de kleuren van de kolonies worden geanalyseerd. De kleuren van de kolonies zijn bevlekt op de relevante platen in het verminderen van het aantal cellen in Figuur 2. De ade6 + verslaggever ingevoegd op de heterochromatin regio in wild-type het zwijgen is opgelegd en toont rode kolonies ...

Dit artikel beschrijft een gedetailleerde methodologie voor willekeurige mutagenese van een target-gen in kernsplijting gist. Als voorbeeld, wij de doelstelling van rpt4 +, die codeert een subeenheid van de 19S proteasoom, en het scherm voor mutaties die heterochromatin te destabiliseren.

Gen-gerichte willekeurige mutagenese Heterochromatin-destabiliserende proteasoom mutanten in Fission gist selecteren

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Het algemene doel van deze willekeurige mutagenese is om te screenen op mutaties die heterochromatine destabiliseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van heterochromatine, zoals factoren die de vorming en het onderhoud van heterochromatine reguleren. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een specifiek gewenst gen kan targeten voor mutagenese, zelfs als het gen essentieel is.Om te beginnen, bereidt u gistextract met supplementen, of YES, zonder adenine, Pombe Glutamaat Medium, of PMG, en PMG zonder adenine, door de componenten te mengen zoals weergegeven in deze tabel. Na het autoclaveren en indien nodig G418 toe te voegen, roert u het medium nog eens vijf tot tien minuten. Verdeel vervolgens het medium in 90 milliliter Petri-schalen en bewaar de platen bij vier graden Celsius.Gebruik de gekloonde rpt4 positief, met zijn vijf prime en drie prime UTR's en stille mutatie, evenals primers p5 en p6 en een speciale polymerase, ontworpen om een hoge foutpercentage te genereren, om een foutgevoelige PCR uit te voeren in een totaal volume van 50 microliter. Na het genereren van een transformatie-fusieconstructie, volgens het tekstp

gene-targeted-random-mutagenesis-to-select-heterochromatin

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Hier laten we zien een eenvoudig protocol om een ​​willekeurige mutant bibliotheek te creëren voor een bepaalde doelsequentie. We laten zien hoe deze methode, die in vivo uitgevoerd in Escherichia coli, kan worden gecombineerd met functionele selecties van nieuwe enzymatische activiteiten evolueren.

Mutagenese en functionele selectie Protocollen voor Gerichte ontwikkeling van eiwitten in E. coli</em

Hier presenteren we een kosteneffectieve methode voor het definiëren van chemisch-genetische interacties in knopgistende gist. De benadering is gebaseerd op fundamentele technieken in moleculaire biologie van gist en is zeer geschikt voor het mechanistische onderzoek van kleine tot middelgrote collecties chemicaliën en andere media-omgevingen.

Snelle identificatie van chemische Genetische Interacties in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

We presenteren een gedetailleerd protocol om mutantenbibliotheken te construeren en te screenen voor gerichte evolutiecampagnes in Saccharomyces cerevisiae.

Geregisseerd Evolution Method in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Bibliotheek Creatie en Screening

We presenteren een protocol voor de functionele beoordeling van de uitgebreide single-site verzadigingsmutagenese bibliotheken van eiwitten met behulp van high-throughput sequencing. Belangrijk is dat deze aanpak maakt gebruik van orthogonale primer paren bibliotheek bouw en sequencing multiplexen. Representatieve resultaten met behulp van TEM-1 β-lactamase gekozen klinisch relevante dosering van ampicilline wordt verschaft.

Een protocol voor Functionele Evaluatie van Whole-Protein verzadigingsmutagenese Bibliotheken Met behulp van High-throughput sequencing

Genetisch gecodeerde histon-miniSOG induceert genoom-brede erfelijke mutaties in een blauw licht-afhankelijke manier. Dit mutagenese methode is eenvoudig, snel, vrij van giftige chemicaliën, en zeer geschikt voor forward genetische screening en transgene integratie.

Optogenetische willekeurige mutagenese met behulp van histon-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Een strategie voor het genereren van mutaties in histongenen op hun endogene locatie in Saccharomyces cerevisiae wordt gepresenteerd.

gerichte<em&gt; In Situ</em&gt; Mutagenese van histon genen in gist

Hier presenteren we een methode om het genoom van C. elegans ingenieur met behulp van CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins en homologie afhankelijke reparatie sjablonen.

Een snelle en Facile pijpleiding voor het genereren van Genomic punt mutanten in C. elegans met behulp van CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Dit artikel presenteert een paring gebaseerde methode om overexpressie screening in ontluikende gist met behulp van een gekleed plasmide-bibliotheek.

Paring gebaseerde overexpressie bibliotheek Screening in het gist

Wij presenteren een eenvoudige suppressor scherm protocol in kernsplijting gist. Deze methode is efficiënt, mutageen-vrije en selectieve voor mutaties die vaak bij een enkele genomic locus voorkomen.  Het protocol is geschikt voor het isoleren van suppressors die verlichten van gebreken van de groei in vloeibare cultuur die worden veroorzaakt door een mutatie of een drug.

Een Deep-sequencing-bijgewoonde, spontane Suppressor scherm in de kernsplijting gist Schizosaccharomyces pombe

Temperatuurgevoelige (ts) letale mutanten zijn waardevolle hulpmiddelen om essentiële functies te identificeren en te analyseren. Hier beschrijven we methoden om ts letale mutanten op grote schaal te genereren en te classificeren.

High-throughput Robotisch Assisted Isolatie van temperatuurgevoelige Lethal Mutants in<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Leer gerichte willekeurige mutagenese voor heterochromatin-destabilisatie in splijtgist. Deze methode identificeert mutaties in essentiële genen zoals rpt4+ en onthult mechanismen van epigenetische regulatie.

Gen-gerichte willekeurige mutagenese Heterochromatin-destabiliserende proteasoom mutanten in Fission gist selecteren

Meer video's verkennen