Name: Zeldzame gebeurtenis detectie met behulp van fout-gecorrigeerd DNA en RNA Sequencing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Leer fout-gecorrigeerde sequencing voor detectie van zeldzame mutaties met Illumina-chemie en unieke moleculaire identificatoren. Deze methode detecteert varianten tot 0,01% frequentie voor genoomonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken de deelnemers aan de Children's Oncology Group AAML1531 studie en de verpleegkundigen gezondheid studeren voor hun bijdragen in de vorm van patiënt monsters. Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health (UM1 CA186107, RO1-CA49449 en RO1 CA149445), het Children's Discovery Institute of Washington University en St. Louis kinder ziekenhuis (MC-II-2015-461) en Eli Seth Matthews leukemie Foundation.

<ol><li>Hoang, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+quantification+of+rare+somatic+mutations+in+normal+tissues+using+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Genome-wide quantification of rare somatic mutations in normal tissues using massively parallel sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113, 9846-9851 (2016).</li>
<li>O'Roak, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporadic+autism+exomes+reveal+a+highly+interconnected+protein+network+of+de+novo+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sporadic autism exomes reveal a highly interconnected protein network of de novo mutations.</a> Nature. 485, 246-250 (2012).</li>
<li>Young, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+ultra-rare+pre-leukemic+clones+via+targeted+error-corrected+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Quantifying ultra-rare pre-leukemic clones via targeted error-corrected sequencing.</a> Leukemia. 29 (7), 1608-1611 (2015).</li>
<li>Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27546487">Clonal hematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults.</a> NatureCommunications. 7, 12484(2016).</li>
<li>Patel, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+relevance+of+integrated+genetic+profiling+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Prognostic relevance of integrated genetic profiling in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 366, 1079-1089 (2012).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nbt1486">Next-generation DNA sequencing.</a> Nature Biotechnology. 26 (10), 1135-1145 (2008).</li>
<li>Kohlmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+residual+disease+by+next-generation+deep-sequencing+of+RUNX1+mutations+can+identify+acute+myeloid+leukemia+patients+with+resistant+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Monitoring of residual disease by next-generation deep-sequencing of RUNX1 mutations can identify acute myeloid leukemia patients with resistant disease.</a> Leukemia. 28, 129-137 (2014).</li>
<li>Luthra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing-based+multigene+mutational+screening+for+acute+myeloid+leukemia+using+MiSeq%3A+applicability+for+diagnostics+and+disease+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing-based multigene mutational screening for acute myeloid leukemia using MiSeq: applicability for diagnostics and disease monitoring.</a> Haematologica. 99, 465-473 (2014).</li>
<li>Kinde, I., Wu, J., Papadopoulos, N., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+rare+mutations+with+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of rare mutations with massively parallel sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (23), 9530-9535 (2011).</li>
<li>Schmitt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+ultra-rare+mutations+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (36), 14508-14513 (2012).</li>
<li>Vander Heiden, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pRESTO%3A+a+toolkit+for+processing+high-throughput+sequencing+raw+reads+of+lymphocyte+receptor+repertoires%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">pRESTO: a toolkit for processing high-throughput sequencing raw reads of lymphocyte receptor repertoires.</a> Bioinformatics. 30 (13), 1930-1932 (2014).</li>
<li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+digital+error+suppression+for+improved+detection+of+circulating+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22NatureBiotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA.</a> NatureBiotechnology. 34, 547-555 (2016).</li>
<li>Shugay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAGERI%3A+Computational+pipeline+for+molecular-barcoded+targeted+resequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLOSComputationalBiology%22%5BJournal%5D)">MAGERI: Computational pipeline for molecular-barcoded targeted resequencing.</a> PLOSComputationalBiology. 13 (5), e1005480(2017).</li>
<li>Wong, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+TP53+mutations+in+the+origin+and+evolution+of+therapy-related+acute+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of TP53 mutations in the origin and evolution of therapy-related acute myeloid leukaemia.</a> Nature. 518, 552-555 (2014).</li>
<li>Krimmel, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-deep+sequencing+detects+ovarian+cancer+cells+in+peritoneal+fluid+and+reveals+somatic+TP53+mutations+in+noncancerous+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Ultra-deep sequencing detects ovarian cancer cells in peritoneal fluid and reveals somatic TP53 mutations in noncancerous tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113 (21), 6005-6010 (2016).</li>
<li>Phallen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+early-stage+cancers+using+circulating+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22ScienceTranslationalMedicine%22%5BJournal%5D)">Direct detection of early-stage cancers using circulating tumor DNA.</a> ScienceTranslationalMedicine. 9, eaan2415(2017).</li>
<li>Egorov, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+profiling+of+immune+repertoires+for+minor+lymphocyte+counts+using+unique+molecular+identifiers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantitative profiling of immune repertoires for minor lymphocyte counts using unique molecular identifiers.</a> The Journal of Immunology. 194 (12), 6155-6163 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Wij tonen hier, een suite van de protocollen van de fout-gecorrigeerde sequentie die gemakkelijk kunnen worden geïmplementeerd om te bestuderen van mutaties met lage VAFs in de verschillende ziekten. De belangrijkste factor is de integratie van UMIs met elke molecuul voordat sequencing zoals ze fout-correctie van de ruwe luidt inschakelen. De hier beschreven methoden toestaan onderzoekers op te nemen van aangepaste UMIs verkrijgbare gene panelen zowel zelf ontworpen gen-specifieke oligos.
NGS standaardprotocol verzet zich tegen de detectie van mutaties met VAF minder dan 2% als gevolg van het foutenpercentage sequencing en dit beperkt de toepassing van NGS in studies waar de opsporing van zeldzame varianten is van cruciaal belang. Door het omzeilen van het standaardtarief van de NGS-fout, kunt ECS gevoelige detectie van deze ruwe varianten. Bijvoorbeeld is detectie van pathogene mutaties wanneer deze mutaties ontstaan eerst (dus met lage VAF) noodzakelijk om vroegtijdige interventie van de ziekte14,15. Leukemie onderzoek, de opsporing van minimale residuele ziekte (residuele leukemische cellen nabehandeling) informeert Risicostratificatie en kan worden gebruikt om de behandelingsopties op een wijze die binaire stroom cytometrische evaluaties kunnen niet op de hoogte. ECS is bovendien toepassing te detecteren circulerende tumor nucleïnezuur en te evalueren gemetastaseerde potentieel in solide tumor patiënten door te beoordelen voor de aanwezigheid/afwezigheid evenals de variant last van bepaalde mutaties die kenmerken van de primaire zijn tumor16.
Zoals blijkt uit tabel 1, de kracht van het gebruik van de binomiale verdeling gebaseerde positie-specifieke servicefout model Bel varianten hangt grotendeels af van het aantal gesequenceerd Bibliotheken, alsmede de diepte van sequencing gebruikt om te bouwen van het model van de fout. De robuustheid van het model fout neemt toe met hogere aantal monsters en meer sequencing diepte. Het wordt aanbevolen om ten minste 10 gesequenceerd monsters met een gemiddelde van fout-gecorrigeerd Lees dekking van 3000 x per monster gebruiken om een fout-profiel voor elk monster te bouwen. De positie-specifieke benadering is gelijkaardig aan MAGERI, maar in plaats van met behulp van een statistische foutenpercentage voor alle zes de vervanging van de verschillende typen (A > C/T > G, A > G/T > C, A > T/T > A, C > A/G > T, C > G/G > C C > T/G > A)13, we model elke vervanging afzonderlijk op elke positie. Bijvoorbeeld een foutmarge van C > T op een bepaalde genomic positie verschilt van een andere positie. Onze aanpak ook rekening een sequencing batch effect, zoals de base vervanging tarief waargenomen in één sequencing run van gescoord afwijken kan. Daarom is het belangrijk om elke positie voor alle soorten van vervanging model vooral wanneer monsters van andere sequencing loopt zijn samengevoegd om het model te bouwen.
Een belangrijke overweging bij het ontwerpen van een ECS-experiment is de detectie van de gewenste drempelwaarde. De schoonheid van NGS studies is dat ze gemakkelijk kunnen worden aangepast in termen van genen/doelstellingen van belang, detectie drempel (ingegeven door de diepte van sequencing) en aantal personen bevraagd. Bijvoorbeeld, als de onderzoekers benieuwd zeldzame mutaties in twee waarbij met een drempel van de detectie van 0,0001 zijn, kunnen ze maximaal 75 monsters in een enkele volgorde uitgevoerd met behulp van MiSeq V2 chemie die tot 15 miljoen leest uitgangen bundelen (2 waarbij * 10.000 moleculen * 10 leest voor foutcorrectie * 75 monsters = 15 miljoen sequencing leest). Onderzoekers kunnen het aantal moleculen gaan op volgorde of het aantal samengevoegde monsters in een enkele sequencing lopen naar de detectie drempel aanpassen variëren. In onze studies, we gericht op het vinden van mutaties met een drempel van detectie van 0.0001 VAF (1:10, 000) via het deelvenster Illumina gen. We gebruiken routinematig 250 ng DNA om ervoor te zorgen dat voldoende moleculen worden vastgelegd met het oog op de drempel van de bovengenoemde detectie te starten. Onderzoekers kunnen opteren om te beginnen met lagere hoeveelheid DNA (50 ng is aanbevolen) als de gewenste detectiegrens > 0,001 VAF.
Zoals de UMIs worden toegevoegd op de i5-indexen, moeten sequencing instellingen dienovereenkomstig worden gewijzigd. Bijvoorbeeld, we gebruikten 16 N UMIs, en de sequencing-instellingen waren 2 x 144 gepaarde einde leest, 8 cycli van Index 1 en 16 cycli van index 2 in tegenstelling tot de gebruikelijke 8 cycli van Index 2. De stijging van de Index 2 cyclus wordt gecompenseerd door een daling van het totale aantal cycli toegewezen aan het luidt als volgt. Als onderzoekers kiezen voor het gebruik van 12N UMIs10,17, worden de instellingen gewijzigd tot 12 cycli van Index 2.
Deze volgorde UMI gebaseerde methode is geoptimaliseerd om te corrigeren voor sequencing fouten. Het blijft suboptimaal in de omgang met PCR jackpotting, dat is een zaak voor alle versterking gebaseerde methode. We ronden van post Sequencen en post-bioinformatics validatie met behulp van ddPCR uitgevoerd en we nauwelijks enige valse positieven als gevolg van PCR jackpotting detecteren. Toch is het raadzaam dat onderzoekers de experimenten met behulp van high-fidelity polymerase om lage amplificatie fouten verrichten.

Zoals we leeftijd, blootstelling aan mutagene en stochastische fouten tijdens de celdeling in de accumulatie van somatische afwijkingen in het genoom, en dit resultaat ligt ten grondslag aan het fundamentele pathogenese van maligne transformatie, neuro-ontwikkelings ziekten, pediatrische aandoeningen en normale veroudering1,2. Somatische mutaties met ziekte-rijden potentieel zijn belangrijke diagnostische en prognostische biomarkers voor vroegtijdige opsporing en risico management3,4,5. Om fysiologische clonogenesis beter te begrijpen, is die klinische kennis en onderzoek van besluiten, de nauwkeurige kwantificering en karakterisering van deze mutaties van primair belang. Volgende-generatie sequencing (NGS) wordt momenteel gebruikt om te studeren klonale mutaties in heterogene DNA-monsters; NGS is echter beperkt tot het identificeren van mutaties op > 0,02 variant allel breuk (VAF) — als gevolg van de inherente foutmarge van 0,5 – 2.0% van de sequencing platformen6,7,8. Dientengevolge, worden bijhouden van diagnostisch en prognostically belangrijke somatische varianten op lagere VAF niet bereikt met behulp van standaard NGS.
Onlangs, zijn verschillende methoden ontwikkeld om het omzeilen van het foutenpercentage van NGS8,9,10,11. Deze methoden maken gebruik van moleculaire tagging, waardoor foutcorrectie na sequencing. Elke molecuul of genomic fragment in de sequencing-bibliotheek is gelabeld met een willekeurige unieke moleculaire Identifier (UMI) die specifiek is voor dat molecuul. De UMIs worden door permutaties van een string van gerandomiseerde nucleotiden (8 – 16 N) geconstrueerd. Een tweede monster-specifieke barcode is ook geïntegreerd in de werkstroom waarmee multiplexing van meerdere monsters in de dezelfde NGS volgorde uitvoeren. PCR versterking op de moleculair tagged bibliotheek wordt uitgevoerd, en vervolgens de bibliotheek wordt gestuurd voor het rangschikken. Tijdens de voorbereiding van de bibliotheek verwacht wordt dat fouten willekeurig zal worden ingevoerd aan de genomic fragment tijdens PCR versterking en sequencing8. Als u wilt verwijderen van willekeurige volgorde fouten, ruwe sequencing leest gegroepeerd volgens de UMI. Artefacten van sequencing verwachting niet aanwezig te zijn in alle leest met de dezelfde UMI op dezelfde genomic positie vanwege de stochastische aard van invoering, overwegende dat een ware variant getrouw zal worden versterkt en sequenced in alle leest die delen van de dezelfde UMI. De artefacten zijn bioinformatically verwijderd. Hier beschrijven we drie methoden van fout-gecorrigeerd Sequencing (ECS) geoptimaliseerd in het laboratorium voor DNA om één nucleotide varianten (SNVs) en kleine invoeging-verwijderingen (microdeleties) te identificeren en voor RNA ter vergemakkelijking van de kwantificering van de genexpressie hieronder de NGS foutdrempel.
De eerste methode beschreven een manier om te zoeken naar zeldzame somatische gebeurtenis met behulp van specifieke primers gen ontworpen door onderzoekers. Voorafgaand aan de voorbereiding van de bibliotheek, onderzoekers moeten het ontwerpen van inleidingen te richten op de fragmenten van belang. We gebruikten de web-app Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Waarbij van 200 – 250 bp zijn ideaal voor de Kettingreactie van de polymerase (PCR) zoals deze zal, eenmaal UMIs hebben overgenomen, genereren overlappende gekoppeld-einde leest met 150 bp gekoppeld-einde leest. De voorwaarden waaraan van optimale primer, ontwerp moet worden gebruikt: minimale primer grootte = 19; Optimale primer grootte = 25; Maximale primer grootte = 30; Minimale Tm = 64 ° C; Optimale Tm = 70 ° C; Maximale Tm = 74 ° C; Maximale Tm verschil = 5 ° C; Minimumgehalte aan GC = 45; Maximumgehalte GC = 80; Nummer om terug te keren = 20; Maximaal 3' eind stabiliteit = 100.
In methode 2 beschrijven we een methode die het ECS-DNA-protocol met Illumina chemie enquête voor klonen SNVs en kleine microdeleties zo zeldzaam als 0.0001 VAF met behulp van commercieel verkrijgbare gene panelen die honderden waarbij bevatten combineren. Wij hebben het TruSight myeloïde Sequencing paneel (Illumina) gebruikt voor ons experiment en ontworpen een uitgevouwen paneel te nemen van extra genen van belang voor pediatrische myeloïde ziekten. Deze panelen hebben unieke moleculaire-id's (UMIs) die foutcorrectie, vergemakkelijken zou dus we hebben onze eigen strategie adapter toegevoegd aan deze panelen niet aangeboden. ECS moeten werken even goed met een van de andere deelvensters ter verrijking van genen die is gekoppeld aan verschillende ziekten. Na DNA isolatie en daaropvolgende kwantificering van de weefsels of monster van belang, is het aangeraden om te hebben van ten minste 500 ng van voorraad DNA per model. We maken regelmatig een enkele sequentie-bibliotheek met behulp van 250 ng van DNA om te vangen als veel unieke genomic fragment mogelijk voor stroomafwaarts leest-duplicatie en VAF berekening. Een optionele repliceren sequencing-bibliotheek kan worden gemaakt met de resterende 250 ng van DNA. Wij maken altijd twee repliceren bibliotheken per model, en wij vinden alleen die gebeurtenissen onafhankelijk van elkaar in beide wordt gerepliceerd als ware positieven ontdekt. Wij kunnen ook een genomic positie-specifieke binomiale servicefout model voor het verhogen van de nauwkeurigheid van variant roepen4,,13.
Tot slot, beschrijven we een methode ECS koppelen aan RNA sequencing voor transcript kwantificering met behulp van off-the-shelf QIAseq gericht RNA panelen (Qiagen). De UMIs vereist voor de-duplicatie kunnen en foutcorrectie zijn opgenomen in de kits, en onderzoekers bibliotheken de aanbevelingen van de fabrikant. Bioinformatically, onderzoekers kunnen de pijpleiding geschetst voor ECS-DNA, die zal worden toegelicht in de sectie PROTOCOL volgen.

<table><tbody><tr><td>Q5 High Fidelity Hot Start Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0492S</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Truseq Custom Amplicon Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1003</td><td></td></tr><tr><td>UMI i5 adapter sequences</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module</td><td>New England BioLabs</td><td>E7442S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Ligation Module</td><td>New England BioLabs</td><td>E7595S</td><td></td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1864034</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen</td><td>Bio-Rad</td><td>1864005</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Droplet Digital PCR System</td><td>Bio-Rad</td><td>1864001</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 96-Well Plates</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator</td><td>Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator</td><td>Bio-Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent Genomics</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation</td><td>Agilent Genomics</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>TruSight Myeloid Sequencing Panel</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1010</td><td></td></tr><tr><td>Bowtie 2</td><td>Johns Hopkins University</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Customized QIAseq Targeted RNA Panel</td><td>Qiagen</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Plus Mini Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr></tbody></table>

zeldzame gebeurtenis detectie met behulp van fout-gecorrigeerd dna en rna sequencing

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventionele volgende-generatie sequencing technieken (NGS) hebben toegestaan voor enorme genomische karakterisering voor meer dan een decennium. Specifiek, is NGS gebruikt voor het analyseren van het spectrum van klonen mutaties in maligniteit. Hoewel veel efficiënter dan de traditionele methoden Sanger, NGS worstelt met het identificeren van zeldzame mutaties voor klonen en subclonal toe te schrijven aan zijn hoge foutmarge van ~0.5–2.0%. Dus, standaard NGS heeft een limiet van de detectie van mutaties die > 0,02 variant allel breuk (VAF). Terwijl de klinische betekenis voor mutaties dit zeldzame bij patiënten zonder bekende ziekte onduidelijk blijft, patiënten die behandeld werden voor leukemie hebben aanzienlijk verbeterd resultaten wanneer residuele ziekte is < 0,0001 door stroom cytometry. Om deze artefactual achtergrond van NGS, zijn tal van methoden ontwikkeld. Hier beschrijven we een methode voor fout-gecorrigeerd DNA en RNA Sequencing (ECS), waarbij de individuele moleculen met een 16 bp willekeurige index voor foutcorrectie én een 8 bp patiënt-specifieke index voor multiplexing tagging. Onze methode kunt detecteren en klonen mutaties op variant allel breuken (VAFs) twee ordes van grootte lager dan de detectiegrens van NGS en zo zeldzaam als 0.0001 VAF bijhouden.

Met Targeted Error-Corrected Sequencing voor DNA, die wij hebben uitgevoerd een bewijs van beginsel experiment verdunnen mutant patiënt DNA in commerciële genomic DNA. De patiënt had een mutatie in GATA1 (chrX:48650264, C > G) met originele VAF van 0,19. Wij laten zien in Figuur 1 dat ECS kwantitatieve tot een niveau van 1:10,000 voor één nucleotide variant.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig1.jpg"> Figuur 1: verdunningsreeks van GATA1 SNV waaruit blijkt dat ECS kwantitatieve naar het niveau van 1:10,000. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Ook laten we zien dat het ECS-DNA betrouwbaar zeldzame klonale mutaties in de genen productlevering in volwassen acute myeloïde leukemie (AML) in gezonde oudere personen4 detecteert. Wij verkregen buffy coat monsters van 20 gezonde individuen in de verpleegkundige de gezondheid studie dwarshelling ongeveer ~ 10 jaar uit elkaar. We het protocol van het deelvenster ECS-DNA toegepast op deze monsters. Voor dit experiment, we aangepast Illumina TruSight myeloïde Sequencing hettoezichtpanel die uit 568 waarbij (meer informatie over gen lijst op https://www.illumina.com/products/by-type/clinical-research-products/trusight-myeloid.html bestaat) en sequenced 80 bibliotheken van 20 personen (2 collecties op verschillende tijdstippen, 2 duplo's per persoon per keer punt) met behulp van Illumina NextSeq platform, die gegenereerd een gemiddelde van 47,7 miljoen gekoppeld-einde leest en gemiddeld 3,4 miljoen fout gecorrigeerd consensus reeksen per bibliotheek4. De gemiddelde nucleotide dekking per bibliotheek was ongeveer 6.000 x (3.4 miljoen gedeeld door 568). Voor elk monster; we hebben een positie-specifieke servicefout profiel met behulp van gesequenceerd bibliotheken die niet van hetzelfde monster gebouwd. We vonden 109 klonale somatische mutaties die in beide replicatieonderzoeken van ten minste één collectie tijdstip aanwezig waren. Deze mutaties hebben VAF variërend van 0.0003-0.1451. We geselecteerd 21 mutaties met bekende kosmische representaties en gevalideerd alle 21 mutaties in één of twee collectie tijd punt met behulp van ddPCR (n = 34, Figuur 2, aangepast van jonge et al. 20164).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig2.jpg"> Figuur 2: mutaties geïdentificeerd door ECS werden geverifieerd via ddPCR met zeer concordant VAFs. (n = 34, aangepast ten opzichte van jonge et al. 20164). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Met betrekking tot de fout gecorrigeerd expressie niveau met ECS-RNA-protocol, aangepast we een gen panel met behulp van QIAseq-chemie die uit 416 genen bekend bestaat te worden betrokken bij verschillende soorten kanker (aangepast van QIAseq menselijke kanker Transcriptome deelvenster), en we versterkt de meest uitgesproken exon van een bepaald gen (Gene lijst in aanvullende materiaal 1). We sequenced de bibliotheken met behulp van Illumina MiSeq platform in gepaarde-beëindigen opmaak dat gaf een gemiddelde van 8.3 miljoen leest per bibliotheek, en wij erin geslaagd om vangen van een gemiddelde van 0.417 miljoen fout gecorrigeerd consensus sequenties. We toonden dat het niveau van de expressie van lage overvloed transcript (< 1.000 transcript graaf in 50 ng van totale RNA) is zeer reproduceerbaar tussen replicatieonderzoeken (gegevenspunt n = 300, Figuur 3). Validering door ddPCR (zes geselecteerde genen van variërende mate van expressie) aangetoond dat het niveau van de expressie van genen correct had veroverd door de ECS-protocol zonder de noodzaak voor normalisatie.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig3.jpg"> Figuur 3: Top, correlatie van transcript telt door ECS-RNA tussen replicaties van hetzelfde monster (n = 300). Bodem, transcript graven geïdentificeerd door ECS werden gecontroleerd door de ddPCR (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Volgende-generatie rangschikken (NGS) is een krachtig hulpmiddel voor genomische karakterisering die wordt beperkt door het hoge foutenpercentage van het platform (~0.5–2.0%). Wij beschrijven onze methoden van fout-gecorrigeerde sequentie die ons toelaten te ondervangen van het NGS foutenpercentage en mutaties op variant allel breuken zo zeldzaam als 0,0001 detecteren.

Zeldzame gebeurtenis detectie met behulp van fout-gecorrigeerd DNA en RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van enkele belangrijke vragen in verschillende onderzoeksgebieden, zoals detectie van precancereuze klonen, prognostische beoordeling van leukemiepatiënten na behandeling en identificatie van mogelijk pathogene mutaties bij beenmergdonoren. Spencer, die een technicus in het lab is, zal deze procedure met mij demonstreren. Deze video beschrijft hoe u het Error-corrected Sequencing Protocol kunt combineren met Illumina-chemie en commercieel verkrijgbare genpanels om clonale enkelnucleotidevarianten en kleine indels te detecteren met een gevoeligheid van één op de 10.000.Om de vereiste unieke moleculaire identificatoren op te nemen, worden aangepaste 16N i5- en i7-adapters met PCR gebruikt. Bereid eerst de Q5 Master Mix voor, die een polymerase met hogere nauwkeurigheid gebruikt dan het commercieel verkrijgbare alternatief. Combineer vervolgens voor elke reactie 37,5 microliter Q5 Master Mix, zes microliter vijf micromolair 16N i5-adapters, dat zijn de unieke moleculaire identificatoren, en zes microliter i7-adapters.Als het doel multiplexing is, gebruik dan verschillende i7-adapters in aparte monsters. Voer nu de PCR uit met de volgende parameters: dertig seconden bij 98 graden Celsius, gevolgd door vier tot zes cycli van tien seconden bij 98 graden Celsius, dertig seconden bij 66 graden Celsius en dertig seconden bij 72 graden Celsius. Beëindig de reactie met een verlenging van twee minuten bij 72 graden Celsius en houd op vier graden Celsius.Vervolgens hangt het aantal PCR-cycli dat u moet doen af van de grootte van het genpanel dat u gebruikt, volgens onze ervaring is een PCR met vier cycli voldoende als het genpanel ongeveer 1500 verschillende paden van genspecifieke oligo's heeft, terwijl een panel met ongeveer vijf tot 600 paar oligo's ongeveer zes PCR-cycli vereist. Reinig vervolgens de PCR-reacties met magnetische kralen, voeg 56,25 microliter magnetische kralenoplossing toe aan elk 75 microliter PCR-product, zet vervolgens elke reactie over in een aparte 1,5 milliliter lage bindingsbuis, meng door ten minste tien keer op en neer te pipetten en wacht vijf minuten. Breng vervolgens de mengsels over naar een magnetische houder en laat de supernatanten gedurende twee minuten klaren.Verwijder en gooi vervolgens de supernatanten weg. Voeg vervolgens 200 microliter 70%ethanol toe, wacht dertig seconden en verwijder vervolgens het ethanol. Herhaal deze ethanolwasstap eenmaal en laat de kralen vervolgens vijf minuten aan de lucht drogen.Elueer vervolgens de gemodificeerde bibliotheken van de kralen in twintig microliter dubbel gedestilleerd water. Plaats vervolgens de buisjes op een magnetisch rek om de magnetische kralen te scheiden van het eluaat. Maak eerst tienvoudige seriële verdunningen van de ECS-bibliotheken van de vorige stap, tot één deel per 1.000 in PCR-strips.Bereid vervolgens een Master Mix in een 1,5 milliliterbuisje voor. Combineer voor elke reactie 10 microliter ddPCR EvaGreen Mix, 0,2 microliter P5-primer, 0,2 microliter P7-primer en 4,6 microliter dubbel gedestilleerd water. Pipet vervolgens 15 microliter van de EvaGreen Master Mix in een nieuwe set buisjes en voeg ten slotte vijf microliter van één op 1.000 ECS opgeruimd product toe aan de Master Mix.Maak vervolgens PCR-druppeltjes met behulp van de druppelgenerator. Laad eerst de cassette, pipet 70 microliter druppelgeneratieolie in het putje van de cassette, gelabeld olie, en pipet 20 microliter van het ddPCR-reactiemengsel in het putje gelabeld monster. Bedek vervolgens de cassette met een rubberen afdichting en laad deze in de druppelgenerator, en laat alle druppelgeneratie doorgaan.Laad nu met behulp van een multikanaals pipet, langzaam, gedurende vijf seconden, 45 microliter druppels uit elk cassetteputje op een nieuwe PCR-plaat. Verzegelde vervolgens de PCR-plaat met een aluminiumfolie. Versterk nu het signaal in de druppels met de volgende omstandigheden: vijf minuten bij 95 graden Celsius, gevolgd door 40 cycli van dertig seconden bij 95 graden Celsius en een minuut bij 63 graden Celsius, koel vervolgens de reactie af tot vier graden Celsius gedurende vijf minuten voordat u deze opwarmt tot 90 graden Celsius gedurende vijf minuten en vervolgens vasthoudt bij vier graden Celsius.Bereid vervolgens de ddPCR-sjabloondruppelreadermachine voor. Selecteer de parameters voor absolute kwantificering en het gebruik van de QX200 ddPCR EvaGreen Supermix. Voer vervolgens de reacties door de druppelreader.Wanneer de ddPCR-analyse voltooid is, past u dezelfde verdelende drempels toe op elk monster. Normaliseer vervolgens elke bibliotheek naar het gewenste aantal moleculen. Begin met het maken van 50 microliterreacties, bestaande uit 25 microliter Q5 Master Mix, twee microliter van één micromolair P5-primer, twee microliter van één micromolair P7-primer en 21 microliter genormaliseerde DNA-bibliotheek.Voer vervolgens de PCR uit met de volgende parameters: dertig seconden bij 98 graden Celsius, gevolgd door zestien cycli van tien seconden bij 98 graden Celsius, dertig seconden bij 66 graden Celsius en dertig seconden bij 72 graden Celsius, vervolgens twee minuten bij 72 graden Celsius en vasthouden bij vier graden Celsius. Kwantificeer vervolgens de concentratie van DNA in de bibliotheken en pool de bibliotheken in gelijke molaire hoeveelheden voor sequencing, mikt op ongeveer vier nanomolair. Sequenceer vervolgens de gepoolde ECS-bibliotheek met behulp van het Illumina-sequencingplatform, met de volgende sequencinginstellingen: twee keer 144 paired-end reads, acht cycli van index een en zestien cycli van index twee.Het DNA van een patiënt met een mutatie in GATA1 werd verdund in commercieel genoom-DNA bij de oorspronkelijke VAF van 0,19. Met behulp van het beschreven protocol bleek ECS kwantitatief te zijn tot een niveau van één op 10.000 voor een enkel nucleotidevariant. Buffy coat-monsters van twintig gezonde individuen werden vervolgens geanalyseerd met behulp van een commercieel sequencingpanel dat bestaat uit 568 amplicons.Kortom, 109 clonale somatische mutaties waren aanwezig in beide replica's van ten minste één

rare-event-detection-using-error-corrected-dna-and-rna-sequencing

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Gepoolde DNA-sequencing is een snelle en kosteneffectieve strategie voor zeldzame varianten geassocieerd met complexe fenotypes in grote cohorten op te sporen. Hier beschrijven we de computationele analyse van gecombineerde, next-generation sequencing van 32 kanker-gerelateerde genen met behulp van de SPLINTER softwarepakket. Deze methode is schaalbaar, en van toepassing op alle fenotype van belang.

Detectie van zogenaamde Rare Genomic Varianten uit gepoold Sequencing gebruiken SPLINTER

This video demonstrates chip-based digital PCR — a variation of the digital PCR technique that is useful in detecting rare transcript variants. The PCR reaction is partitioned into the chambers of a nanofluidic chip, each of which acts as an independent reaction. The detection of fluorescence signals from the chambers with amplified targets confirms the presence of rare transcript variants in the sample.

Chip-Based Digital PCR to Detect Rare Transcript Variants Using a Nanofluidic Chip

Wild-type blocking PCR gevolgd door directe sequentiebepaling biedt een zeer gevoelige detectiemethode voor somatische mutaties met een lage frequentie in verschillende soorten monsters.

Wild-blokkering van PCR In combinatie met Direct Sequencing als een zeer gevoelige detectiemethode voor Low-Frequency somatische mutaties

Hier presenteren we een protocol voor het traceren van genomic DNA (gDNA) verontreiniging in RNA monsters. De onderhavige methode maakt gebruik van primers specifiek voor de interne getranscribeerde spacer regio (ITS) van ribosomal DNA (rDNA) genen. De methode is geschikt voor betrouwbare en gevoelige detectie van DNA besmetting in meeste prokaryoten en de eukaryoten.

Beoordeling van DNA besmetting in RNA Samples gebaseerd op Ribosomal DNA

Dit manuscript beschrijft een techniek voor het opsporen van mutaties van lage frequentie in ctDNA, ER-Seq. Deze methode is onderscheiden zich door het unieke gebruik van twee-directionele foutcorrectie, een speciale achtergrond filter en efficiënte moleculaire verwerving.

Detectie van zeldzame mutaties in CtDNA met behulp van de volgende generatie Sequencing

Dit protocol biedt onderzoekers met een nieuw instrument voor het controleren van de betrouwbaarheid van transcriptie in meerdere modelorganismen.

Genoom-brede Surveillance van transcriptie fouten in eukaryote organismen

Hier presenteren we een protocol voor het opsporen van tumor somatische mutaties in het Circulerend DNA dat aanwezig is in patiënt biologische vloeistoffen (biovloeistoffen). Onze druppel digitale polymerase kettingreactie (dpcr)-gebaseerde methode maakt kwantificering van de tumor mutatie allel Frequency (MAF) mogelijk, waardoor een minimaal invasieve aanvulling op de diagnose en temporele monitoring van de tumorrespons wordt vergemakkelijkt.

Detectie en monitoring van tumor geassocieerd Circulerend DNA bij patiënt biovloeistoffen

Snelle detectie en betrouwbare kwantificering van RNA-bewerkingsgebeurtenissen op genomische schaal blijven een uitdaging en vertrouwen momenteel op directe RNA-sequencingmethoden. Het hier beschreven protocol maakt gebruik van microtemperature gradient gel elektroforese (μTGGE) als een eenvoudige, snelle en draagbare methode om RNA-bewerking te detecteren.

Een nonsequencing-benadering voor de snelle detectie van RNA-bewerking

Hier presenteren we een protocol om het gehele genoom DNA-methylatie in grootschalige klinische patiënt screening studies met behulp van de Methyl-bindende DNA Capture sequencing (MBDCap-seq of MBD-volgende) technologie en de daaropvolgende bioinformatica analyse pijplijn te onderzoeken.

-Methyl-bindende DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Enkele cel sequencing is een steeds populairder en toegankelijk instrument voor de aanpak van genomische veranderingen op hoge resolutie. Wij bieden een protocol dat enkele cel sequencing gebruikt om het aantal kopieën veranderingen te identificeren in enkele cellen.

Detectie van Copy Number Wijzigingen met behulp van Single Cell Sequencing

Leer fout-gecorrigeerde sequencing voor detectie van zeldzame mutaties met Illumina-chemie en unieke moleculaire identificatoren. Deze methode detecteert varianten tot 0,01% frequentie voor genoomonderzoek.

Zeldzame gebeurtenis detectie met behulp van fout-gecorrigeerd DNA en RNA Sequencing

Meer video's verkennen