Name: Een snelle en Facile pijpleiding voor het genereren van Genomic punt mutanten in C. elegans met behulp van CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Leer een snelle CRISPR/Cas9-methode om genomische puntmutaties te genereren in C. elegans met ribonucleoproteïnen. Deze techniek maakt functionele studies van genetische variantie mogelijk zonder overexpressie van eiwitten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Er zijn geen conflicten van belang in verband met dit verslag.

Alle dierenverzorgers en experimentele procedures gevolgd het richtsnoer van het National Institutes of Health en de institutionele dier zorg en gebruik Comité (IACUC) aan de Universiteit van Michigan. Gebruik RNase-vrije oplossingen en Pipetteer tips in het gehele protocol. Reinig het werkgebied, pipetten, buizen en centrifuge met RNase decontaminatie oplossing volgens de richtlijnen van de fabrikant (Zie Materialen tabel).
1. sgRNA-doelverschuiving
<ol><li>Met behulp van een webbrowser, opent u de webpagina: http://crispor.tefor.net8<ol>
<li>Ingang ~ 60 basenparen (bp) van reeks begeleidende de gewenste bewerking van belang (d.w.z. 30 bp 5' en 3' voor gewenste edit).</li>
		<li>Selecteer het genoom Caenorhabditis elegans in het pulldown menu.</li>
		<li>Selecteer het Protospacer naast motief (HF1-20 bp-NGG - SpCas9, SpCas9, eSPCas9 1.1) in het pulldown menu.</li>
		<li>Klik op verzenden. Kies de hoogste gerangschikte doel volgorde dichtst bij het bewerken van belang in de resultatenpagina. Als er geen geschikt doel binnen de begeleidende 60 bp input sequentie zijn, vouwt u de query-reeks tot 100 bp (d.w.z. 50 bp aan weerszijden van de gewenste bewerken).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verkrijgen van een beschikbaar bron, bijvoorbeeld synthego, een 20-mer doel sgRNA met de volgende specificaties: 3 nmol; geen wijzigingen.</li>
	<li>Na ontvangst, centrifugeer gelyofiliseerd sgRNA buis op met > 12.000 x g voor 1 minuut bij kamertemperatuur. 60 µL voor nuclease-gratis TE toevoegen aan de buis, en zachtjes resuspendeer door pipetteren naar boven en beneden de 15 - 20 keer met behulp van een precisiepipet van P200. De eindconcentratie is 50 µM.</li>
</ol>2. een door de homologie geleide reparatie sjabloonontwerp
<ol><li>Ontwerp een ssODN HDR sjabloon, bevattende: 1) de mutatie van belang, 2) een unieke in-frame beperking endonuclease site, 3) een stille mutatie van een of beide van de Gs binnen de NGG PAM-reeks, en 4) 50 bp 5' en 3' homologie armen flankerend de eerste en laatste mutatie. (Figuur 1 c) 9 , 10.<ol>
<li>Als de mutatie van de sequentie NGG PAM niet mogelijk is, voeren 5-6 stille mutaties binnen de sgRNA doel erkenning volgorde om te voorkomen dat sgRNA-gemedieerde splitsing van de ssODN HDR-sjabloon.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vanuit een beschikbare bron, bijvoorbeeld idtdna, een "Ultramer DNA oligonucleotide" te verkrijgen met de volgende parameters: schaal: 4 nmol; Formulering: None; Zuivering: Standaard ontzouten.</li>
	<li>Na ontvangst, centrifugeer gelyofiliseerd ssODN buis op met > 12.000 x g voor 1 minuut bij kamertemperatuur. Zachtjes resuspendeer ssODN om een eindconcentratie van 100 µM in nuclease-vrije ddH2O door pipetteren naar boven en beneden de 15 - 20 keer met behulp van een precisiepipet van P200.</li>
</ol>3. ontwerp-genotypering Primers
<ol><li>Ontwerp een begeleidende de genoom wijziging instellen voor het genereren van een ~ 400-700 bp PCR amplicon11primer.</li>
	<li>Optimaliseren van PCR fietsen voorwaarden voor de productie van een interne en specifieke amplicon11.</li>
</ol>4. bereid injectie Mix
<ol><li>Centrifugeer tabel 1 reagentia op maximale snelheid gedurende 2 minuten bij 4 ° C.</li>
	<li>In de aangegeven volgorde, aan een PCR nuclease-gratis buis met toevoegen van tabel 1 reagentia.</li>
	<li>Meng door zachtjes op en neer 10 keer met een pipet P20 pipetteren.</li>
	<li>Injectie mix gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur incuberen.</li>
</ol>5. injectie Protocol
<ol><li>Injectie micropipet met ongeveer de helft van de injectie mix12laden. Sla de resterende injectie mix in het geval de injectie naald klompen of breekt.</li>
	<li>Breken micropipet uiteinde zodat ~ 20-30 psi een geleidelijke vloeiende oplossing12 produceert. Opmerking: Grotere diameter tips negatief van invloed zijn op de gezondheid van dieren en verlagen F1 nakomelingen opbrengst.</li>
	<li>Injecteren van 10-15 jonge volwassen wormen in beide gonadale armen indien mogelijk12. Als dat niet het geval is, injectie in één gonadale arm is voldoende.</li>
	<li>Toestaan dat ingespoten dieren (P,0) om te herstellen voor 1-2 h bij kamertemperatuur op een 35 mm OP50-geplaatste nematode media (NGM) groeischijf. Vervolgens kies één ingespoten P0 dieren aan individuele OP50-geplaatste 35 mm NGM platen met behulp van een platina wire worm12.</li>
</ol>6. screen P0 platen en enkele mCherry(+) F1s
<ol><li>Twee dagen na injectie, identificeren P0 platen met F1 nakomelingen uiting van mCherry in de farynx met een fluorescerende stereomicroscoop (Figuur 1 d, dag 2 - 3). Kies drie P0 platen die de meeste mCherry(+) F1 dieren bevatten.</li>
	<li>Uit elk van de drie geselecteerde P0 platen, één 8-12 mCherry(+) F1 dieren voor een totaal van 24-36 mCherry(+) F1s met behulp van een worm halen (Figuur 1 d, dag 2 - 3). Opmerking: mCherry(-) dieren kunnen ook een honkslag sloeg uit deze P0 platen, maar de kans om correct te identificeren bewerkt dieren is veel lager (figuur 2A).</li>
	<li>Toestaan dat individuele F1s tot self-fertilize en leggen eieren voor 1-2 dagen bij kamertemperatuur.</li>
</ol>7. één Worm PCR en genotypering
<ol><li>Na 1-2 dagen voor het leggen van eieren, breng u de F1s in individuele PCR strip tube caps met 7 µL van Worm Lysis Buffer met behulp van een worm pick ( Figuur 1 d,tabel 2, dag 4-5).</li>
	<li>Centrifuge PCR buizen bij maximumsnelheid voor 1 minuut bij kamertemperatuur te brengen dieren naar de onderkant van de buis, bevriezen buizen bij-80 ° C gedurende 1 uur. Opmerking: Wormen kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C voor onbepaalde tijd.</li>
	<li>Lyse van bevroren wormen in een thermocycler met behulp van het volgende programma: 60 ° C gedurende 60 minuten, 95 ° C gedurende 15 minuten, 4 ° C houdt.</li>
	<li>Set-up PCR mastermix zoals aangegeven in tabel 3.</li>
	<li>Voegt toe 21 µL van het PCR mastermix in schone PCR buizen, en vervolgens 4 µL van lysis van de worm uit stap 3. Meng goed met behulp van een precisiepipet en PCR-programma volgens de richtlijnen van de fabrikanten (Zie Materialen tabel).</li>
	<li>Zuiveren van PCR reacties met behulp van een schone DNA en concentraat kit, volgens de instructies van de fabrikant (Zie Materialen tabel). Elueer DNA door 10 µL water toe te voegen aan de kolom van de spin.</li>
	<li>Set-up restrictie-enzym mastermix zoals aangegeven in tabel 4.</li>
	<li>10 µL van het restrictie-enzym mastermix toevoegen aan elke schoongemaakte PCR-reactie en incubeer gedurende 1-2 uur bij 37 ° C13.</li>
	<li>Aparte verteerd PCR producten op een 1,5% agarose gel op 120 V met 1 x Tris-acetaat-EDTA (TAE)-buffer14uitgevoerd.</li>
</ol>8. identificatie en verificatie van de opeenvolging van bewerkte dieren
<ol><li>Onderzoeken enzym verteerd monsters op de aanwezigheid van bands die wijzen op potentieel bewerkt dieren14 (Figuur 1 d, dag 4-5). Opmerking: Een N2-besturingselement ter identificatie van potentiële indel mutaties die kunnen worden waargenomen als verschuivingen in de band grootte en/of onverwachte en complexe restrictie-enzym spijsvertering "banding" patronen laden.</li>
	<li>Na het identificeren van potentiële bewerkte dieren, gebruik de resterende 3 µL van lysis van de worm en herhaal de PCR-reactie. Niet schoon of restrictie-enzym verteren de PCR reactie nadat het programma is voltooid. De PCR-reactie op een 1% agarose gel, afzonderlijke laden en haal de band met behulp van een gel extractie kit15 (Zie Materialen tabel).</li>
	<li>Sanger reeks16 gel geëxtraheerde DNA met behulp van de F1-primer te identificeren correct bewerkte dieren (figuur 1A) Opmerking: Heterozygote leest zal bevatten overlay pieken als gevolg van de aanwezigheid van de wild-type en gemanipuleerde allel.</li>
	<li>Te verkrijgen bij homozygoot dieren geverifieerde heterozygoot bewerkte dieren, één 8-12 F2 dieren stappen 7-8.</li>
</ol>

<ol><li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202, 885-901 (2016).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346, 1258096(2014).</li>
<li>Ma, D., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Editing+and+Its+Applications+in+Model+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Proteomics+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Genome Editing and Its Applications in Model Organisms.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).</li>
<li>Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-Guided+Genome+Engineering+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans.</a> Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).</li>
<li>Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+technologies+for+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Delivery technologies for genome editing.</a> Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).</li>
<li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biol. 17, 148(2016).</li>
<li>Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+genome+editing+using+CRISPR-Cas9+and+linear+repair+templates+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans.</a> Methods. , (2017).</li>
<li>Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient%2C+Rapid+and+Co-CRISPR-Independent+Genome+Editing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans.</a> G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5056/pcr-the-polymerase-chain-reaction">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction.</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5070/restriction-enzyme-digests"> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests.</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5057/dna-gel-electrophoresis">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis .</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5063/gel-purification">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification.</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>Estrada-Rivadeneyra, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29171728">Sanger sequencing.</a> FEBS J. , (2017).</li>
<li>Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22918486">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).</li>
<li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEvans%2C+TC+%22WormBook%22">WormBook</a>. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).</li>
<li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li>
<li>Boyd, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Balanced+Look+at+the+Implications+of+Genomic+%28and+Other+%26%2334%3BOmics%26%2334%3B%29+Testing+for+Disease+Diagnosis+and+Clinical+Care%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other &#34;Omics&#34;) Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care.</a> Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).</li>
<li>Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+SOD1+loss+of+function+involved+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis?</a> Brain. 136, 2342-2358 (2013).</li>
<li>Acevedo-Arozena, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+assessment+of+the+SOD1G93A+low-copy+transgenic+mouse%2C+which+models+human+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis.</a> Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).</li>
<li>Gurney, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu%2CZn+superoxide+dismutase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li>
</ol>

Wij danken de leden van de Beg-laboratorium voor kritische lezing van dit manuscript. Stammen werden verstrekt door de Caenorhabditis genetica Center, dat wordt gefinancierd door de NIH kantoor van infrastructuur onderzoeksprogramma (P40 OD010440). Onderzoek in het laboratorium Beg wordt ondersteund door subsidies van de NIH (R01 NS094678) and Muscular Dystrophy Association (MDA382300) naar A.A.B.

Het CRISPR-Cas9-systeem is een krachtige en effectieve tool om het genoom van modelorganismen juist te wijzigen. Hier, we laten zien dat chimeer sgRNAs20 in combinatie met ssODN HDR sjablonen inschakelen de hoogefficiënte generatie van genomic puntmutaties in C. elegans. Nog belangrijker is, we laten zien dat RNP levering bewerken hoogrenderende produceert wanneer fluorescentie wordt gebruikt als een marker co selectie, markeren het gemak en de betrouwbaarheid van de techniek.
<p clas...

Recente technologische vooruitgang hebben radicaal getransformeerd en versnelde de mogelijkheid om precies ingenieur genomen. Met name is de CRISPR-Cas9-systeem, dat gebaseerd op de endonuclease van RNA-geleide Cas9 is voor het opwekken van een dubbele streng pauze (DSB) in de buurt van de opeenvolging van de doelgroep van belang, uitgebreid gebruikt voor het nauwkeurig ingenieur het genoom van de meerderheid van de modelorganismen gebruikt in biomedisch onderzoek1,2,3,4. Aanzienlijk, heeft het gebruik van CRISPR-Cas9 ontgrendeld genoom bewerken zelfs in moeilijke soorten zoals C. elegans5. Ongeacht soort, genereren van puntmutaties met het genoom van de CRISPR-Cas9 gebaseerd editing systeem berust op drie componenten van de kern: 1) Cas9 endonuclease, 2) een enkele gids-RNA (sgRNA) die de endonuclease van de Cas9 aan een reeks van doel, en 3) een gebruiker ontworpen leidt homologie geleide reparatie (HDR)-sjabloon met de gewenste edit(s) van belang2.
Er zijn verschillende methoden die kunnen worden gebruikt om de targeting sgRNA en Cas9 in cellen, met inbegrip van de plasmide, RNA en virale gebaseerde levering methoden6nuclease. Onlangs, directe levering van pre-complexvorm sgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) heeft ontpopt als een krachtig en efficiënt hulpmiddel in CRISPR-Cas9-gebaseerde genoom7bewerken. De directe levering van pre-complexvorm CRISPR-Cas9 RNPs heeft verschillende duidelijke voordelen, namelijk: 1) RNPs omzeilen de noodzaak voor cellulaire transcriptie en vertaling, 2) RNPs zijn snel gewist, specificiteit kunnen verhogen door vermindering van de beschikbare tijd voor af-target decolleté, en 3) RNPs bevatten geen buitenlandse DNA/RNA-elementen die de introductie van uitheemse sequenties in het genoom van de host door middel van willekeurige integratie omzeilt. Samen bieden deze kenmerken waarschijnlijk een kortstondige uitbarsting van aan-target CRISPR bewerken terwijl het minimaliseren van uit-target effecten.
Beschrijven we een eenvoudig en efficiënt protocol voor de invoering van site-specific genomic veranderingen in C. elegans. Dit protocol omvat gericht op sgRNA en één gestrande oligonucleotide (ssODN) HDR sjabloonontwerp, sgRNA-Cas9 RNP complexvormers en levering en een genotypering strategie voor de ondubbelzinnige identificatie van goed bewerkte dieren. Met behulp van deze strategie, niet alleen kunnen de gewenste specifieke wijzigingen worden hersteld, maar andere niet-specifieke indel mutaties kunnen ook worden teruggevorderd. Dus onze strategie toelaat de generatie van een allèlique reeks met behulp van één enkele strategie, waar zowel mono-allèlique, bi-allèlique en indel mutanten kunnen worden gegenereerd op de F1 generatie.

<table><tbody><tr><td>CRISPRevolution sgRNA&nbsp; EZ Kit</td><td>Synthego Inc.</td><td></td><td>chimère sgRNA</td></tr><tr><td>Nuclease-free TE</td><td>Synthego Inc.</td><td>wordt geleverd met de sgRNA kit EZ kit</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Synthego Inc.</td><td>wordt geleverd met de sgRNA kit EZ kit</td><td></td></tr><tr><td>4 nmole Ultramer DNA Oligo</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>ssODN HDR template</td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1078728</td><td>Cas9-eiwit</td></tr><tr><td>pCFJ90&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>19327</td><td>Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>DNA Clean &amp; Concentrator</td><td>Zymo Research</td><td>D4004</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean Gel DNA Recovery Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4002</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Glass Borosilicate Glass Micropipettes</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-78-10</td><td>OD: 1.0mm. ID: 0.78mm</td></tr><tr><td>Trizma Hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Decontamination Solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

een snelle en facile pijpleiding voor het genereren van genomic punt mutanten in c. elegans met behulp van crispr/cas9 ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

De geclusterde regelmatig afgewisseld palindromische herhaalt (CRISPR) - CRISPR - geassocieerde proteïne 9 (Cas9) prokaryote adaptieve immuunsysteem verdedigingssysteem is gecoöpteerd als een krachtig hulpmiddel voor precieze eukaryotische genoom engineering. Hier presenteren we een snelle en eenvoudige methode met behulp van chimeer één gids RNAs (sgRNA) en CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) voor de efficiënte en nauwkeurige generatie van genomic puntmutaties in C. elegans. We beschrijven een pijpleiding voor sgRNA-doelverschuiving sjabloonontwerp homologie geleide reparatie (HDR), CRISPR-Cas9-RNP complexvormers en levering en een genotypering strategie waarmee de robuuste en snelle identificatie van correct bewerkte dieren. Onze aanpak niet alleen toelaat de facile generatie en de identificatie van de gewenste genomic punt mutant dieren, maar ook vergemakkelijkt de opsporing van andere complexe indel allelen in ongeveer 4-5 dagen met hoog rendement en een verminderde screening werklast.

Mutaties in menselijke superoxide dismutase 1 (SOD1) goed voor ~ 10-20% van de familiale Amyotrofische laterale sclerose, een verwoestende neurodegeneratieve ziekte die steevast tot verlamming en dood17 leidt. Menselijke SOD-1 is een evolutionair Geconserveerde proteïne delen van 55% identiteit en 70% gelijkenis met de C. elegans SOD-1 proteïne (figuur 1B). Om aan te tonen de eenvoud, haalbaarheid en doeltreffendheid ...

Hier presenteren we een methode om het genoom van C. elegans ingenieur met behulp van CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins en homologie afhankelijke reparatie sjablonen.

Een snelle en Facile pijpleiding voor het genereren van Genomic punt mutanten in C. elegans met behulp van CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Het algemene doel van deze procedure is om genomische puntmutaties in C.Elegans te genereren met behulp van enkelstrengse oligonucleotide homologiegestuurde reparatiesjabloon en CRISPR/Cas9 ribonucleoproteïnen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de neurowetenschappen, zoals het bepalen van de pathologische gevolgen van genetische variatie geassocieerd met neurodegeneratieve ziekten. Het grote voordeel van deze techniek is dat genomische puntmutaties snel kunnen worden gegenereerd, waardoor functionele studie van genetische variatie mogelijk is binnen de context van endogene reguleringscontrole, terwijl de nadelen van eiwitoverexpressie worden vermeden.Om de selectie van de sgRNA-doelwit te uitvoeren, opent u de hier getoonde webpagina. Voer ongeveer 60 basenparen van de sequentie in die de gewenste bewerking flankeert. Na het selecteren van het C.Elegans-genoom en het protospacer-aangrenzend motief volgens het tekstprotocol, klikt u op verzenden.Kies op de resultatenpagina de bovenste gerelateerde doelsequentie die het dichtst bij de bewerking van belang ligt. Na ontvangst centrifugeert u de lyofilisatiesgRNA-bevattende buis bij kamertemperatuur en ten minste 12.000 g gedurende één minuut. Voeg 60 microliters nucleasevrij TE toe aan de buis en gebruik een p200-pipet om voorzichtig op te schalken door 15 tot 20 keer op en neer te pipetten.De uiteindelijke concentratie is 50 micromolair. Ontwerp een ssODN HDR-sjabloon met de gewenste mutatie, een uniek in-frame restrictie-endonuclease-plaats, een stille mutatie van een of beide G's binnen de NGG PAM-sequentie en 50 basenparen vijf prime en drie prime homologie-armen die de eerste en laatste mutatie flankeren. Na ontvangst centrifugeert u de lyofilisatiessODN-bevattende buis zoals net gedemonstreerd en gebruikt u nucleasevrij DD H20 om ssODN voorzichtig op te schalen tot een uiteindelijke concentratie van 100 micromolair.Om een injectiemix voor te bereiden, centrifugeert u de hier getoonde reagentia met maximale snelheid en vier graden Celsius gedurende twee minuten. Voeg in de vermelde volgorde de reagentia toe aan een nucleasevrij PCR-buisje. Gebruik vervolgens een p20-pipet om de inhoud voorzichtig en grondig te mengen.Incubeer het buisje gedurende tien minuten bij kamertemperatuur. Na het injecteren van P0-dieren volgens het tekstprotocol, laat ze één tot twee uur herstellen bij kamertemperatuur op een OP50-gezaaide 35 millimeter NGM-plaat. Gebruik vervolgens een platinadraadworm om enkele geïnjecteerde P0-dieren over te brengen naar afzonderlijke OP50-gezaaide 35 millimeter NGM-platen.Gebruik twee dagen na de injectie een fluorescerende microscoop om P0-platen te identificeren die F1-nakomelingen bevatten, die mCherry in de farynx tot expressie brengen. Kies drie P0-platen die de meeste mCherry-positieve F1-dieren bevatten. Van elk van de drie geselecteerde P0-platen gebruikt u een worm om acht tot 12 mCherry-positieve F1-dieren te selecteren voor een totaal van 24 tot 36 mCherry-positieve F1's.Laat individuele F1's zichzelf bevruchten en eieren leggen bij kamertemperatuur gedurende één tot twee dagen. Gebruik na één tot twee dagen eierleggen een worm om de F1's over te brengen naar individuele PCR-buisjes die zeven microliter wormlysisbuffer bevatten. Centrifugeer de PCR-buisjes bij maximale snelheid en kamertemperatuur gedurende één minuut om de dieren naar de bodem van het buisje te brengen.Bevriest u de buisjes vervolgens één uur bij min 80 graden Celsius. Lyse vervolgens de bevroren wormen in een thermocycler met behulp van het volgende programma. Stel vervolgens een PCR-mastermix in zoals weergegeven in deze tabel.Voeg 21 microliters PCR-mastermix toe aan schone PCR-buisjes en voeg vervolgens vier microliters van de wormlysisbuis toe en meng goed door te pipetten. Voer vervolgens het PCR-programma uit volgens de richtlijnen van de fabrikant. Zuiver de PCR-reacties met behulp van een DNA-reinigings- en concentratiekit volgens de instructies van de fabrikant.Verdun vervolgens het DNA door 10 microliters water toe te voegen aan de spinkolom. Voeg na het opzetten van de restrictie-enzymmastermix 10 microliters toe aan elke opgeruimde PCR-reactie en incubeer de buisjes gedurende één tot twee uur bij 37 graden Celsius. Scheid vervolgens de gedigesteerde PCR-producten op een 1,5% agarosegel met behulp van 1x TAE-buffer bij 120 volt.Onderzoek enzymgedigesteerde monsters op de aanwezigheid van banden die wijzen op potentieel bewerkte dieren. Na het identificeren van potentieel bewerkte dieren gebruikt u de resterende drie microliters wormlysis en herhaalt u de PCR. Laad vervolgens de voltooide reacties onmiddellijk op een 1% agarosegel voordat u de band scheidt en extraheert met behulp van een gelextractiekit.Voer met behulp van de F1-primer Sanger-sequencing uit om correct bewerkte dieren te identificeren. Om uit geverifieerde heterozygote bewerkte dieren homozygote dieren te verkrijgen, selecteert u acht tot 12 F2-dieren en voert u genotypering en sequentie-verificatie uit volgens het tekstprotocol. Om de eenvoud, haalbaarheid en efficiëntie van de CRISPR/Cas9 RNP-gebaseerde aanpak te demonstreren, werd het C.Elegans sod-1-gen getargeterd om de met ziekte geassocieerde humane G93a-variant in het wormgenoom te introduceren.Deze gelafbeelding toont de genotyperingsresultaten voor 24 mCherry-positieve F1-dieren. 10 bevatten monoallylische of biallylische modificatie, 10 waren wildtype, drie waren potentiële indels en één was een PCR-mislukking. Om aan te tonen dat de fluorescerende mCherry-markering verrijkt is voor genoommodificatie, werden acht mCherry-negatieve dieren van elk van de drie P0-platen geselecteerd.Slechts één dier was correct gemodificeerd, terwijl 23 wildtype waren. Deze figuur toont het chromatogram van het volledige gel-geëxtraheerde PCR

a-rapid-facile-pipeline-for-generating-genomic-point-mutants-c

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Deze video beschrijft een techniek om een enkel nematode snel te screenen op een genetische marker door PCR-screening. In het voorbeeldprotocol screenen we op CRISPR-gebaseerde genoombewerking.

Single Worm PCR: een methode om genomisch DNA te extraheren en te versterken

Deze video beschrijft micro-injection, een veelgebruikte methode om transgene C. elegans stammen te creëren.  In het voorbeeld zien we micro-injection gebruikt om een ribonucleoproteïne (RNP) complex voor CRISPR-bases genbewerking te introduceren.

Gonad Microinjection: Een methode van samengestelde levering direct in de kiembaan van C. elegans

CRISPR/Cas9 is een robuust systeem om genen en genetische elementen te onderbreken. Hier beschrijven we een protocol voor het efficiënt creëren van genomische deleties in zoogdiercellijnen met behulp van CRISPR/Cas9.

Generatie van Genomic Deleties in zoogdiercellijnen via CRISPR / Cas9

Genotypering techniek beschreven voor koppeling fluorescent polymerasekettingreactie (PCR) met capillaire gelelektroforese, maakt genotypering van nuclease-gemedieerde knockout klonen. Het omzeilt beperkingen geconfronteerd met andere genotyperingstechnieken en kosteneffectiever is dan sequencing methoden.

Gebruikmaking van een fluorescentie PCR-capillaire gelelektroforese techniek voor CRISPR Genotype / Cas9-gemedieerde knockout mutanten in een High-throughput Format

Gerichte genoom bewerken in het modelsysteem Danio rerio (zebravis) is sterk bevorderd door de opkomst van de CRISPR gebaseerde benaderingen. Hierin beschrijven we een gestroomlijnde, robuust protocol voor generatie en van onzin CRISPR afkomstige allelen waarin de heteroduplex mobility assay en identificatie van mutaties met behulp van de volgende generatie sequencing.

Efficiënte productie en identificatie van CRISPR/Cas9-gegenereerd Gene uitsparingen in de modelsysteem Danio rerio

Met behulp van een voorgemonteerd Cas9 is ribonucleoprotein complex (RNP) een krachtige methode voor het bewerken van nauwkeurige en efficiënte genoom. Hier, wijzen wij op het nut ervan over een breed scala van cellen en organismen, met inbegrip van de primaire menselijke cellen en beide klassieke en opkomende modelorganismen.

Verbeterde genoom bewerken met Cas9 Ribonucleoprotein in verschillende cellen en organismen

Dit protocol biedt een methode om het genereren van gedefinieerde heterozygoot of homozygoot nucleotide veranderingen te vergemakkelijken met behulp van CRISPR CAS9 in menselijke pluripotente stamcellen.

Generatie van gedefinieerde genomische modificaties met CRISPR CAS9 in menselijke pluripotente stamcellen

Het doel van dit protocol is om naadloze CRISPR/Cas9-bewerking van het C. elegans-genoom mogelijk te maken met behulp van geassembleerde ribonucleoproteïnecomplexen en de dpy-10 co-CRISPR-marker voor screening. Dit protocol kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan genetische modificaties in C. elegans te maken, waaronder inserties, deleties, genvervangingen en codonsubstituties.

CRISPR/Cas9 Editing van het C. elegans rbm-3.2 Gen met behulp van de dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker en Geassembleerde Ribonucleoproteïne Complexen.

Hier beschrijven we een eenvoudige techniek die bedoeld is voor de efficiënte generatie van genetisch gemodificeerde muizen, CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Deze methode levert bewerkingsreagentia door elektroporatie in embryo's met een efficiëntie van bijna 100%. Dit protocol is effectief voor puntmutaties, kleine genomische inserties en deleties in zoogdierembryo's.

Efficiënte genoombewerking van muizen door CRISPR-elektroporatie van zygoten

Dit artikel demonstreert CRISPR-Cas9-gemedieerde genoomengineering in Steinernema hermaphroditum, een entomopathogene (EPN: insect-parasitaire) nematode en een opkomend genetisch model. De beschreven technologie is nuttig voor het creëren van mutanten, waardoor genfuncties in de nematodebiologie kunnen worden opgehelderd die relevant zijn voor mutualistische en parasitaire symbiose.

CRISPR-Cas9-gebaseerde mutagenese in de entomopathogene nematode Steinernema hermaphroditum en het onderhoud van mutante lijnen

Een CRISPR/Cas9 microinjectieworkflow voor endogene fluorescerende tagging in de Caenorhabditis elegans kiemlijn om homozygote knock-in-lijnen te verkrijgen voor in vivo eiwitlokalisatieanalyse.

CRISPR/Cas9-gemedieerde endogene fluorescerende tagging van kiemlijnspecifieke genen in Caenorhabditis elegans

Leer een snelle CRISPR/Cas9-methode om genomische puntmutaties te genereren in C. elegans met ribonucleoproteïnen. Deze techniek maakt functionele studies van genetische variantie mogelijk zonder overexpressie van eiwitten.

Een snelle en Facile pijpleiding voor het genereren van Genomic punt mutanten in C. elegans met behulp van CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins (Video) | JoVE Journal

Een snelle en Facile pijpleiding voor het genereren van Genomic punt mutanten in C. elegans met behulp van CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Meer video's verkennen