Zeldzame gebeurtenis detectie met behulp van fout-gecorrigeerd DNA en RNA Sequencing
3 augustus 2018
Volgende-generatie rangschikken (NGS) is een krachtig hulpmiddel voor genomische karakterisering die wordt beperkt door het hoge foutenpercentage van het platform (~0.5–2.0%). Wij beschrijven onze methoden van fout-gecorrigeerde sequentie die ons toelaten te ondervangen van het NGS foutenpercentage en mutaties op variant allel breuken zo zeldzaam als 0,0001 detecteren.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van enkele belangrijke vragen in verschillende onderzoeksgebieden, zoals detectie van precancereuze klonen, prognostische beoordeling van leukemiepatiënten na behandeling en identificatie van mogelijk pathogene mutaties bij beenmergdonoren. Spencer, die een technicus in het lab is, zal deze procedure met mij demonstreren. Deze video beschrijft hoe u het Error-corrected Sequencing Protocol kunt combineren met Illumina-chemie en commercieel verkrijgbare genpanels om clonale enkelnucleotidevarianten en kleine indels te detecteren met een gevoeligheid van één op de 10.000.
Om de vereiste unieke moleculaire identificatoren op te nemen, worden aangepaste 16N i5- en i7-adapters met PCR gebruikt. Bereid eerst de Q5 Master Mix voor, die een polymerase met hogere nauwkeurigheid gebruikt dan het commercieel verkrijgbare alternatief. Combineer vervolgens voor elke reactie 37,5 microliter Q5 Master Mix, zes microliter vijf micromolair 16N i5-adapters, dat zijn de unieke moleculaire identificatoren, en zes microliter i7-adapters.
Als het doel multiplexing is, gebruik dan verschillende i7-adapters in aparte monsters. Voer nu de PCR uit met de volgende parameters: dertig seconden bij 98 graden Celsius, gevolgd door vier tot zes cycli van tien seconden bij 98 graden Celsius, dertig seconden bij 66 graden Celsius en dertig seconden bij 72 graden Celsius. Beëindig de reactie met een verlenging van twee minuten bij 72 graden Celsius en houd op vier graden Celsius.
Vervolgens hangt het aantal PCR-cycli dat u moet doen af van de grootte van het genpanel dat u gebruikt, volgens onze ervaring is een PCR met vier cycli voldoende als het genpanel ongeveer 1500 verschillende paden van genspecifieke oligo's heeft, terwijl een panel met ongeveer vijf tot 600 paar oligo's ongeveer zes PCR-cycli vereist. Reinig vervolgens de PCR-reacties met magnetische kralen, voeg 56,25 microliter magnetische kralenoplossing toe aan elk 75 microliter PCR-product, zet vervolgens elke reactie over in een aparte 1,5 milliliter lage bindingsbuis, meng door ten minste tien keer op en neer te pipetten en wacht vijf minuten. Breng vervolgens de mengsels over naar een magnetische houder en laat de supernatanten gedurende twee minuten klaren.
Verwijder en gooi vervolgens de supernatanten weg. Voeg vervolgens 200 microliter 70%ethanol toe, wacht dertig seconden en verwijder vervolgens het ethanol. Herhaal deze ethanolwasstap eenmaal en laat de kralen vervolgens vijf minuten aan de lucht drogen.
Elueer vervolgens de gemodificeerde bibliotheken van de kralen in twintig microliter dubbel gedestilleerd water. Plaats vervolgens de buisjes op een magnetisch rek om de magnetische kralen te scheiden van het eluaat. Maak eerst tienvoudige seriële verdunningen van de ECS-bibliotheken van de vorige stap, tot één deel per 1.000 in PCR-strips.
Bereid vervolgens een Master Mix in een 1,5 milliliterbuisje voor. Combineer voor elke reactie 10 microliter ddPCR EvaGreen Mix, 0,2 microliter P5-primer, 0,2 microliter P7-primer en 4,6 microliter dubbel gedestilleerd water. Pipet vervolgens 15 microliter van de EvaGreen Master Mix in een nieuwe set buisjes en voeg ten slotte vijf microliter van één op 1.000 ECS opgeruimd product toe aan de Master Mix.
Maak vervolgens PCR-druppeltjes met behulp van de druppelgenerator. Laad eerst de cassette, pipet 70 microliter druppelgeneratieolie in het putje van de cassette, gelabeld olie, en pipet 20 microliter van het ddPCR-reactiemengsel in het putje gelabeld monster. Bedek vervolgens de cassette met een rubberen afdichting en laad deze in de druppelgenerator, en laat alle druppelgeneratie doorgaan.
Laad nu met behulp van een multikanaals pipet, langzaam, gedurende vijf seconden, 45 microliter druppels uit elk cassetteputje op een nieuwe PCR-plaat. Verzegelde vervolgens de PCR-plaat met een aluminiumfolie. Versterk nu het signaal in de druppels met de volgende omstandigheden: vijf minuten bij 95 graden Celsius, gevolgd door 40 cycli van dertig seconden bij 95 graden Celsius en een minuut bij 63 graden Celsius, koel vervolgens de reactie af tot vier graden Celsius gedurende vijf minuten voordat u deze opwarmt tot 90 graden Celsius gedurende vijf minuten en vervolgens vasthoudt bij vier graden Celsius.
Bereid vervolgens de ddPCR-sjabloondruppelreadermachine voor. Selecteer de parameters voor absolute kwantificering en het gebruik van de QX200 ddPCR EvaGreen Supermix. Voer vervolgens de reacties door de druppelreader.
Wanneer de ddPCR-analyse voltooid is, past u dezelfde verdelende drempels toe op elk monster. Normaliseer vervolgens elke bibliotheek naar het gewenste aantal moleculen. Begin met het maken van 50 microliterreacties, bestaande uit 25 microliter Q5 Master Mix, twee microliter van één micromolair P5-primer, twee microliter van één micromolair P7-primer en 21 microliter genormaliseerde DNA-bibliotheek.
Voer vervolgens de PCR uit met de volgende parameters: dertig seconden bij 98 graden Celsius, gevolgd door zestien cycli van tien seconden bij 98 graden Celsius, dertig seconden bij 66 graden Celsius en dertig seconden bij 72 graden Celsius, vervolgens twee minuten bij 72 graden Celsius en vasthouden bij vier graden Celsius. Kwantificeer vervolgens de concentratie van DNA in de bibliotheken en pool de bibliotheken in gelijke molaire hoeveelheden voor sequencing, mikt op ongeveer vier nanomolair. Sequenceer vervolgens de gepoolde ECS-bibliotheek met behulp van het Illumina-sequencingplatform, met de volgende sequencinginstellingen: twee keer 144 paired-end reads, acht cycli van index een en zestien cycli van index twee.
Het DNA van een patiënt met een mutatie in GATA1 werd verdund in commercieel genoom-DNA bij de oorspronkelijke VAF van 0,19. Met behulp van het beschreven protocol bleek ECS kwantitatief te zijn tot een niveau van één op 10.000 voor een enkel nucleotidevariant. Buffy coat-monsters van twintig gezonde individuen werden vervolgens geanalyseerd met behulp van een commercieel sequencingpanel dat bestaat uit 568 amplicons.
Kortom, 109 clonale somatische mutaties waren aanwezig in beide replica's van ten minste één
Overzicht
Dit artikel bespreekt een methode voor fout-gecorrigeerde sequencing die de nauwkeurigheid van next-generation sequencing (NGS) verbetert door de foutratio te verminderen. De techniek maakt het mogelijk om mutaties te detecteren bij zeer lage variant allelfracties, waardoor het waardevol is voor verschillende onderzoekstoepassingen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Genomics
- Sequencing Technologieën
- Mutatiedetectie
Achtergrond
- Next-generation sequencing (NGS) heeft een hoge foutratio van ongeveer 0,5–2,0%.
- Fout-gecorrigeerde sequencing methoden kunnen deze foutratio verminderen.
- Het detecteren van zeldzame mutaties is cruciaal in vakgebieden zoals oncologie en genetica.
- Unieke moleculaire identificatoren zijn essentieel voor nauwkeurige mutatiedetectie.
Doel van de studie
- Om een protocol voor fout-gecorrigeerde sequencing met behulp van Illumina chemie te presenteren.
- Om de gevoeligheid van de methode in het detecteren van clonale enkel-nucleotide varianten te demonstreren.
- Om de effectiviteit van het protocol in verschillende onderzoekscontexten te valideren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van Q5 Master Mix met high-fidelity polymerase.
- Gebruik van unieke moleculaire identificatoren via aangepaste adapters.
- PCR-amplificatie met specifieke cyclusparameters.
- Digitale druppel-PCR voor kwantificering en validatie van mutaties.
Belangrijkste resultaten
- Succesvol detectie van mutaties met variant allelfracties zo laag als 0,0001.
- Identificatie van 109 clonale somatische mutaties in verschillende monsters.
- Validatie van mutaties met behulp van digitale druppel-PCR.
- Demonstratie van de kwantitatieve nauwkeurigheid van de fout-gecorrigeerde sequencing methode.
Conclusies
- Fout-gecorrigeerde sequencing verbetert de gevoeligheid van mutatiedetectie aanzienlijk.
- De methode is toepasbaar in klinische en onderzoeksomgevingen voor genomische analyse.
- Verdere studies zouden het gebruik ervan kunnen uitbreiden in het detecteren van zeldzame genetische varianten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Error-corrected sequencing (ECS) addresses a critical limitation in next-generation sequencing by reducing error rates to enable detection of mutations at variant allele fractions as low as 0.0001. This capability supports early detection of pre-leukemic clones and minimal residual disease monitoring in hematological malignancies, directly impacting therapeutic decision-making and patient stratification in oncology drug development. By providing quantitative, reproducible detection of rare clonal variants, ECS enhances predictive confidence in target validation and biomarker discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting clonal somatic mutations at ultra-low frequencies, supporting biological de-risking of putative cancer targets.
- Operational Value: Provides quantitative variant allele fraction measurements that clarify pathway involvement and functional relevance of genetic alterations in disease models.
- Predictive Value: Improves confidence in target prioritization by distinguishing true low-frequency mutations from sequencing artifacts, reducing false-positive leads in target validation campaigns.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, error-corrected libraries compatible with Illumina sequencing, enabling scalable screening of large gene panels for somatic variant discovery.
- Quantitative Output: Delivers precise variant allele fraction data that supports assay standardization and cross-laboratory reproducibility in mutation detection workflows.
- Platform Reuse: Facilitates multiplexed sample processing via patient-specific indices, increasing throughput and reducing per-sample cost in large-scale genotyping efforts.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to monitoring minimal residual disease in leukemia patients post-treatment, aligning with clinically relevant endpoints in preclinical efficacy studies.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase mutation detection with preclinical validation through quantitative tracking of clonal dynamics over time.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing sensitive detection of emergent resistant clones during preclinical therapy studies.
Pipeline & Workflow Integration
ECS fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, particularly in hematologic malignancy models where clonal evolution informs therapeutic response.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling sensitive detection of pre-leukemic clones in healthy donor samples, clarifying origins of malignancy.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative sequencing data with high reproducibility, facilitating reliable compound screening in genetically defined models.
- Analytics: Generates precise variant allele fraction measurements and digital droplet PCR-validated outputs that allow accurate comparison of mutant burden across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through monitoring of minimal residual disease, a key biomarker in leukemia therapeutic development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable genotyping capability for longitudinal tracking of clonal dynamics across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in mutation detection, increasing confidence in genetic biomarkers and therapeutic targets.
- Operational Value: Standardizes library preparation with unique molecular identifiers, improving reproducibility and reducing batch effects in sequencing data.
- Strategic Value: Enables earlier, more confident go/no-go decisions by detecting resistance mutations at clinically relevant thresholds, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of drug candidates based on sensitivity to detect emergent clonal variants in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular library preparation, PCR optimization, and digital droplet PCR validation for accurate rare variant detection.
- Depends on access to high-fidelity polymerases, magnetic bead purification systems, and droplet generation instrumentation for library processing.
- Necessitates cross-team standardization of index design and PCR cycle numbers based on gene panel complexity to ensure multiplexing compatibility.
- Involves adaptation considerations when applying the method to RNA sequencing or fusion transcript detection beyond DNA-based variant calling.
- Involves practical limitations related to input DNA quality and quantity, as low-yield samples may require increased PCR cycles that could introduce bias.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:33
Incorporating i5 and i7 Adapters onto Error-corrected Sequencing Libraries
3:36
Quantifying the Libraries with QX200 Digital Droplet PCR (ddPCR)
6:14
Amplifying and Normalizing the Libraries for Sequencing
7:37
Results: Mutation-calling with Error-corrected Sequencing (ECS)
9:14
Conclusion
