Name: De Lambda Selecteer cII mutatie detectiesysteem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Leer het Lambda Select cII mutatie-assay uit te voeren voor mutageniteitstesten in gekweekte cellen van transgene knaagdieren. Deze methode helpt onderzoekers om de mutagene potentie van chemische en fysische stoffen te bepalen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij willen erkennen van de bijdragen van alle collega's en medewerkers aan onze oorspronkelijke studies, waarvan de resultaten naar zijn verwezen in dit manuscript (ter illustratie). De auteurs werk wordt ondersteund door subsidies van het nationale Instituut van tand- en craniofaciale onderzoek van de National Institutes of Health (1R01DE026043) aan AB en aan de University of California Tobacco-Related Disease Research Program aan AB) TRDRP-26IR-0015) en de ST (TRDRP-25IP-0001). De sponsors van de studie had geen rol in de studie ontwerp, dataverzameling, data-analyse, data interpretatie, schrijven van het verslag, of in het besluit tot het indienen voor publicatie.

1. Genomisch DNA isolatie van muis embryonale fibroblasten
Opmerking: Primaire muis embryonale fibroblasten zijn geïsoleerd uit embryo's die zijn afgeleid van BB transgene muizen met C57BL/6 genetische achtergrond, volgens de gepubliceerde protocol53. De grondstof voor dit protocol bestaat uit 1 x 10,6 tot en met 1 x 107 embryonale fibroblast cellen met een test samengestelde versus controle behandeld. Het oogsten en tellen van deze cellen met standaardmethoden worden beschreven in verwijzingen10,54,55.
<ol><li>Bereiden buffer een (0,3 M sacharose, 60 mM KCl, 15 mM NaCl, 60 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.5 mM spermidine, 0,15 mM spermine en 2 mM EDTA), B (150 mM NaCl en 5 mM EDTA, pH 7,8) buffer en buffer C (20 mM Tris-HCl, pH 8,0 20 mM NaCl, 20 mM EDTA en 1% SDS) in opmars, en behouden bij kamertemperatuur (RT) voor maximaal één jaar54,55.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in 2-4 mL buffer A in een 15 mL conische centrifugebuis door herhaaldelijk op en neer met behulp van een breed pipetteren droeg 1.000 µL pipette uiteinde.</li>
	<li>Toevoegen van een volume (2-4 mL) buffer A met 1% octylphenoxypolyethoxyethanol (b.v.Nonidet P40) met behulp van een glazen serologische pipet.</li>
	<li>Incubeer de buis op ijs gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Centrifugeer de buis bij 1.000 x g gedurende 5 min op RT.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en wassen van de pellet met 10 – 15 mL buffer een met behulp van een glazen serologische pipet.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in 2-4 mL buffer B.</li>
	<li>Toevoegen van een volume (2-4 mL) buffer C met 600 µg/mL proteïnase K.</li>
	<li>Incubeer de buis gedurende 3 uur bij 37 ° C.</li>
	<li>RNase A toevoegen om een eindconcentratie van 100 µg/mL.</li>
	<li>Incubeer de buis gedurende een extra 1 uur bij 37 ° C.</li>
	<li>Toevoegen van een volume (2-4 mL) fenol (verzadigd in 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0):chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1 vol/vol). Opmerking: Fenol kan vormen een ernstig gezondheidsrisico en moet met extreme voorzichtigheid worden behandeld. Fenol is zeer corrosief voor de huid en gemakkelijk geabsorbeerd door het, en andere effecten vertoont. Behandeling van fenol, altijd gebruik maken van dubbele handschoenen, beschermende brillen dragen als werken in een chemische zuurkast.</li>
	<li>Meng goed door het omkeren van de buis gedurende 5 minuten op een buis rotator bij 4 ° C.</li>
	<li>Centrifugeer de buis bij 1.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.</li>
	<li>Verwijder de waterige fase (toplaag) aan een nieuwe buis met behulp van een glazen serologische pipet.</li>
	<li>Herhaal fenol: chloroform: isoamyl alcohol extractie 1 tot 3 keer de waterfase is duidelijk en de interface is niet langer troebel.</li>
	<li>Voeg 1/10 volume (200-400 µL) 3M Natriumacetaat, pH 5.2.</li>
	<li>Voeg 2.5 volume (5-10 mL) 100% ethanol (gekoeld) en omkeren van de tube zachtjes met de hand voor 2-3 min.</li>
	<li>Het DNA met een glas haak in de wachtrij geplaatst en overbrengen naar een nieuwe buis met 1 – 5 mL 70% Ethanol en grondig wassen. Als alternatief, de buis op hoge snelheid (3.500 x g) Centrifugeer bij 4 ° C tot het DNA pellet en wassen het grondig met 1 – 5 mL 70% Ethanol.</li>
	<li>Centrifugeer de buis op hoge snelheid (3.500 x g) bij RT, verwijder het supernatant en het DNA voor 10-15 minuten drogen.</li>
	<li>Los van het DNA in 10 – 100 µL TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) en sla bij 4 ° C (voor korte-opslag van maximaal één maand) of bij-20 ° C (voor langere duur van de opslag). De optimale concentratie voor DNA voor de λ Select cII assay is 0.5 – 1.0 µg/µL (in TE de buffer)56.</li>
</ol>2. in Vitro de reactie van de verpakking
<ol><li>Per één verpakking reactie toevoegen ~ 5 µg genomic DNA (eindvolume: 8-12 µL, genomic DNA werd geïsoleerd in sectie 1 van muis embryonale fibroblasten behandeld in vitro met een teststof of besturingselement) tot een koker van de microcentrifuge met de eerste reactie mix (~ 10 µL). Opmerking: In-house bereid of verkrijgbare λ verpakking extracten worden gebruikt in verschillende laboratoria. In de commerciële verpakking extract kit gebruikt hier56 (Zie de Tabel van materialen), rode buizen bevatte de eerste reactie mix (~ 10 µL) en blauwe buizen bevatte de tweede reactie mix (~ 70 µL voor ten minste 5 reacties).</li>
	<li>Incubeer de buis gedurende 90 minuten bij 30 ° C.</li>
	<li>Voeg het vereiste volume (~ 12 µL) van de tweede reactie mix aan de buis.</li>
	<li>Incubeer de buis voor een extra 90 min bij 30 ° C.</li>
	<li>
1.1 aantal milliliters SM buffer toevoegen aan de buis. Opmerking: 1 mL van deze oplossing (dat wil zeggen, verpakking reactiemengsel) zal worden gebruikt voor het screenen van λ cII-mutanten. De rest zal worden gebruikt voor titering.<ol>
<li>Bereid SM buffer door het mengen van 5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4.7H2O, 50 mL 1 M Tris-HCl (pH 7.5) en 5 mL 2% (g/v) gelatine. DH2O toevoegen aan een eindvolume van 1 liter, autoclaaf voor 30 min. winkel bij kamertemperatuur voor tot 1 jaar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vortex de buis met de verpakte DNA-monster voor 10 s bij RT (krachtige vortexing).</li>
	<li>Pols draaien de buis in een microcentrifuge en winkel op ijs tot klaar voor gebruik. Als het monster niet worden gebruikt binnen dezelfde dag van verpakking gaat, voeg 50 µL van chloroform per mL verpakt DNA monster, vortex zachtjes, en bewaren bij 4 ° C voor maximaal 2 weken.</li>
</ol>3. voorbereiding van de E. coli G1250 bacteriecultuur
<ol><li>
Ten minste twee dagen vóór de beplating, maak een paar platen van bacteriële streak van Escherichia coli (E. coli) G1250 op TB1-kanamycine agar platen.
	<ol>
<li>TB1-kanamycine agar platen als volgt voorbereiden. Meng 5.0 g 12.0 g NaCl en 10,0 g caseïne-pepton-agar. 800 mL dH2O. Add 1 mL 0,1% Thiamine hydrochloride toevoegen. Breng pH op 7.0 met NaOH of HCl. toevoegen dH2O tot een eindvolume van 1 liter.</li>
		<li>Meng goed en autoclaaf voor 30 min. toestaan afkoelen tot 55 ° C. Voeg 50.0 mg kanamycine en meng. Giet in petrischalen steriel 100 mm (20-25 mL per schotel). Opslaan platen bij 4 ° C voor maximaal twee weken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubeer de platen van de bacteriële streak in een incubator stationaire 30 ° C gedurende ten minste 24 uur.</li>
	<li>
Een dag voordat plating, combineren TB1 vloeistof 10 mL met 100 µL van 20% (m/v) maltose-1 M MgSO4 -oplossing in een steriele 50 mL schroefdop conische buis.
	<ol>
<li>TB1 opgietvloeistof als volgt voorbereiden. Mix 5.0 g NaCl en 10,0 g caseïne pepton, dan toevoegen van 800 mL dH2O, 1 mL 0,1% Thiamine hydrochloride, en breng de pH op 7.0 met NaOH of HCl. Voegt u dH2O tot een eindvolume van 1 liter, meng goed, en de autoclaaf voor 30 min. winkel het medium op RT voor maximaal drie maanden.</li>
		<li>20% (m/v) Maltose-1 M MgSO4 als volgt voorbereiden. Meng 20,0 g Maltose en 24.6 g MgSO4. DH2O toevoegen 7H2O, vervolgens aan een eindvolume van 100 mL. Filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C voor maximaal 6 maanden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beënt de vloeistof met verschillende kolonies van de bacteriële streak plaat met behulp van een steriele inoculating lus56.</li>
	<li>Incubeer de vloeibare cultuur overnachting in een 30 ° C incubator schudden met krachtig schudden (250-300 rpm).</li>
	<li>Centrifugeer op de dag van de beplating, de conische buis met de G1250 vloeibare cultuur bij 1.500 x g gedurende 10 minuten op RT om de bacteriecellen pellet.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 10 mL 10 mM MgSO4.</li>
	<li>Meet de extinctie van een 1:10 verdunning van de celsuspensie op golflengte 600 nm met behulp van een UV-Vis spectrofotometer (bijvoorbeeld, 100 µL celsuspensie + 900 µL 10 mM MgSO4)56.</li>
	<li>Verdun de celsuspensie tot een definitieve OD600 van 0,5 met 10 mM MgSO4. De bereid schorsing van G1250, E. coli met OD600 = 0,5 wordt aangeduid als 'de G1250 plating-cultuur'.</li>
	<li>Sla de G1250 plating cultuur op ijs en gebruiken binnen 1-2 uur.</li>
</ol>4. plating de verpakte DNA-monsters
<ol><li>
Per één verpakt DNA-monster, bereiden zestien steriele 14 x 100 mm2 ronde onderkant buizen en zestien TB1 agar platen. Tien uit elke verzameling zal worden gebruikt voor de screening en zes voor titering (drie voor Titer 20) en drie voor Titer 100.
	<ol>
<li>TB1 agar platen als volgt voorbereiden. Mix 5.0 g NaCl, 10,0 g caseïne pepton en 12.0 g Agar, vervolgens toevoegen 800 mL dH2O en 1 mL 0,1% Thiamine hydrochloride. Breng de pH op 7.0 met NaOH of HCl en dH2O toevoegen aan een eindvolume van 1 L.</li>
		<li>Meng goed en autoclaaf voor 30 min. laat het mengsel afkoelen tot 55 ° C, dan giet het in steriele 100 mm petrischalen (20-25 mL per schotel). Bewaar de platen bij 4 ° C voor maximaal twee weken. Opmerking: TB1 agar platen moeten bereid zijn ten minste 24 uur vóór gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aliquot 200 µL van de cultuur van de beplating G1250 in elke ronde-onderkant-buis.</li>
	<li>
Voor titering, vul een verdunning van de 1:100 van het verpakte DNA-monster en meng goed door de vortexing (dat wil zeggen, 10 µL verpakt DNA-monster + 990 µL SM buffer).</li>
	<li>Voeg 20 µL van de verdunning 1:100 aan elk van de drie Titer 20 buizen.</li>
	<li>Voeg 100 µL van de verdunning 1:100 aan elk van de drie Titer 100 buizen.</li>
	<li>
Voor screening, voeg 100 µL van de 'onverdund ' verpakt DNA-monster aan elk van de tien screening buizen.</li>
	<li>Verwerken van alle titering en screening buizen (2 x 3 + 10 = 16 buizen), als volgt: Meng goed door de vortexing voor ongeveer 10 s, en vervolgens uit te broeden bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten wilt toestaan dat de host E. coli te adsorberen de bacteriofagen.</li>
	<li>
Toevoegen van 2.5 mL magnetron gesmolten TB1 agar (gekoeld tot 55 ° C) van boven naar elke titer of screening buis, onmiddellijk meng door vortexing (zachtjes), en gieten in de passende titer of screening TB1 agar platen.
	<ol>
<li>De bovenste agar TB1 als volgt voorbereiden. Mix 5.0 g NaCl, 10,0 g caseïne pepton en 7.0 g Agar, 800 mL dH2O. Add 1 mL 0,1% Thiamine hydrochloride toevoegen, vervolgens op pH 7.0 met NaOH of HCl. Tot slot wil dH2O een eindvolume van 1 liter.</li>
		<li>Meng goed en autoclaaf voor 20-25 min. winkel bij kamertemperatuur voor maximaal drie maanden.</li>
		<li>Voorafgaand aan het gebruik, de bereid TB1 top agar in een magnetron te smelten, meng goed en laat afkoelen tot 55 ° C in een waterbad. Opmerking: De gesmolten en gekoeld TB1 bovenkant wordt toegevoegd aan de inhoud van elke titer of screening buis, en na mengen wordt gegoten in de passende titer of screening TB1 agar platen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laat de platen staan gedurende 15 tot 30 minuten bij kamertemperatuur, met het deksel kier om condensatie te voorkomen.</li>
	<li>Omkeren van de platen en plaats van de tien screening platen in een stationaire 24 ° C incubator en incubeer gedurende 46-48 h (d.w.z., selectieve voorwaarden) en de zes titer platen in een stationaire 37 ° C incubator en incubeer gedurende 24u/overnachting (dat wil zeggen, niet-selectieve voorwaarden). Opmerking: Voor quality assurance en standaardisatie van resultaten, verkrijgbare besturingsoplossingen faag met een mengsel van wildtype en mutant cII met bekende mutantfrequentie zijn vergulde naast de verpakte DNA-monsters en opgenomen in alle assay loopt56.</li>
</ol>5. het onderzoek van de Titer en platen Screening om te bepalen van de cII Mutant frequentie
<ol><li>Na de 24 h/overnachting incubatie bij 37 ° C, tellen het aantal plaques gevormd in elk van de drie Titer 20 platen en de Titer-100 platen. Als u wilt meer gemakkelijk identificeren de plaques, houd de plaat naast een witte lichtbak en tegen een donkere achtergrond met deksel verwijderd (Zie Figuur 2).</li>
	<li>Make een gemiddelde van het aantal plaques geteld in elke set Titer 20 platen en Titer 100 platen (triplicate, elk).</li>
	<li>Kies het gemiddelde aantal uit de set van titer platen die zich het dichtst bij het bereik van 50 tot 200 platen per plaat set valt.</li>
	<li>Het totale aantal plaques vertoond in de tien screening platen als volgt berekenen: Total plaques gescreend = (gemiddelde aantal plaques in de gekozen set van titer platen ÷ aantal µL van verdunning per gekozen titer plaat gebruikt) x verdunningsfactor x aantal µL van verpakte DNA-monster per screening plate [100 µL/plaat] x aantal screening platen [10]. Opmerking: bijvoorbeeld, als het gemiddelde aantal platen per plaat in de set van Titer 20 platen 128 is en het bijbehorende nummer in de reeks van de Titer 100 platen 478 is, het nummer 128 zal worden gebruikt voor de berekening van het totale aantal plaques gescreend , als volgt: (128 ÷ 20) x 100 [verdunningsfactor] x 100 [µL/plaat] x 10 [platen] = 640,000 Dit is gelijk aan het gemiddelde aantal plaques te vermenigvuldigen met 5000 of 1000, als het gemiddelde aantal is gebaseerd op de graven van de Titer 20 platen of Titer 100 platen, respectievelijk.</li>
	<li>Na 46-48 h incubatie bij 24 ° C, count het totale aantal plaques gevormd in de platen van de tien screening (volg de instructies in hoofdstuk 5.1). Opmerking: De cII mutantfrequentie wordt berekend door het totale aantal plaques gevormd in de screening platen door het totale aantal plaques gescreend. Met behulp van het bovenstaande voorbeeld, indien het totale aantal plaques geteld in de tien screening-platen is 112, de cII mutantfrequentie voor dit DNA-monster zou 112 ÷ 640,000 = 17,5 x 10-5.</li>
</ol>6. verificatie van de Putative λ cII mutanten, PCR versterking en DNA Sequencing
<ol><li>Kern van de plaque in kwestie met een steriele, wide-boring Pipetteer tip en verdrijven het (door op en neer pipetteren) in een buis van de steriele microcentrifuge met 500 µL van steriele SM buffer.</li>
	<li>Incubeer gedurende ten minste 2 uur bij kamertemperatuur of bij 4 ° C's nachts, zodat de phage deeltjes te elueren van de agar sluit.</li>
	<li>In een steriele 14 x 100 mm2 ronde onderkant buis, meng 200 µL van de cultuur van de beplating G1250 met 1 µL van de gevulde faag-oplossing, en incubeer gedurende 30 min op RT.</li>
	<li>Plaat van het monster met behulp van 2.5 mL 55 ° C gesmolten TB1 top agar en Incubeer de plaat bij 24 ° C gedurende 46-48 h (selectieve voorwaarden), zoals beschreven in secties 4.8 – 4.10.</li>
	<li>Nadat u de secundaire plaques hebben gevormd, met een pipet tip zorgvuldig kiezen een enkele goed geïsoleerde geverifieerde λ cII-mutant plaque (raak de lagere agar). Opmerking: De vermeende cII mutant plaques Replating dient twee doeleinden: (i) plating artefacten kan soms worden verward klein-formaat platen; en (ii) een agarose kern ontleend aan een screening plaat niet-mutant phage(s) samen met een mutant bacteriofaag kan bevatten. Secundaire plaques van een lage dichtheid replating zal voorzien in een niet-verontreinigde mutant sjabloon PCR en latere DNA sequentieanalyse.</li>
	<li>De plaquette overbrengen in een microcentrifuge buis 25 µL tweemaal gedestilleerd water bevattende pipetteren omhoog en omlaag.</li>
	<li>Plaats de buis in kokend water gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Centrifugeer bij maximumsnelheid (18.000 x g) gedurende 3 minuten op RT.</li>
	<li>10 µL van het supernatans dat onmiddellijk overbrengen in een nieuwe microcentrifuge buis met 40 µL van een PCR mastermix waarin de eindconcentraties van de reagentia zijn 1 x Taq PCR buffer, 10 pmol elk van de voorwaartse en omgekeerde inleidingen, 12,5 nmol van elke dNTP , en 2.5 U van Taq polymerase van DNA. Opmerking: De voorwaartse en omgekeerde inleidingen zijn als volgt: 5'-CCACACCTATGGTGTATG-3' (posities-68 tot -50 ten opzichte van de cII start codon) en 5'-CCTCTGCCGAAGTTGAGTAT-3' (standpunten +345 aan +365 ten opzichte van de cII start codon), respectievelijk.</li>
	<li>Versterken van de sjabloon met behulp van de volgende fietsen parameters: een 3 min denaturatie bij 95 ° C, gevolgd door 30 cycli van 30 bij 95 ° C, 1 minuut bij 60 ° C, s en 1 min bij 72 ° C, met een definitieve verlenging van 10 minuten bij 72 ° C.</li>
	<li>Zuiveren het 432 bp PCR product met de cII -gen en flankerende gebieden met behulp van commercieel beschikbare PCR reiniging kits, volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>DNA sequencing met behulp van een platform van de juiste volgorde uitvoeren en analyseren van de resulterende DNA-sequenties te sporen van mutaties in de cII transgenic (Zie de onderstaande opmerking). Opmerking: Dit wordt best bereikt door uitlijning met de verwijzing cII volgorde met behulp van software, zoals de web gebaseerde T-Coffee reeks uitlijning server. Voor instructies over hoe het programma te gebruiken, bezoek: <a href="http://tcoffee.crg.cat/">http://tcoffee.crg.cat/</a>
</li>
</ol>

Alle auteurs verklaren geen belangenconflict.

De λ Select cII bepaling wordt gebruikt voor de detectie van mutaties in de cII transgenic verhaald aan de genomic DNA van cellen uit organen/weefsels van BB knaagdieren3verkregen. Het genoom van deze transgene dieren bevat meerdere exemplaren van de tandem van de shuttle-vector inplanten geïntegreerde λLIZ, die de cII draagt (294 bp) en lacI (1.080 bp) transgenen, als het vogelgriepvirus reporter genen1, 2</s...

Een breed scala van transgene diermodellen en mutatie detectiesystemen zijn ontwikkeld voor het testen van de mutageniteit van kankerverwekkende stoffen in zoogdiercellen. Van deze hebben transgene muizen van de Big Blue (genoemd hierna BB) en de λ Select cII mutatie detectiesysteem gewerkt voor mutageniteit experimenten door deze groep en vele andere onderzoek groepen wereldwijd1,2, 3,4,5,6,7,8,9. Voor de afgelopen 16 jaar, hebben we onderzocht de mutagene effecten van verschillende chemische en/of fysische agentia met behulp van deze transgene dieren of hun overeenkomstige embryonale fibroblast celculturen behandeld met een teststof en vervolgens geanalyseerd de fenotype en genotype van de cII transgenic door de λ Select cII assay en DNA sequencing, respectievelijk10,11,12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. het genoom van deze transgene dieren bevat een bacteriofaag lambda shuttle vector (λLIZ) geïntegreerd op chromosoom 4 als een multicopy hoofd-tot-staart concatemer1,2,25. De vector λLIZ shuttle draagt twee vogelgriepvirus reporter genen, namelijk de lacI en cII transgenen1,2,25,26,27, 28,29,30,31,32,33,34,35,,36, 37,38,39,40,41,42,43,44,45 , 46 , 47. de λ Select cII bepaling is gebaseerd op het herstel van de λLIZ shuttle vectoren van de genomic DNA van cellen afgeleid van organen/weefsels van transgene dieren1,2,25 . De herstelde λLIZ shuttle vectoren worden vervolgens verpakt in lambda phage hoofden kunnen infecteren een indicator host Escherichia coli. Vervolgens worden de geïnfecteerde bacteriën gekweekt in selectieve omstandigheden kunnen scoren en analyse van mutaties in de cII transgenic1,3.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de λ Select cII assay, die uit de isolatie van genomic DNA uit cellen/organen van transgene dieren behandeld in vitro bestaat/in vivo met een samengestelde, ophalen van de test van de λLIZ shuttle vectoren van de genomic DNA, verpakking van de vectoren in infectieuze λ bacteriofagen, infectie van de gastheer E. coli met de bacteriofagen, identificatie van de cII-mutanten in selectieve omstandigheden om te bepalen van de mutantfrequentie cII , en DNA sequentieanalyse ervoor zorgen dat het spectrum van de mutatie cII . Het protocol kan worden toegepast op transgene muis/rat cel culturen behandeld in vitro met een chemische/fysieke agent van belang, of weefsels/organen van de overeenkomstige dieren behandeld in vivo met de test chemische/agent1, 2,4,48,49,50,51,52. Een schematische voorstelling van de λ Select cII assay is afgebeeld in Figuur 1.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>MO Bio Laboratories, Inc.</td><td>12112-05</td><td>Bacteriologisch graad</td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4337455</td><td>Geen</td></tr><tr><td>Caseïne Pepton</td><td>Alfa Aesar</td><td>H26557</td><td>Geen</td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>J. T. Baker</td><td>2124-01</td><td>Poeder</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 229-1 / M-13750</td><td>Geen</td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 9724-500</td><td>Geen</td></tr><tr><td>QIAquick PCR-zuiveringskit</td><td>Qiagen</td><td>8104</td><td>50 PCR-zuiveringsreacties</td></tr><tr><td>Natriumacetaat Trihydraat</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-15756</td><td>Geen</td></tr><tr><td>Taq5000 DNA Polymerase&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>201207</td><td>Geen</td></tr><tr><td>Thiamine Hydrochloride</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>2722-57</td><td>Geen</td></tr><tr><td>Transpack Packaging Extract</td><td>Stratagene Corp., Overgenomen door BioReliance | Sigma-Aldrich Corp.</td><td>200223</td><td>50 verpakkingsreacties</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 152-1 / EC 201-064-4</td><td>Geen</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Biosciences</td><td>RC-110</td><td>Geen</td></tr></tbody></table>

de lambda selecteer cii mutatie detectiesysteem

The Lambda Select cII Mutation Detection System

Een aantal transgene diermodellen en mutatie detectiesystemen zijn ontwikkeld voor het testen van de mutageniteit van kankerverwekkende stoffen in zoogdiercellen. Van deze zijn transgene muizen en de Lambda (λ) Selecteer cII mutatie detectiesysteem tewerkgesteld voor mutageniteit experimenten door veel onderzoeksgroepen wereldwijd. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de Lambda Selecteer cII mutatie assay, die kan worden toegepast op gekweekte cellen van transgene muizen/ratten of de overeenkomstige dieren behandeld met een chemische/fysieke agent van belang. Het protocol bestaat uit de volgende stappen: (1) isolatie van genomic DNA van de cellen of organen/weefsels van transgene dieren behandeld in vitro of in vivo, respectievelijk een teststof; (2) herstel van de lambda shuttle vector uitvoering een vogelgriepvirus verslaggever-gen (dat wil zeggen, cII transgenic) uit de genomic DNA; (3) de verpakking van de geredde vectoren in infectieuze bacteriofagen; (4) een host bacteriën infecteren en kweken in selectieve omstandigheden dat verspreiding van de geïnduceerde cII mutaties; en (5) scoren de cII-mutanten en DNA-sequentie analyse om te bepalen van de cII mutantfrequentie en mutatie spectrum, respectievelijk.

Afhankelijk van de Gegevensdistributie, worden parametrische of niet-parametrische tests gebruikt om te bepalen van de significantie van het verschil in de cII -mutantfrequentie tussen behandeling en controlegroepen (d.w.z., geïnduceerde versus spontane mutant frequenties) . Vergelijking van de frequenties geïnduceerde cII mutant over verschillende behandelgroepen is gemaakt door diverse (paarsgewijze) statistische toetsen, naargelang van toepassing. De hypergeo...

Beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de Lambda Selecteer cII mutatie assay in gekweekte cellen van transgene knaagdieren of de overeenkomstige dieren behandeld met een chemische/fysieke agent van belang. Deze aanpak heeft wijd gebruikt voor het testen van de mutageniteit van kankerverwekkende stoffen in zoogdiercellen.

De Lambda Selecteer cII mutatie detectiesysteem

A number of transgenic animal models and mutation detection systems have been developed for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells. Of ...

Het algemene doel van dit protocol is om stapsgewijze procedures te visualiseren die betrokken zijn bij de Lambda Select cII mutatietest in gekweekte cellen van transgene knaagdieren of de bijbehorende dieren die zijn behandeld met chemische en fysische middelen van belang. Deze testmethode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van mutatieonderzoek, zoals, is een testverbinding mutageen? En zo ja, hoe krachtig is het als mutageen?Induceert het sequentie-specifieke mutaties? Het grote voordeel van deze techniek is dat het minimaal tot vrijwel elke testverbinding is. De methode kan worden gebruikt voor mutageniciteitstesten in zoogdiercellen met behulp van een chromosomaal geïntegreerd reportergen.Voeg voor een enkele verpakkingsreactie vijf microgram genomisch DNA toe in een microcentrifugebuisje met de eerste reactiemix. Bewaar de buis vervolgens 90 minuten op 30 graden Celsius. Voeg na de incubatie 12 microliter van de tweede reactiemix toe aan de buis en laat deze nog eens 90 minuten op 30 graden Celsius staan.Na 90 minuten voegt u 1,1 milliliter SM-buffer toe aan de buis. Roer vervolgens de buis krachtig met het verpakte DNA bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 10 seconden. Geef snel een pulsspin in de microcentrifuge.Laat de buis vervolgens op ijs staan tot gebruik. Voeg vervolgens 50 microliter chloroform toe voor elke milliliter verpakt DNA. Als het monster niet dezelfde dag wordt verwerkt, roer het monster voorzichtig en bewaar het tot twee weken op vier graden Celsius.Bereid 16 steriele buisjes met ronde bodem en 16 TB1-agarplaten voor een enkel verpakt DNA-monster. Gebruik tien buisjes voor screening en zes voor titratie. Pipetteer vervolgens 300 microliter van de G1250-kweekcultuur in elk buisje met ronde bodem.Voeg vervolgens 10 microliter verpakt DNA toe aan 990 microliter SM-buffer en een 1:100-verdunning om te titreren. Roer het monster vervolgens. Voeg 20 of 100 microliter van de 1:100 DNA-oplossing toe aan elk van de drie titratie 20 of titratie 100 buisjes.Voeg voor screeningdoeleinden 100 microliter van de onverzegelde verpakte DNA-oplossing toe aan elk van de 10 screeningbuisjes. Verwerk alle 16 titratie- en screeningbuisjes. Roer de buisjes gedurende 10 seconden om de componenten te mengen.Incubeer vervolgens de buisjes 30 minuten bij kamertemperatuur om de gastheer E.coli de fagen te laten absorberen. Voeg vervolgens 2,5 milliliter gesmolten TB1-topagar toe. Houd de 55 graden Celsius vast voor de juiste titratie- en screeningbuisjes.Voor het toevoegen, roer de buisjes onmiddellijk voorzichtig. Giet nu de TB1-agar in de juiste titratie- of screening-TB1-agarplaat. Laat de platen 15 tot 30 minuten bij kamertemperatuur staan.Zodra de agar is gestold, draai en laat alle 10 screeningplaten 46 tot 48 uur in een stationaire incubator bij 24 graden Celsius staan. Laat de resterende zes titratieplaten een nacht of een dag in een stationaire incubator bij 37 graden Celsius staan. Tel na de incubatie bij 37 graden Celsius het aantal plaques gevormd in alle 3 titratie 20 en titratie 100 platen.Tel na de incubatie bij 24 graden Celsius het aantal plaques gevormd in de 10 screeningplaten. Om de vermeende mutante plaques te verifiëren, neem een kernmonster van de plaque met een steriele, breed-bore pipettepunt. Breng vervolgens de plaque over naar een steriele microcentrifugebuis gevuld met 500 microliter steriele SM-buffer.Incubeer vervolgens de microcentrifugebuis gedurende ten minste twee uur bij kamertemperatuur. Meng vervolgens één microliter van de gekernde fagenoplossing met 200 microliter van de G1250-kweekcultuur in een steriele buis met ronde bodem. Roer het mengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.Plateer na 30 minuten de gekernde fagenoplossing in 2,5 milliliter gesmolten TB1-topagar en incubeer gedurende 46 tot 48 uur bij 24 graden Celsius. Zodra de secundaire plaques zichtbaar zijn, gebruikt u een pipettepunt om een enkele, goed geïsoleerde Lambda cII-mutante plaque te plukken. Breng de plaque over naar een microcentrifugebuis gevuld met 25 microliter dubbel gedestilleerd water en pipet meerdere keren.Laat de buis vijf minuten op kokend water staan. Centrifugeer vervolgens de buis gedurende drie minuten bij 18.000 keer G bij kamertemperatuur. Direct na centrifugatie brengt u 10 microliter van het supernatant over naar een nieuwe microcentrifugebuis met 40 microliter van de PCR-mastermix.Na PCR-amplificatie zuivert u het 432 base para-versterkte product met het cII-gen en de flankerende regio's ervan met behulp van de PCR-zuiveringskit. Sequence vervolgens het cII-transgen met behulp van een DNA-analyzer om de mutaties te detecteren. De plaques verkregen in zowel de titratie 20 als de titratie 100 platen zijn duidelijk zichtbaar door ze naast een witte lichtbox en tegen een donkere achtergrond te houden.Hier geeft de staafgrafiek de mutagene potentie van verschillende chemicaliën in de fysische verbindingen weer die zijn getest. Dit gebeurt door de mate van toename in de relatieve cII-mutantefrequentie geïsoleerd uit de embryonale vezelblasten van muizen te analyseren. De staafgrafiek toont alle testreagentia die een statistisch significante voudige toename in de cII-mutantefrequentie laten zien.Vervolgens wordt het mutatiespectrum van het cII-transgen in de embryonale vezelblasten van muizen gedemonstreerd die zijn bestraald met UVB. De cirkeldiagram toont een significante toename in de relatieve frequentie van enkele of tandem cytidine naar thymidine transitie op pyrimidinedinucleotiden in vergelijking met de controle. Als deze techniek eenmaal onder de knie is, kan deze in acht tot tien uur worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd, exclusief voorbereidingstijden voor bacteriële streakplate bij het kweken.Na DNA-sequencing,

the-lambda-select-cii-mutation-detection-system

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Hier laten we zien een eenvoudig protocol om een ​​willekeurige mutant bibliotheek te creëren voor een bepaalde doelsequentie. We laten zien hoe deze methode, die in vivo uitgevoerd in Escherichia coli, kan worden gecombineerd met functionele selecties van nieuwe enzymatische activiteiten evolueren.

Mutagenese en functionele selectie Protocollen voor Gerichte ontwikkeling van eiwitten in E. coli</em

This video demonstrates the role of digital droplet polymerase chain reaction in identifying indel mutation in a DNA sample. The high precision and sensitivity of ddPCR enable accurate and consistent detection of rare mutations present in a sample, even at low levels. It can identify and quantify indel mutations in different regions of the genome, providing valuable insights into the mechanisms of mutation and the functional consequences of these mutations.

Digital Droplet Polymerase Chain Reaction for Indel Mutation Detection in Target Genes

Hier beschrijven we een in vivo mutagenese test voor kleine aantallen hematopoietische cellen gezuiverd met de Lacl transgene muismodel. De Lacl gen kan worden geïsoleerd om de frequentie, locatie en soort DNA mutanten spontaan ontstaan ​​of na blootstelling aan genotoxinen bepalen.

Het identificeren van DNA-mutaties in Gezuiverd hematopoietische stamcellen / progenitorcellen

Dit manuscript beschrijft een techniek voor het opsporen van mutaties van lage frequentie in ctDNA, ER-Seq. Deze methode is onderscheiden zich door het unieke gebruik van twee-directionele foutcorrectie, een speciale achtergrond filter en efficiënte moleculaire verwerving.

Detectie van zeldzame mutaties in CtDNA met behulp van de volgende generatie Sequencing

Volgende-generatie rangschikken (NGS) is een krachtig hulpmiddel voor genomische karakterisering die wordt beperkt door het hoge foutenpercentage van het platform (~0.5–2.0%). Wij beschrijven onze methoden van fout-gecorrigeerde sequentie die ons toelaten te ondervangen van het NGS foutenpercentage en mutaties op variant allel breuken zo zeldzaam als 0,0001 detecteren.

Zeldzame gebeurtenis detectie met behulp van fout-gecorrigeerd DNA en RNA Sequencing

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het identificeren van homologe recombinatie gebeurtenissen die hebben plaatsgevonden in muis embryonale stamcellen met behulp van Southern blotting en/of PCR. Deze methode wordt geïllustreerd door de generatie van nonmuscle myosin II genetische vervanging Muismodellen met behulp van traditionele embryonale stamcel gebaseerde homologe recombinatie-gemedieerde targeting technologie.

Identificatie van homologe recombinatie gebeurtenissen in muis embryonale stamcellen met behulp van Southern Blotting en de Kettingreactie van de Polymerase

Kwantitatieve killer cel immunoglobuline-achtig receptor (KIR) semi-automatische te typen (qKAT) is een eenvoudige high-throughput en kosteneffectieve methode kopiëren nummer type KIR genen voor hun toepassing in de bevolking en ziekte vereniging studies.

qKAT: kwantitatieve Semi-automated te typen van Killer-cel immunoglobuline-achtig Receptor genen

Dit artikel introduceert de toepassing van een laagfrequente detectiemethode op basis van Sanger-sequencing bij angioimmunoblastisch lymfoom. Zorg voor een basis voor het toepassen van deze methode op andere ziekten.

Wild-type blokkerende PCR gecombineerd met Sanger-sequencing voor detectie van laagfrequente somatische mutatie

Dit protocol beschrijft een eenvoudige zelfklevende tape-gebaseerde aanpak voor de bemonstering van de tomaten en andere verse producten oppervlakken, gevolgd door een snelle volledige cel detectie...

Combinatie van Adhesive-tape-gebaseerde Sampling en fluorescentie In situ Hybridisatie voor snelle detectie van Salmonella Op Fresh Produce

We beschrijven een methode voor het verwerken en het scherm het veld verzameld muggen voor een diversiteit aan virussen door Vero celcultuur assay. Door gebruik te maken van deze techniek, hebben we ontdekt 9 verschillende virussen van vier taxonomische families in muggen verzameld in Connecticut.

Detectie van infectieus virus van Field-Muggen verzameld door Vero Cell Culture Assay

Leer het Lambda Select cII mutatie-assay uit te voeren voor mutageniteitstesten in gekweekte cellen van transgene knaagdieren. Deze methode helpt onderzoekers om de mutagene potentie van chemische en fysische stoffen te bepalen.

De Lambda Selecteer cII mutatie detectiesysteem

Meer video's verkennen