De Lambda Selecteer cII mutatie detectiesysteem

Het algemene doel van dit protocol is om stapsgewijze procedures te visualiseren die betrokken zijn bij de Lambda Select cII mutatietest in gekweekte cellen van transgene knaagdieren of de bijbehorende dieren die zijn behandeld met chemische en fysische middelen van belang. Deze testmethode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van mutatieonderzoek, zoals, is een testverbinding mutageen? En zo ja, hoe krachtig is het als mutageen?

Induceert het sequentie-specifieke mutaties? Het grote voordeel van deze techniek is dat het minimaal tot vrijwel elke testverbinding is. De methode kan worden gebruikt voor mutageniciteitstesten in zoogdiercellen met behulp van een chromosomaal geïntegreerd reportergen.

Voeg voor een enkele verpakkingsreactie vijf microgram genomisch DNA toe in een microcentrifugebuisje met de eerste reactiemix. Bewaar de buis vervolgens 90 minuten op 30 graden Celsius. Voeg na de incubatie 12 microliter van de tweede reactiemix toe aan de buis en laat deze nog eens 90 minuten op 30 graden Celsius staan.

Na 90 minuten voegt u 1,1 milliliter SM-buffer toe aan de buis. Roer vervolgens de buis krachtig met het verpakte DNA bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 10 seconden. Geef snel een pulsspin in de microcentrifuge.

Laat de buis vervolgens op ijs staan tot gebruik. Voeg vervolgens 50 microliter chloroform toe voor elke milliliter verpakt DNA. Als het monster niet dezelfde dag wordt verwerkt, roer het monster voorzichtig en bewaar het tot twee weken op vier graden Celsius.

Bereid 16 steriele buisjes met ronde bodem en 16 TB1-agarplaten voor een enkel verpakt DNA-monster. Gebruik tien buisjes voor screening en zes voor titratie. Pipetteer vervolgens 300 microliter van de G1250-kweekcultuur in elk buisje met ronde bodem.

Voeg vervolgens 10 microliter verpakt DNA toe aan 990 microliter SM-buffer en een 1:100-verdunning om te titreren. Roer het monster vervolgens. Voeg 20 of 100 microliter van de 1:100 DNA-oplossing toe aan elk van de drie titratie 20 of titratie 100 buisjes.

Voeg voor screeningdoeleinden 100 microliter van de onverzegelde verpakte DNA-oplossing toe aan elk van de 10 screeningbuisjes. Verwerk alle 16 titratie- en screeningbuisjes. Roer de buisjes gedurende 10 seconden om de componenten te mengen.

Incubeer vervolgens de buisjes 30 minuten bij kamertemperatuur om de gastheer E.coli de fagen te laten absorberen. Voeg vervolgens 2,5 milliliter gesmolten TB1-topagar toe. Houd de 55 graden Celsius vast voor de juiste titratie- en screeningbuisjes.

Voor het toevoegen, roer de buisjes onmiddellijk voorzichtig. Giet nu de TB1-agar in de juiste titratie- of screening-TB1-agarplaat. Laat de platen 15 tot 30 minuten bij kamertemperatuur staan.

Zodra de agar is gestold, draai en laat alle 10 screeningplaten 46 tot 48 uur in een stationaire incubator bij 24 graden Celsius staan. Laat de resterende zes titratieplaten een nacht of een dag in een stationaire incubator bij 37 graden Celsius staan. Tel na de incubatie bij 37 graden Celsius het aantal plaques gevormd in alle 3 titratie 20 en titratie 100 platen.

Tel na de incubatie bij 24 graden Celsius het aantal plaques gevormd in de 10 screeningplaten. Om de vermeende mutante plaques te verifiëren, neem een kernmonster van de plaque met een steriele, breed-bore pipettepunt. Breng vervolgens de plaque over naar een steriele microcentrifugebuis gevuld met 500 microliter steriele SM-buffer.

Incubeer vervolgens de microcentrifugebuis gedurende ten minste twee uur bij kamertemperatuur. Meng vervolgens één microliter van de gekernde fagenoplossing met 200 microliter van de G1250-kweekcultuur in een steriele buis met ronde bodem. Roer het mengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

Plateer na 30 minuten de gekernde fagenoplossing in 2,5 milliliter gesmolten TB1-topagar en incubeer gedurende 46 tot 48 uur bij 24 graden Celsius. Zodra de secundaire plaques zichtbaar zijn, gebruikt u een pipettepunt om een enkele, goed geïsoleerde Lambda cII-mutante plaque te plukken. Breng de plaque over naar een microcentrifugebuis gevuld met 25 microliter dubbel gedestilleerd water en pipet meerdere keren.

Laat de buis vijf minuten op kokend water staan. Centrifugeer vervolgens de buis gedurende drie minuten bij 18.000 keer G bij kamertemperatuur. Direct na centrifugatie brengt u 10 microliter van het supernatant over naar een nieuwe microcentrifugebuis met 40 microliter van de PCR-mastermix.

Na PCR-amplificatie zuivert u het 432 base para-versterkte product met het cII-gen en de flankerende regio's ervan met behulp van de PCR-zuiveringskit. Sequence vervolgens het cII-transgen met behulp van een DNA-analyzer om de mutaties te detecteren. De plaques verkregen in zowel de titratie 20 als de titratie 100 platen zijn duidelijk zichtbaar door ze naast een witte lichtbox en tegen een donkere achtergrond te houden.

Hier geeft de staafgrafiek de mutagene potentie van verschillende chemicaliën in de fysische verbindingen weer die zijn getest. Dit gebeurt door de mate van toename in de relatieve cII-mutantefrequentie geïsoleerd uit de embryonale vezelblasten van muizen te analyseren. De staafgrafiek toont alle testreagentia die een statistisch significante voudige toename in de cII-mutantefrequentie laten zien.

Vervolgens wordt het mutatiespectrum van het cII-transgen in de embryonale vezelblasten van muizen gedemonstreerd die zijn bestraald met UVB. De cirkeldiagram toont een significante toename in de relatieve frequentie van enkele of tandem cytidine naar thymidine transitie op pyrimidinedinucleotiden in vergelijking met de controle. Als deze techniek eenmaal onder de knie is, kan deze in acht tot tien uur worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd, exclusief voorbereidingstijden voor bacteriële streakplate bij het kweken.

Na DNA-sequencing,