Name: Een alternatieve benadering te bestuderen van primaire gebeurtenissen in neurodegeneratie Ex Vivo Rat hersenen segmenten gebruiken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Leer een ex-vivo hersentechniek om neurodegeneratieve processen te bestuderen met gepaarde hemislices van rattenhersenen. Deze methode maakt directe vergelijking van behandelde en onbehandelde condities mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door Neuro-Bio Ltd. Wij wil Dr. Giovanni Ferrati en Dr. Sergio Rotondo (Neuro-Bio) bedanken voor hun opmerkingen en advies over het manuscript.

Alle dierproeven zijn uitgevoerd onder goedgekeurde protocollen.
Opmerking: In deze sectie, de volgorde van de belangrijkste fasen uitgevoerd tijdens de experimentele procedure en de voorgestelde tijdsinterval wordt verstrekt (Figuur 1). Een stapsgewijze beschrijving van het protocol wordt bovendien aangevuld met een illustratieve paneel, tonen van kritische acties variërend van verwijdering van de hersenen tot weefsel homogenisering na de incubatieperiode (Figuur 2). De details over de materialen en de instructies te bouwen de apparatuur en de daaropvolgende fase voor de WB-analyse zijn eerder beschreven22.
1. chirurgische instrumenten, Vibratome instellingen en voorbereiding van de behandeling
Opmerking: Voer de volgende stappen uit voordat u begint van de experimentele procedure:
<ol><li>Bereiden van twee verschillende kunstmatige cerebrospinaal vocht (aCSFs), gebruikt voor het snijden van de hersenen en de andere voor de incubatie stap29zoals hiervoor is beschreven. Kortom, de concentraties van de werken (in mmol) van de twee aCSFs zijn voor de "snijden" aCSF: 120 NaCl, 5 KCl, 20 NaHCO3, 2.4 CaCl2, 2 MgSO4, 1.2 KH2PO4en 10 glucose; 6.7 HEPES zout en 3.3 HEPES zuur; pH: 7.1. Wijl voor de "opname" aCSF: 124 NaCl, 3.7 KCl, 26 NaHCO3, 2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 1.3 KH2PO4en 10 glucose; pH: 7.1.</li>
	<li>Meng goed de oplossingen op ijs gezet en het snijden aCSF zuurstof om het koude tijdens het verwijderen van de hersenen en de daaropvolgende segmenteren. Houd bij kamertemperatuur (RT) en levering zuurstof naar de aCSF van de opname.</li>
	<li>Plaats de instrumenten onder de motorkap van de dissectie voor de verwijdering van onthoofding en hersenen, d.w.z.guillotine, chirurgische dissectie kit (schaar, pincet, messen) en spatel.</li>
	<li>De vibratome parameters instellen door de dikte van het segment (300 µm in deze voorbereiding) en de frequentie op 7 en de snelheid 6 te selecteren. Plaats de vibratome kamer in een passende ruimte en eromheen met ijs.</li>
	<li>Open de klep van de carbogen (95% O2, 5% CO2) om de "snijden" (aCSF) tijdens de segmentering van de hersenen zuurstof. Selecteer het minimale debiet, rond 2 mL/min.</li>
	<li>Neem twee 15-mL buizen ter voorbereiding van de voorwaarden om te testen. Voeg in één buis 10 mL van de "opname" aCSF alleen (controlegroep) en in de andere 10 mL van de "opname" aCSF verrijkt met T30 bij een concentratie van 2 µM (behandelde groep). Vortex zowel buizen en houd ze op het ijs tot het gebruik ervan in de voorbereidingsfase van de installatie (sectie 3).</li>
</ol>2. anesthesie, hersenen extractie en snijden
Opmerking: In deze studie, 9 wild type P14 mannelijke Wistar ratten werden gebruikt. Hersenen extractie en de daaropvolgende snijden vormen een cruciaal onderdeel van het protocol, aangezien ze snel (binnen 10 min) moeten worden uitgevoerd om te voorkomen of op zijn minst vertragen weefsel degeneratie processen.
<ol><li>Voeg 1,5 mL 100% w/w van Isofluraan op een laag van katoen in de bedwelmingsruimte inductie, plaats het dier binnen en sluit het deksel. Wacht totdat het dier is diep verdoofd, bevestiging van de afwezigheid van de pedaal reflex, en vervolgens het onthoofden van het dier met behulp van de guillotine.</li>
	<li>Houd het hoofd van het dier in een pot met ijskoude aCSF snijden tijdens de hersenen verwijdering stap (figuur 2A -C).</li>
	<li>Incise van de huid over de schedel met een chirurgisch mes, dan snijd de schedel met behulp van schaar na de middellijn, vanaf de achterste gedeelte en anteriorly overgaan tot het bereiken van het bot boven de OBs (figuur 2A).</li>
	<li>Trek lateraal de twee zijkanten van de schedel met behulp van een paar pincet om toegang te krijgen naar de hersenen (figuur 2B). Invoegen van een spatel ventrally naar de hersenen, schep voorzichtig het uit, en houd die het gehydrateerd in ijskoude "snijden" aCSF voor ongeveer 5 min (figuur 2C).</li>
	<li>Vervreemden van de hersenen op filterpapier en knip het cerebellum met behulp van een mes (figuur 2D). Lijm de hersenen verticaal op de schijf van vibratome en plaatst u deze in de vectorafbeeldingsbestanden kamer, vul hem met ijskoud "snijden" aCSF en leveren van zuurstof (figuur 2E).</li>
	<li>Het interval voor snijden aanpassen, en ga verder met de hersenen segmenteren (figuur 2F). Het verzamelen van de secties met de regio van belang, zoals het mediale septum (MS), diagonale band van Broca (DBB) en substantia innominata (SI), als eerder beschreven22. Van boven naar beneden bevatten de drie segmenten de rostraal (R), intermediate (I) en caudal (C) gedeelte van de BF (Figuur 2 g).</li>
	<li>Verdelen langs de middellijn van elke sectie met een kleine schaar, verkrijgen van twee spiegelende hemislices (Figuur 2 H), individueel gebruikt als de controle en de behandelde aandoening op hetzelfde anatomische vlak.</li>
	<li>Houden de hemisections in de zaal van de vibratome voor 5-10 minuten, waarna ze met een glazen pipet vervolgens overbrengen naar een borrelende pot met opname aCSF. Houd op RT gedurende ongeveer 30 minuten om te herstellen.</li>
	<li>Vul, in de tussentijd, drie glazen flesjes met 3 mL opname aCSF alleen (eerder bereid in stap 1.6 voor de controlegroep) en drie flesjes met 3 mL aCSF verrijkt met T30 (eerder bereid in stap 1.6) voor de behandelde groep.</li>
</ol>3. setup voorbereiding
<ol><li>Breng de hemisections in hun bijbehorende glazen flesjes (figuur 2I) om drie opeenvolgende hemislices (met inbegrip van de rostraal, intermediate en caudal BF-regio) voor de controlegroep (groene frame, figuur 2J) en hun bijpassende tegenhangers voor de behandelde groep (onderstel rood, figuur 2J).</li>
	<li>Overdracht van het hersenweefsel met twee verschillende penselen, één voor de hemislices van de controle en een andere voor de behandelde tegenhangers, om te voorkomen dat elke besmetting tussen voorwaarden.</li>
	<li>Zegel van elke glazen ampul met de bijbehorende deksel, presentatie van de zuurstofverrijkende naald (21G) (figuur 2J). De belangrijkste buis van het apparaat verbinden met de bron van de carbogen (Figuur 2 K). Zuurstof aan de hemislices gedurende de incubatieperiode met een minimale stroomsnelheid van 2 mL/min leveren om te voorkomen dat elke beweging van het hersenweefsel en de mogelijke mechanische schade tijdens het experiment. Start de incubatie 5 h. Het uitvoeren van de stappen 3.1-3.3 binnen 5 min. Opmerking: Check regelmatig (elke 15-20 min) of de zuurstof wordt geleverd in alle de flesjes en dat de stroom niet het weefsel is beweging van beneden.</li>
</ol>4. monster homogenisering
<ol><li>De zuurstof stroom stoppen na de incubatie en verwijder alle de deksels van de flesjes. Overdracht van de hemislices, met behulp van de juiste borstels, in 1,5 mL buizen met 250 µL van lysis buffer, behoud van de buizen op ijs (Figuur 2 L). Te maken van de lysis buffer, meng PBS 1 x met fosfatase en protease remmers cocktails zowel verdund op 1:100, en meng het weefsel met verschillende pestles om te voorkomen dat besmetting onder de monsters. Voltooi deze acties binnen 10-15 min.</li>
	<li>Centrifugeer de hersenen lysate bij 1.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Breng het supernatant in nieuwe buizen en houden van de monsters bij-80 ° C.</li>
</ol>5. aflezen van de eiwitconcentratie en westelijke vlekkenanalyse
<ol><li>De eiwitconcentratie van elk monster te bepalen en vervolgens de aliquots voorbereiden door westelijke vlekkenanalyse als eerder beschreven22.</li>
	<li>Statistische analyses om te evalueren van de effecten van de behandeling op eiwit expressie uit te voeren.</li>
</ol>

<ol><li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathological+stageing+of+Alzheimer-related+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.</a> Acta Neuropathologica. 82 (4), 239-259 (1991).</li>
<li>Schliebs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+forebrain+cholinergic+dysfunction+in+Alzheimer%27s+disease--interrelationship+with+beta-amyloid%2C+inflammation+and+neurotrophin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Basal forebrain cholinergic dysfunction in Alzheimer's disease--interrelationship with beta-amyloid, inflammation and neurotrophin signaling.</a> Neurochemical Research. 30 (6-7), 895-908 (2005).</li>
<li>Schmitz, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+forebrain+degeneration+precedes+and+predicts+the+cortical+spread+of+Alzheimer%27s+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Basal forebrain degeneration precedes and predicts the cortical spread of Alzheimer's pathology.</a> Nature Communications. 7, 13249(2016).</li>
<li>Fjell, A. M., McEvoy, L., Holland, D., Dale, A. M., Walhovd, K. B. Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+normal+in+normal+aging%3F+Effects+of+aging%2C+amyloid+and+Alzheimer%27s+disease+on+the+cerebral+cortex+and+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">What is normal in normal aging? Effects of aging, amyloid and Alzheimer's disease on the cerebral cortex and the hippocampus.</a> Progress in neurobiology. 117, 20-40 (2014).</li>
<li>Kovács, T., Cairns, N. J., Lantos, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+centres+in+Alzheimer%27s+disease%3A+olfactory+bulb+is+involved+in+early+Braak%27s+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Olfactory centres in Alzheimer's disease: olfactory bulb is involved in early Braak's stages.</a> Neuroreport. 12 (2), 285-288 (2001).</li>
<li>Winblad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defeating+Alzheimer%27s+disease+and+other+dementias%3A+a+priority+for+European+science+and+society%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Defeating Alzheimer's disease and other dementias: a priority for European science and society.</a> The Lancet Neurology. 15 (5), 455-532 (2016).</li>
<li>Herrup, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+case+for+rejecting+the+amyloid+cascade+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis.</a> Nat Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).</li>
<li>De Strooper, B., Karran, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cellular+Phase+of+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Cellular Phase of Alzheimer's Disease.</a> Cell. 164 (4), 603-615 (2016).</li>
<li>Scheltens, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.thelancet.com/journals/lancet/article/PIIS0140-6736(15)01124-1/abstract">Alzheimer's disease.</a> Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).</li>
<li>Arendt, T., Brückner, M. K., Lange, M., Bigl, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+acetylcholinesterase+and+butyrylcholinesterase+in+Alzheimer%27s+disease+resemble+embryonic+development-A+study+of+molecular+forms%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Changes in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in Alzheimer's disease resemble embryonic development-A study of molecular forms.</a> Neurochemistry International. 21 (3), 381-396 (1992).</li>
<li>Auld, D. S., Kornecook, T. J., Bastianetto, S., Quirion, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease+and+the+basal+forebrain+cholinergic+system%3A+relations+to+%CE%B2-amyloid+peptides%2C+cognition%2C+and+treatment+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease and the basal forebrain cholinergic system: relations to β-amyloid peptides, cognition, and treatment strategies.</a> Progress in Neurobiology. 68 (3), 209-245 (2002).</li>
<li>Arendt, T., Bruckner, M. K., Morawski, M., Jager, C., Gertz, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+neurone+loss+in+Alzheimer%27s+disease%3A+cortical+or+subcortical%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Early neurone loss in Alzheimer's disease: cortical or subcortical?</a> Acta Neuropathol Commun. 3, 10(2015).</li>
<li>Mesulam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cholinergic+Lesion+of+Alzheimer%27s+Disease%3A+Pivotal+Factor+or+The+Cholinergic+Lesion+of+Alzheimer%27s+Disease%3A+Pivotal+Factor+or+Side+Show%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">The Cholinergic Lesion of Alzheimer's Disease: Pivotal Factor or The Cholinergic Lesion of Alzheimer's Disease: Pivotal Factor or Side Show?</a> Learn Mem. , 43-49 (2004).</li>
<li>Schliebs, R., Arendt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cholinergic+system+in+aging+and+neuronal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The cholinergic system in aging and neuronal degeneration.</a> Behavioural Brain Research. 221 (2), 555-563 (2011).</li>
<li>Mesulam, M. M., Mufson, E. J., Wainer, B. H., Levey, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+cholinergic+pathways+in+the+rat%3A+An+overview+based+on+an+alternative+nomenclature+%28Ch1-Ch6%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Central cholinergic pathways in the rat: An overview based on an alternative nomenclature (Ch1-Ch6).</a> Neuroscience. 10 (4), 1185-1201 (1983).</li>
<li>Mesulam, M., Mufson, E. J., Levey, A. I., Wainer, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+innervation+of+cortex+by+the+basal+forebrain%3A+cytochemistry+and+cortical+connections+of+the+septal+area%2C+diagonal+band+nuclei%2C+nucleus+basalis+%28substantia+innominata%29%2C+and+hypothalamus+in+the+rhesus+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cholinergic innervation of cortex by the basal forebrain: cytochemistry and cortical connections of the septal area, diagonal band nuclei, nucleus basalis (substantia innominata), and hypothalamus in the rhesus monkey.</a> J Comp Neurol. 214 (2), 170-197 (1983).</li>
<li>Greenfield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+and+targeting+the+basic+mechanism+of+neurodegeneration%3A+The+role+of+peptides+from+the+C-terminus+of+acetylcholinesterase%3A+Non-hydrolytic+effects+of+ache%3A+The+actions+of+peptides+derived+from+the+C-terminal+and+their+relevance+to+neurodegenerat%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-Biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">Discovering and targeting the basic mechanism of neurodegeneration: The role of peptides from the C-terminus of acetylcholinesterase: Non-hydrolytic effects of ache: The actions of peptides derived from the C-terminal and their relevance to neurodegenerat.</a> Chemico-Biological Interactions. 203 (3), 543-546 (2013).</li>
<li>Garcia-Ratés, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28I%29+Pharmacological+profiling+of+a+novel+modulator+of+the+%CE%B17+nicotinic+receptor%3A+Blockade+of+a+toxic+acetylcholinesterase-derived+peptide+increased+in+Alzheimer+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">(I) Pharmacological profiling of a novel modulator of the α7 nicotinic receptor: Blockade of a toxic acetylcholinesterase-derived peptide increased in Alzheimer brains.</a> Neuropharmacology. 105, 487-499 (2016).</li>
<li>Eimerl, S., Schramm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantity+of+calcium+that+appears+to+induce+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">The quantity of calcium that appears to induce neuronal death.</a> Journal of neurochemistry. 62 (3), 1223-1226 (1994).</li>
<li>Greenfield, S., Vaux, D. J. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/0d25/c7e053b9eed98e759c2e2879cb53195c084e.pdf">Commentary Parkinson's Disease, Alzheimer's Disease and Motor Neurone Disease: Identifying a Common Mechanism.</a> Science. 113 (3), 485-492 (2002).</li>
<li>Badin, A. S., Morrill, P., Devonshire, I. M., Greenfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28II%29+Physiological+profiling+of+an+endogenous+peptide+in+the+basal+forebrain%3A+Age-related+bioactivity+and+blockade+with+a+novel+modulator%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">(II) Physiological profiling of an endogenous peptide in the basal forebrain: Age-related bioactivity and blockade with a novel modulator.</a> Neuropharmacology. 105, 47-60 (2016).</li>
<li>Brai, E., Stuart, S., Badin, A. -S., Greenfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Ex+Vivo+Model+to+Investigate+the+Underlying+Mechanisms+in+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Novel Ex Vivo Model to Investigate the Underlying Mechanisms in Alzheimer's Disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 291(2017).</li>
<li>Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+slices+as+models+for+neurodegenerative+disease+and+screening+platforms+to+identify+novel+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics.</a> Current neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Jensen, M. S., Lambert, J. D. C., Johansen, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recordings+from+rat+hippocampus+slices+following+in+vivo+brain+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recordings from rat hippocampus slices following in vivo brain ischemia.</a> Brain Research. 554 (1-2), 166-175 (1991).</li>
<li>Ferrati, G., Martini, F. J., Maravall, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+Adenosine+Receptor-Mediated+Regulation+of+Diverse+Thalamocortical+Short-Term+Plasticity+in+the+Mouse+Whisker+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Presynaptic Adenosine Receptor-Mediated Regulation of Diverse Thalamocortical Short-Term Plasticity in the Mouse Whisker Pathway.</a> Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-9 (2016).</li>
<li>Grinvald, A., Hildesheim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSDI%3A+a+new+era+in+functional+imaging+of+cortical+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).</li>
<li>Badin, A. S., John, E., Susan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+spatio-temporal+bioactivity+of+a+novel+peptide+revealed+by+optical+imaging+in+rat+orbitofrontal+cortex+in+vitro%3A+Possible+implications+for+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">High-resolution spatio-temporal bioactivity of a novel peptide revealed by optical imaging in rat orbitofrontal cortex in vitro: Possible implications for neurodegenerative diseases.</a> Neuropharmacology. 73, 10-18 (2013).</li>
<li>Greenfield, S. A., Badin, A. S., Ferrati, G., Devonshire, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+rat+brain+suggests+a+previously+missing+link+between+top-down+and+bottom-up+nervous+system+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the rat brain suggests a previously missing link between top-down and bottom-up nervous system function.</a> Neurophotonics. 4, 31213(2017).</li>
<li>Opitz-Araya, X., Barria, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3197400/">Organotypic hippocampal slice cultures.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (48), (2011).</li>
<li>Gong, C. -X., Lidsky, T., Wegiel, J., Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolically+active+rat+brain+slices+as+a+model+to+study+the+regulation+of+protein+phosphorylation+in+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">Metabolically active rat brain slices as a model to study the regulation of protein phosphorylation in mammalian brain.</a> Brain Research Protocols. 6 (3), 134-140 (2001).</li>
</ol>

De auteurs verklaren concurrerende financiële belangen. Susan A. Greenfield is de oprichter en voorzitter van Neuro-Bio Limited, een particulier bedrijf, en bezit aandelen in de vennootschap. Emanuele Brai en Antonella Cogoni zijn werknemers van Neuro-Bio Ltd.

Het belangrijkste aspect van dit protocol, gebaseerd op de reeds lang gevestigde ex vivo hersenen techniek, maakt het mogelijk om synchroon test twee spiegelende hemislices, verkregen uit hetzelfde anatomische vlak, toezicht op hun reactie na de toepassing van een specifieke voorwaarde (controleren of behandeling); Dit biedt dus een experimentele paradigma zo strak mogelijk worden gecontroleerd. De mogelijkheid om in een tijd - dosis- en site-specifieke wijze verschillende neurotransmitters aan neuronale bijzond...

AD is dat een chronische pathologie gekenmerkt door geleidelijke neurodegeneratieve stoornis op het gebied van verschillende hersengebieden, zoals de Entorinale cortex (EG), BF, hippocampus (HC) en bulbus olfactorius (OB)1,2,3, 4,5. De late stadia van AD ontwikkeling leiden tot een geleidelijke daling van de cognitieve, waardoor deze ziekte de meest voorkomende vorm van dementie, ongeveer goed voor 70% van alle gevallen6. Ondanks uitgebreide pogingen om te begrijpen van de beginfase veroorzaakt AD, is er momenteel niet een gedefinieerde experimentele indicatie ophelderen van hen. Bovendien, de meest populaire theorie - de "amyloïde hypothese" - is steeds meer in twijfel getrokken omdat het voorziet niet in een compleet profiel in het verklaren van de AD-pathobiology, noch een farmaceutische doel dat heeft bewezen effectieve7,8 ,9.
Een alternatieve theorie, die steeds meer aandacht krijgt suggereert dat de oorspronkelijke mechanismen die zich voordoen tijdens neurodegeneratie zijn gerelateerd aan een neuronale cluster vooral gevoelig in AD3,10,11 , 12 , 13 , 14. deze heterogene cellulaire hub omvatte binnen de BF, veroorzaakt en hersenstam, projecten aan veelvoudige gebieden, zoals de EG, HC en OB15,16. Ondanks haar diversiteit in neuronale morfologie en synthese van de neurotransmitter deelt deze kern van cellen een gemeenschappelijk kenmerk in het uiten van pijn, die ook een niet-enzymatische functie17,18kan hebben. Deze niet-klassieke rol als een roman signalering molecuul bemiddelt calcium (Ca2 +) stroom in neuronen die kan ondergaan trofische of giftige gebeurtenissen met betrekking tot Ca2 + dosis, beschikbaarheid en neuronale leeftijd17,18 , 19.
Tijdens neurodegeneratie, misschien de waargenomen cellulaire verlies wel daarom gekoppeld aan deze niet-enzymatische functie17,18,20, die te wijten is aan een 30mer peptide (T30) gekloofd uit de AChE C-terminus 20. in overeenstemming met de resultaten van de vorige, uitgevoerd op celcultuur en optische beeldvorming18,21 preparaten, we laten zien, door middel van een nieuwe benadering, gebaseerd op ex vivo rat hersenen segmenten met BF structuren, die T30 geïnduceerde een AD-achtige profiel22. Specifiek, biedt deze nieuwe methodiek een meer fysiologische scenario dan celkweek aangezien het onderhoudt veel van de kenmerken van een intact weefsel, variërend van anatomische aan circuits behoud, zij het om een tijdsinterval van uren. We toegepast dit protocol om te verkennen van de gebeurtenissen die plaatsvinden tijdens de vroege stadia van neurodegeneratie, toezicht op het acute respons T30 voor de aanvraag.
Ondanks de grote hoeveelheid literatuur over het gebruik van hersenen segmenten te onderzoeken van moleculaire pathways geïmpliceerd in neuronale schade of neurogenese23,24, dit protocol voorziet in de eerste keer een meer directe en gevoelige voorgelezen in vergelijking het gemeenschappelijk gebruik van segmenten van de organotypic. Echter kan is het geval voor organotypic hersenen secties, deze acute segment procedure ook worden vastgesteld voor verschillende doeleinden, zoals de beoordeling van neuroprotectieve of neurotoxische moleculen, ontdekking van primaire moleculaire veranderingen in een specifiek proces, analyse van Immunohistochemical en farmacologische testen voor centraal zenuwstelsel gerelateerde aandoeningen.

<table><tbody><tr><td>Natriumchloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich, Duitsland</td><td>S7653</td><td>Reagens voor aCSF-voorbereiding</td></tr><tr><td>Kaliumchloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich, Duitsland</td><td>P9333</td><td>Reagens voor aCSF-voorbereiding</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich, Duitsland</td><td>S5761</td><td>Reagens voor aCSF-voorbereiding</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat heptahydraat (MgSO4 (7H2O))</td><td>Sigma-Aldrich, Duitsland</td><td>63138</td><td>Reagens voor aCSF-voorbereiding</td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat monobasisch (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich, Duitsland</td><td>P5655</td><td>Reagens voor aCSF-voorbereiding</td></tr><tr><td>Hepes-zout</td><td>Sigma-Aldrich, Duitsland</td><td>H7006</td><td>Reagens voor aCSF-voorbereiding</td></tr><tr><td>Hepes-zuur</td><td>Sigma-Aldrich, Duitsland</td><td>H3375</td><td>Reagens voor aCSF-voorbereiding</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich, Duitsland</td><td>G7528</td><td>Reagens voor aCSF-voorbereiding</td></tr><tr><td>Calciumchloride dehydraat</td><td>Sigma-Aldrich, Duitsland</td><td>223506</td><td>Reagens voor aCSF-voorbereiding</td></tr><tr><td>T30-peptide</td><td>Genosphere Biotechnologies, Frankrijk</td><td></td><td>AChE-afgeleid peptide getest</td></tr><tr><td>Chirurgisch dissectieset</td><td>World Precision Instruments, VS</td><td>Artikelnr.: MOUSEKIT</td><td>Hersenverwijderingsstap</td></tr><tr><td>Chirurgische messen</td><td>Swann-Morton, VK</td><td>BS 2982</td><td>Hersenverwijderingsstap</td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Fisher Scientific, VS</td><td>11566873</td><td>Hersenvoorbereiding voor sneden</td></tr><tr><td>Lijm</td><td></td><td></td><td>Hersenvoorbereiding voor sneden</td></tr><tr><td>Vibratoom</td><td>Leica, Duitsland</td><td>VT1000 S</td><td>Sneden</td></tr><tr><td>Borstels</td><td></td><td></td><td>Weefselverwerking</td></tr><tr><td>Zuurstoftank</td><td></td><td></td><td>Sectie- en incubatiefase</td></tr><tr><td>1x Fosfaat bufferoplossing (PBS)</td><td>Fisher Scientific, VS</td><td>BP2438-4</td><td>Homogenisatie-stap</td></tr><tr><td>Fosfatase-remmers</td><td>Fisher Scientific, VS</td><td>1284-1650</td><td>Homogenisatie-stap</td></tr><tr><td>Protease-remmers</td><td>Roche complete PIC, VS</td><td>4693116001</td><td>Homogenisatie-stap</td></tr><tr><td>Stofzuigers</td><td>Starlab, VK</td><td>I1415-5390</td><td>Homogenisatie-stap</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce 660 nm Eiwit Assay</td><td>Thermo Scientific, VS</td><td>22660</td><td>Eiwitconcentratie</td></tr></tbody></table>

een alternatieve benadering te bestuderen van primaire gebeurtenissen in neurodegeneratie ex vivo rat hersenen segmenten gebruiken

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Ondanks talrijke studies die probeert te ontwikkelen betrouwbare diermodellen, welke als gevolg van de primaire onderliggende neurodegeneratie processen, zijn zeer weinigen algemeen aanvaard. Hier stellen wij een nieuwe procedure aangepast uit de bekende ex vivo hersenen segment techniek, die een dichter in vivo biedt-als scenario dan in vitro preparaten, voor het onderzoeken van de vroege gebeurtenissen triggering cel degeneratie, als waargenomen in de ziekte van Alzheimer (AD). Deze variatie bestaat uit eenvoudige en gemakkelijk reproduceerbaar stappen, waarmee behoud van de anatomische cytoarchitecture van de geselecteerde hersenen-regio en de lokale functionaliteit in een fysiologische milieu. Verschillende anatomische gebieden kunnen worden verkregen van de dezelfde hersenen, bieden de mogelijkheid voor het uitvoeren van meerdere experimenten met de behandelingen in kwestie in een site - dosis- en tijd-afhankelijke manier. Mogelijke beperkingen die invloed kunnen hebben op de resultaten die aan deze methode gerelateerde gerelateerd zijn aan het behoud van het weefsel, dat wil zeggen, de handhaving van de anatomische integriteit tijdens het snijden en incubatie stappen en de dikte van de sectie, die kunnen beïnvloeden de biochemische en immunohistochemische analyse. Deze aanpak kan worden gebruikt voor verschillende doeleinden, zoals het verkennen van de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de fysiologische of pathologische voorwaarden, drug screening of testen van de dosis-respons. Dit protocol kan ten slotte ook verminderen het aantal dieren in loondienst in behavioral studies. De toepassing gemeld hier is onlangs beschreven en getest voor de eerste keer op ex vivo rat hersenen segmenten met de basale reukkolf (BF), die tot de cerebrale regio's voornamelijk beïnvloed in AD behoort. In het bijzonder is gebleken dat het beheer van een giftige peptide afgeleid van de C-terminus van acetylcholinesterase (AChE) zou kunnen een AD-achtige profiel vragen, triggering, langs de as antero-posterior van de BF, een differentiële expressie van eiwitten gewijzigd in AD, zoals de alpha7 nicotinerge receptor (α7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau) en bèta amyloid (Aβ).

Het hier gepresenteerde protocol geeft aan dat de administratie van een giftige peptide, T30, in een site-afhankelijke manier de uitdrukking van α7-nAChR, p moduleert-Tau en Aβ in BF-bevattende secties (figuur 3A). De nicotinerge receptor toont een aanzienlijke stijging in de rostraal-behandeld hemislice in tegenstelling tot zijn tegenhanger van de controle (segment 1, p = 0.0310) (figuur 3B), terwijl de tussenliggende s...

Presenteren we een methode die kan nadere inzichten in de vroege gebeurtenissen onderliggende neurodegeneratie en gebaseerd op de gevestigde ex-vivo hersenen techniek, combineren de voordelen van in vivo en in vitro experimenten. Bovendien heeft het een unieke kans voor directe vergelijking van behandelde en onbehandelde groep in hetzelfde anatomische vlak vertegenwoordigt.

Een alternatieve benadering te bestuderen van primaire gebeurtenissen in neurodegeneratie Ex Vivo Rat hersenen segmenten gebruiken

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Het algemene doel van deze procedure is om gelijktijdig twee speculaire hemislices te onderzoeken die zijn verkregen uit hetzelfde anatomische vlak en de effecten na een behandeling te monitoren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen in het gebied van moleculaire neurowetenschappen, zoals de primaire gebeurtenissen die van invloed zijn op belangrijke moleculen die betrokken zijn bij neurodegeneratieve processen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een medium kan leveren dat de moleculaire cascades onderliggend aan neurodegeneratieve gebeurtenissen kan onthullen.Hoewel deze methode inzicht kan geven in primaire gebeurtenissen die plaatsvinden bij neurodegeneratie, kan het ook worden toegepast om diermodellen van verschillende stoornissen of andere organen en weefseleigenschappen te onderzoeken. Begin met het voorbereiden van twee verschillende kunstmatige hersenvochtvloeistoffen. Een voor het snijvlak van de hersenen en de andere voor de incubatiestap.Na het voorbereiden van de ACSF voor het snijvlak, meng de oplossing en bewaar deze op ijs. Bereid op dezelfde manier de opname-ACSF voor, maar bewaar deze op kamertemperatuur. Oxygeneer beide oplossingen.Bereid vervolgens de instrumenten voor voor de decapitatie en hersenverwijdering in de dissectiehood. Stel vervolgens de vibratomeparameters in. Stel de snededikte in naar behoefte.Zoals driehonderd micron. Stel de frequentie in op zeven en de snelheid op zes. Plaats vervolgens de vibratomekamer en omring deze met ijs.Voor het snijvlak van de hersenen, open de carbogenklep om de ACSF voor het snijvlak te oxygeneren. Selecteer de minimale stroomsnelheid van ongeveer twee milliliter per minuut. Bereid nu in twee buisjes van 15 milliliter de tussenvoorwaarden voor.Laad een buisje met 10 milliliter van de opname-ACSF als controle. Laad de andere met 10 milliliter opname-ACSF verrijkt met de behandeling. In dit geval twee micromolar van T30.Vortex beide buisjes en bewaar ze op ijs totdat ze nodig zijn. Snijd de huid over de schedel in met een chirurgisch mes. Snijd vervolgens met een schaar de schedel langs de middenlijn van de achterkant tot aan het bot boven de reuklobben.Trek vervolgens lateraal aan de twee zijden van de schedel met een pincet om toegang te krijgen tot de hersenen. Plaats een spatel ventraal aan de hersenen. Schep het voorzichtig eruit en houd het gehydrateerd in ijskoud snijvlak-ACSF gedurende ongeveer vijf minuten.Na de rust in koud ACSF, breng de hersenen over naar een filterpapier. En nadat het cerebellum is verwijderd, lijm de hersenen verticaal op de vibratome-schijf. Breng het vervolgens over naar de snijdkamer gevuld met ijskoud snijvlak-ACSF.Start nu de zuurstofstroom naar de kameroplossing. Pas vervolgens het snijinterval aan en ga verder met het snijvlak van de hersenen. Verzamel de secties die het gebied van belang bevatten met behulp van standaardmethoden.Deel nu zorgvuldig elke sectie met kleine schaar langs de middenlijn om twee speculaire hemislices te verkrijgen. Gebruik elk paar hemislices voor de controle en behandelde conditie. Laat de hemisecties na het delen vijf tot tien minuten rusten in de vibratomekamer.Na de rust, breng de hemisecties voorzichtig over met een glas pijpje in een borrelend potje met opname-ACSF op kamertemperatuur. Laat de hemisecties vervolgens ongeveer 30 minuten herstellen voordat u verder gaat. Tijdens de pauze, vul drie glasbuisjes met drie milliliter opname-ACSF voor de controlegroep en drie buisjes met drie milliliter ACSF verrijkt met T30 voor de behandelde groep.Na de 30 minuten rust, binnen vijf minuten, breng het monster over naar de baden. Laad eerst de opeenvolgende hemislices in de controleoplossing met een borstel. Breng vervolgens, met een andere borstel, de contralaterale hemisecties over naar de behandelingsoplossing.Versluit vervolgens de buisjes met plastic stoppen bevattende naalden van 21 gauge voor de toevoer van carbogen naar het monster. Lever zuurstof af met een minimale stroomsnelheid, zoals twee milliliter per minuut om enige beweging van het hersenweefsel te voorkomen, wat mogelijke mechanische schade aan het weefsel kan veroorzaken. Dit voltooit de opstelling.Start nu een incubatie van vijf uur. Stop na de incubatie de zuurstofstroom en dek de buisjes af. Breng vervolgens de hemislices voorzichtig over met de juiste borstel naar 1,5 milliliterbuisjes met 250 microliter lysisbuffer, bewaard op ijs.Homogeniseer vervolgens elk weefsel met afzonderlijke stampers. Voltooi de overdracht- en homogenisatie-stappen binnen 10 tot 15 minuten voor alle zes monsters. Centrifugeer vervolgens de gehomogeniseerde monsters bij 1.000 maal de zwaartekracht gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.Na het centrifugeren, breng de supernatanten over in nieuwe buisjes en bewaar de monsters bij min 80 graden Celsius. Toediening van een toxisch peptide, T30, aan de basilaire voorhersenen bevattende hemisecties had drie locatiespecifieke effecten op het weefsel. Het moduleerde de expressie van alfa zeven nicotine receptor, de fosforylering van Tau en de expressie van amyloid-beta.De nicotine receptor vertoonde een significante toename in de rostrale behandelde hemislice, terwijl de intermediaire slice geen enkele verandering tussen de twee omstandigheden vertoonde. In het achterste gedeelte was er een significante vermindering in het T30 blootgestelde gedeelte. Fosforyleringsniveaus van Tau waren significant verhoogd in de voorste regio.Aan de andere kant vertoonden de andere twee basilaire voorhersenensecties geen significant verschil tussen de omstandigheden. Amyloid-beta was significant verhoogd na T30 blootstelling in de rostrale en intermediaire hemisecties. In de caudale slide was er echter geen meetbaar effect op de expressie van amyloid-beta.Eenmaal beheerst, kan deze techniek binnen zeven uur worden uitgevoerd als deze goed wordt uitgevoerd.

an-alternative-approach-to-study-primary-events-neurodegeneration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Organotypische Slice Cultuur van E18 Rat Brains

Dit artikel schetst de procedures voor het bereiden van de hippocampus segmenten van ratten en transgene muizen voor de studie van synaptische veranderingen geassocieerd met de hersenen ouder worden en leeftijd-gerelateerde neurodegeneratieve ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer.

Voorbereiding van de Acute hippocampus Plakjes van ratten en transgene muizen voor de Studie van Synaptic Wijzigingen bij het ouder worden en amyloïdpathologie

Dit rapport toont een techniek voor mechanische isolatie van individuele levensvatbare neuronen te behouden bevestigd presynaptische boutons. Vibrodissociated neuronen hebben de voordelen van een snelle productie, een uitstekende farmacologische controle en een betere ruimte-clamp zonder invloed van naburige cellen. Deze methode kan gebruikt worden voor beeldvorming van synaptische elementen en patch-clamp opname.

Vibrodissociation van de neuronen van knaagdieren Brain Slices synaptische transmissie en Image presynaptische Terminals Study

This video demonstrates the procedure to prepare and treat rat brain hemislices with a neurotoxic peptide to mimic neurodegeneration. The protocol allows for analyzing neurodegenerative events by directly comparing control and treated slices in the same anatomical plane.

Treatment of Rat Coronal Slices with a Neurotoxic Peptide

Neuronale membraan mensenhandel stelt dynamisch plasmamembraaneiwit beschikbaarheid en significant invloed neurotransmissie. Tot op heden, is het een uitdaging om neuronale endocytische handel in volwassen neuronen te meten. Hier beschrijven we een zeer effectieve, kwantitatieve methode om snelle veranderingen in de oppervlakte-eiwit expressie ex vivo bij acute plakjes hersenen te meten.

Brain Slice Biotinylatie: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Aanpak Regiospecifieke van plasma membraaneiwit Trafficking Meet in Adult Neuronen

We hebben hersenen slice model dat gebruikt kan worden om de moleculaire mechanismen betrokken bij-gemedieerde excitotoxiciteit hersenletsel onderzoeken ontwikkeld. Deze techniek genereert levensvatbare volwassen hersenweefsel en vermindert nummers die nodig zijn voor experimenten dier, met behoud van de neuronale circuits, cellulaire interacties, en postsynaptische compartimenten gedeeltelijk intact.

Excitotoxische Stimulatie van Hersenen Microslices als<em&gt; In vitro</em&gt; Model van een beroerte

Wij beschrijven procedures voor de verwerking van pasgeboren rat hersenweefsel te verkrijgen hoge-resolutie elektronen micrografen voor Morphometric analyse van de synaptische blaasje distributie bij zenuw terminals. De met deze methoden verkregen micrografen kunnen ook gebruikt worden om de morfologie van een aantal andere cellulaire componenten en hun dimensionale structurele relaties te bestuderen.

Voorbereiding van pasgeboren rat hersenweefsel voor Ultrastructurele Morphometric analyse van de synaptische blaasje distributie bij zenuw terminals

Dit protocol beschrijft de voorbereiding van horizontale hippocampal-entorhinal cortex (HEC) plakjes van muizen die spontane scherpe golf rimpelactiviteit vertonen. Plakjes worden geïncubeerd in een vereenvoudigde interface-holdingkamer en opnames worden uitgevoerd onder ondergedompelde omstandigheden met snelstromende kunstmatige cerebrospinale vloeistof om weefsel oxygenatie en de spontane opkomst van activiteit op netwerkniveau te bevorderen.

Acute muis hersenen snijden om spontane Hippocampal Netwerk activiteit te onderzoeken

We presenteren een protocol om acute plakjes te bereiden van de dorsaal-intermediaire hippocampus van muizen. We vergelijken dit transversale preparaat met coronale snijden in termen van kwaliteit van opnames en behoud van morfologische kenmerken van opgenomen neuronen.

Voorbereiding van acute plakjes van Dorsale Hippocampus voor hele celopname en neuronale reconstructie in de dentaat gyrus van volwassen muizen

Dit protocol demonstreert een eenvoudige en robuuste methode om in situ axongroei en groeikegeldynamiek te bestuderen. Het beschrijft hoe ex vivo fysiologisch relevante acute hersenplakken kunnen worden bereid en biedt een gebruiksvriendelijke analysepijplijn.

In situ Visualisatie van Axon-groei en groeikegeldynamiek in acute ex vivo embryonale hersenplakculturen

Leer een ex-vivo hersentechniek om neurodegeneratieve processen te bestuderen met gepaarde hemislices van rattenhersenen. Deze methode maakt directe vergelijking van behandelde en onbehandelde condities mogelijk.

Een alternatieve benadering te bestuderen van primaire gebeurtenissen in neurodegeneratie Ex Vivo Rat hersenen segmenten gebruiken (Video) | JoVE Journal

Een alternatieve benadering te bestuderen van primaire gebeurtenissen in neurodegeneratie Ex Vivo Rat hersenen segmenten gebruiken

Meer video's verkennen