Isolatie en karakterisatie van extracellulaire blaasjes van volwassen Schistosoma japonicum

Het algemene doel van deze procedure is om extracellulaire vesicles te isoleren uit het medium van in vitro gekweekte volwassen Schistosoma japonicum. Deze methode kan efficiënt EV isoleren in in vitro kweekmedium van volwassen Schistosoma japonicum. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het efficiënt extracellulaire vesicles kan isoleren uit kortdurend in vitro kweekmedium, wat de stress kan minimaliseren die mogelijk resulteert in niet-fysiologische EV-secretie.

De demonstratie zal worden uitgevoerd door Juntao Liu, een technicus uit mijn lab. Verzamel de parasieten in een beker van 500 milliliter en was ze grondig maar voorzichtig drie keer met 200 milliliter warm PBS. Houd de wasbeurten kort en gebruik zwaartekrachtsedimentatie om de parasieten te scheiden.

Plaats vervolgens op 90-millimeter schaaltjes ongeveer 200 wormparen per schaaltje. Was de parasieten in het schaaltje nog twee keer met behulp van zwaartekrachtsedimentatie. Gebruik voor deze wasbeurten warm RPMI-medium aangevuld met pen-strep.

Vervang de tweede wasbeurt door 40 milliliter van het medium zonder antibiotica. Kweek vervolgens de parasieten gedurende twee uur bij 37 graden Celsius onder 5% koolstofdioxide. Na twee uur breng je het medium van de schalen over in centrifugeerbuizen en pool je de eieren en wormdebris bij 2.000 g gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius.

Verzamel vervolgens het supernatant en breng het over in een verse buis. Filter vervolgens het supernatant door een 0,22-micron spuitfilter en verzamel de gefilterde oplossing in een dialysezak met een moleculair gewicht van 3,5 kilodalton. Dialyseer vervolgens de oplossing met behulp van 8% PEG8000-oplossing bij vier graden Celsius gedurende de nacht.

Deze stap is belangrijk om de opbrengst van extracellulaire vesicles te verhogen. De volgende dag breng je de gedialyseerde oplossing over in een nieuwe buis en voeg je 0,5 volumes van het totale exosome-isolatiereagens toe. Meng de oplossing tot het homogeen is en incubeer het gedurende de nacht bij ongeveer vijf graden Celsius.

De volgende ochtend centrifugeer je het mengsel gedurende een uur bij 15.000 g en ongeveer vijf graden Celsius. Aspeer vervolgens het supernatant en gooi het weg, en suspendeer het EV-pellet in twee milliliter PBS. Het pellet zal waarschijnlijk niet zichtbaar zijn.

Voor western blot-analyse bepaal je eerst de eiwitconcentratie van het monster, bijvoorbeeld met behulp van de BCA-test. Bereid vervolgens 10 tot 20 microgram EV's in 22,5 microliter RIPA-buffer voor. Voeg vervolgens 7,5 microliter 4X laadbuffer toe en verwarm het mengsel gedurende vijf minuten bij 95 graden Celsius.

Na de warmtebehandeling scheid je de extracellulaire vesicle-eiwitten op een 12% SDS-PAGE-gel. Nadat de gel is gelopen, worden de eiwitten overgebracht naar een PVDF-membraan. Probeer het membraan met anti-CD63-antilichamen bij een verdunning van één op 1.000.

Behandel vervolgens het membraan met anti-konijn IgG-HRP bij een verdunning van één op 5.000. Gebruik nu een ECL-detectiereagens om het membraan te ontwikkelen en voer vervolgens een analyse uit op een chemiluminescentie-beeldvormingssysteem. Begin met het overbrengen van vijf microgram monster naar een polypropyleen ultracentrifugebuis en pas het volume aan tot 12 milliliter met RPMI-1640-medium.

Centrifugeer vervolgens het monster gedurende 90 minuten bij 110.000 g en vier graden Celsius. Na de centrifugatie aspeer je voorzichtig het supernatant en gooi je het weg. Bereid vervolgens een 2X extracellulair vesicle-suspensie voor door één milliliter verdunningsvloeistof C toe te voegen aan het pellet.

Resuspendeer het pellet met voorzichtig pipetteren. Bereid nu een verse 2X kleurstofoplossing voor. Voeg twee microliter van de PKH67 ethanolische kleurstof toe aan één milliliter verdunningsvloeistof C in een microfugebuis en meng goed.

Kleur vervolgens het monster door de twee oplossingen te mengen en het mengsel gedurende vier minuten op kamertemperatuur te incuberen. Stop vervolgens de kleuring door vier milliliter FBS toe te voegen en nog een minuut te wachten. Voeg vervolgens RPMI-1640-medium toe om het volume aan te passen tot 12 milliliter en centrifugeer de suspensie om de gekleurde vesicles te isoleren.

Verwijder en gooi het supernatant weg. Resuspendeer vervolgens de gepelletiseerde PKH67-gelabelde EV's in 12 milliliter RPMI-1640-medium. Herhaal vervolgens de centrifugatie, maar verzamel deze keer de vesicles in één milliliter PBS.

Voor de opnametest bereid je overnachtsculturen van zoogdiercellen in zes-putjesplaten. Voeg de volgende ochtend vijf microgram PKH67-gelabelde vesicles toe aan elke put en zet de kweek voort gedurende twee tot vier uur. Na de incubatie verwijder je het medium en was je de cellen twee keer met PBS.

Fixeer vervolgens de cellen gedurende 15 minuten, was ze twee keer met PBS en kleuren ze met DAPI voor beeldvorming. Schistosomen in de leverfase werden verzameld van konijnen 28 dagen na infectie. Extracellulaire vesicles werden vervolgens verzameld van de schistosomenwormen en geanalyseerd.

Hun deeltjesgrootte, zoals bepaald door Malvern nanodeeltjesanalyse, varieerde tussen de 100 en 400 nanometer, met de meerderheid van de populatie rond de 220 nanometer. Transmissie-elektronenmicroscopie onthulde dat de extracellulaire vesicles rond waren en een diameter hadden tussen de 100 en 200 nanometer. Western blotting-analyse gaf aan dat de geïsoleerde extracellulaire vesicles werden herkend met behulp van CD63-antilichamen, wat een typische extracellulaire vesicle-marker is.

Fluorescentiemicroscopie van PKH67-gelabelde extracellulaire vesicles die door de NCTC-klon 1469-cellen werden geïnternaliseerd, toonde aan dat de extracellulaire vesicles voornamelijk werden gedistribueerd in het cytoplasma van de ontvangende cellen. Na het bekijken van deze video zou je een goed begrip moeten hebben van hoe je EV in in vitro kweekmedium van volwassen Schistosoma japonicum kunt isoleren.