Een snelle en Facile pijpleiding voor het genereren van Genomic punt mutanten in C. elegans met behulp van CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Het algemene doel van deze procedure is om genomische puntmutaties in C.Elegans te genereren met behulp van enkelstrengse oligonucleotide homologiegestuurde reparatiesjabloon en CRISPR/Cas9 ribonucleoproteïnen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de neurowetenschappen, zoals het bepalen van de pathologische gevolgen van genetische variatie geassocieerd met neurodegeneratieve ziekten. Het grote voordeel van deze techniek is dat genomische puntmutaties snel kunnen worden gegenereerd, waardoor functionele studie van genetische variatie mogelijk is binnen de context van endogene reguleringscontrole, terwijl de nadelen van eiwitoverexpressie worden vermeden.

Om de selectie van de sgRNA-doelwit te uitvoeren, opent u de hier getoonde webpagina. Voer ongeveer 60 basenparen van de sequentie in die de gewenste bewerking flankeert. Na het selecteren van het C.Elegans-genoom en het protospacer-aangrenzend motief volgens het tekstprotocol, klikt u op verzenden.

Kies op de resultatenpagina de bovenste gerelateerde doelsequentie die het dichtst bij de bewerking van belang ligt. Na ontvangst centrifugeert u de lyofilisatiesgRNA-bevattende buis bij kamertemperatuur en ten minste 12.000 g gedurende één minuut. Voeg 60 microliters nucleasevrij TE toe aan de buis en gebruik een p200-pipet om voorzichtig op te schalken door 15 tot 20 keer op en neer te pipetten.

De uiteindelijke concentratie is 50 micromolair. Ontwerp een ssODN HDR-sjabloon met de gewenste mutatie, een uniek in-frame restrictie-endonuclease-plaats, een stille mutatie van een of beide G's binnen de NGG PAM-sequentie en 50 basenparen vijf prime en drie prime homologie-armen die de eerste en laatste mutatie flankeren. Na ontvangst centrifugeert u de lyofilisatiessODN-bevattende buis zoals net gedemonstreerd en gebruikt u nucleasevrij DD H20 om ssODN voorzichtig op te schalen tot een uiteindelijke concentratie van 100 micromolair.

Om een injectiemix voor te bereiden, centrifugeert u de hier getoonde reagentia met maximale snelheid en vier graden Celsius gedurende twee minuten. Voeg in de vermelde volgorde de reagentia toe aan een nucleasevrij PCR-buisje. Gebruik vervolgens een p20-pipet om de inhoud voorzichtig en grondig te mengen.

Incubeer het buisje gedurende tien minuten bij kamertemperatuur. Na het injecteren van P0-dieren volgens het tekstprotocol, laat ze één tot twee uur herstellen bij kamertemperatuur op een OP50-gezaaide 35 millimeter NGM-plaat. Gebruik vervolgens een platinadraadworm om enkele geïnjecteerde P0-dieren over te brengen naar afzonderlijke OP50-gezaaide 35 millimeter NGM-platen.

Gebruik twee dagen na de injectie een fluorescerende microscoop om P0-platen te identificeren die F1-nakomelingen bevatten, die mCherry in de farynx tot expressie brengen. Kies drie P0-platen die de meeste mCherry-positieve F1-dieren bevatten. Van elk van de drie geselecteerde P0-platen gebruikt u een worm om acht tot 12 mCherry-positieve F1-dieren te selecteren voor een totaal van 24 tot 36 mCherry-positieve F1's.

Laat individuele F1's zichzelf bevruchten en eieren leggen bij kamertemperatuur gedurende één tot twee dagen. Gebruik na één tot twee dagen eierleggen een worm om de F1's over te brengen naar individuele PCR-buisjes die zeven microliter wormlysisbuffer bevatten. Centrifugeer de PCR-buisjes bij maximale snelheid en kamertemperatuur gedurende één minuut om de dieren naar de bodem van het buisje te brengen.

Bevriest u de buisjes vervolgens één uur bij min 80 graden Celsius. Lyse vervolgens de bevroren wormen in een thermocycler met behulp van het volgende programma. Stel vervolgens een PCR-mastermix in zoals weergegeven in deze tabel.

Voeg 21 microliters PCR-mastermix toe aan schone PCR-buisjes en voeg vervolgens vier microliters van de wormlysisbuis toe en meng goed door te pipetten. Voer vervolgens het PCR-programma uit volgens de richtlijnen van de fabrikant. Zuiver de PCR-reacties met behulp van een DNA-reinigings- en concentratiekit volgens de instructies van de fabrikant.

Verdun vervolgens het DNA door 10 microliters water toe te voegen aan de spinkolom. Voeg na het opzetten van de restrictie-enzymmastermix 10 microliters toe aan elke opgeruimde PCR-reactie en incubeer de buisjes gedurende één tot twee uur bij 37 graden Celsius. Scheid vervolgens de gedigesteerde PCR-producten op een 1,5% agarosegel met behulp van 1x TAE-buffer bij 120 volt.

Onderzoek enzymgedigesteerde monsters op de aanwezigheid van banden die wijzen op potentieel bewerkte dieren. Na het identificeren van potentieel bewerkte dieren gebruikt u de resterende drie microliters wormlysis en herhaalt u de PCR. Laad vervolgens de voltooide reacties onmiddellijk op een 1% agarosegel voordat u de band scheidt en extraheert met behulp van een gelextractiekit.

Voer met behulp van de F1-primer Sanger-sequencing uit om correct bewerkte dieren te identificeren. Om uit geverifieerde heterozygote bewerkte dieren homozygote dieren te verkrijgen, selecteert u acht tot 12 F2-dieren en voert u genotypering en sequentie-verificatie uit volgens het tekstprotocol. Om de eenvoud, haalbaarheid en efficiëntie van de CRISPR/Cas9 RNP-gebaseerde aanpak te demonstreren, werd het C.Elegans sod-1-gen getargeterd om de met ziekte geassocieerde humane G93a-variant in het wormgenoom te introduceren.

Deze gelafbeelding toont de genotyperingsresultaten voor 24 mCherry-positieve F1-dieren. 10 bevatten monoallylische of biallylische modificatie, 10 waren wildtype, drie waren potentiële indels en één was een PCR-mislukking. Om aan te tonen dat de fluorescerende mCherry-markering verrijkt is voor genoommodificatie, werden acht mCherry-negatieve dieren van elk van de drie P0-platen geselecteerd.

Slechts één dier was correct gemodificeerd, terwijl 23 wildtype waren. Deze figuur toont het chromatogram van het volledige gel-geëxtraheerde PCR