Toeprinting analyse van vertaling initiatie complexvorming op zoogdieren mRNAs

Het algemene doel van deze toeprinting-analyse is om de vorming van het translatie-initiatiecomplex op zoogdier-mRNA's waar te nemen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van mRNA-translatie, zoals door IRES gemedieerde translatie-initiatie. Het grote voordeel van deze techniek is dat men een gedetailleerde analyse van de vorming van het translatie-initiatiecomplex op een specifiek mRNA kan uitvoeren.

Assembleer de transcriptiereacties om RNA te transcriberen van de PCR-versterkte DNA-sjablonen, die het XIAP IRES RNA of zijn mutanten coderen. Voeg vervolgens twee eenheden RNase-vrije DNase toe om de DNA-sjabloon te verwijderen aan elke 20 microliter reactie van RNA. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius.

Verdun vervolgens het met DNase behandelde RNA met nuclease-vrij water tot een eindvolume van 110 microliter. Voeg vervolgens 110 microliter zuur fenol toe om de RNA-zuivering te beginnen. Vortex de monsters gedurende vijf seconden en centrifugeer gedurende drie minuten bij 20.000 x g bij kamertemperatuur.

Het is van cruciaal belang om het RNA of cDNA te verdunnen voorafgaand aan fenolextractie. Als het volume te laag is, zal het moeilijk zijn om de waterige fase fysiek te herstellen en zal de uiteindelijke opbrengst laag zijn. Draag vervolgens voorzichtig 100 microliter van de RNA-bevattende waterige fase over naar een nieuwe microcentrifugebuis.

Voeg 10 microliter 3 M natriumacetaat, pH 5,5, toe en meng de monsters. Voeg vervolgens drie volumes 100% ethanol toe om RNA te precipiteren en vortex de monsters gedurende vijf seconden. Incubeer een nacht bij 20 graden Celsius.

De volgende dag centrifugeer de monsters bij 20.000 x g gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius en gooi de supernatant weg. Was vervolgens de pellet met 500 microliter ijskoud 70% ethanol en herhaal de centrifugatie. Zuig voorzichtig zoveel mogelijk supernatant op zonder de pellet los te maken.

Laat vervolgens de pellet vijf tot tien minuten aan de lucht drogen. Resuspendeer de pellet in nuclease-vrij water tot een eindconcentratie van 0,5 microgram per microliter. Om de toeprinting-assay te starten, voeg 15 microliter niet-nuclease behandelde konijnen reticulocytlysaat toe aan elke 1,5 milliliter microcentrifugebuis, die de wild-type XIAP IRES RNA en zijn mutanten vertegenwoordigen.

Voeg RNase-remmer, ATP en GMP-PNP toe aan elke buis. Incubeer gedurende vijf minuten bij 30 graden Celsius. Voeg vervolgens één microliter van het respectieve RNA toe aan elk van de buizen en incubeer gedurende vijf minuten extra bij 30 graden Celsius.

Tijdens de incubatieperiode, voeg DTT en spermidine toe aan de toeprintingbuffer. Voeg vervolgens 22 microliter toeprintingbuffer toe aan elk van de buizen en incubeer gedurende drie minuten bij 30 graden Celsius. Voeg vervolgens 0,5 microliter IR-kleurstof gelabelde toeprinting-primer toe en incubeer de reactie gedurende 10 minuten op ijs.

Voeg vervolgens twee microliter dNTP's, twee microliter magnesiumacetaat en één microliter avian myeoloblastosis virus reverse transcriptase toe. Breng het eindvolume op 50 microliter met toeprintingbuffer. Laat vervolgens primerextensie gedurende 45 minuten bij 30 graden Celsius plaatsvinden.

Het is ook van cruciaal belang om magnesiumacetaat toe te voegen aan de toeprintingreactie, zonder welke de reverse transcriptase niet optimaal zal functioneren. Voeg vervolgens 200 microliter nuclease-vrij water toe. Voeg 250 microliter 25:24:1 fenol:chloroform:isoamylalcohol, pH 8,0, toe om de zuivering van cDNA te beginnen.

Na het voorzichtig mengen van de monsters gedurende vijf seconden, centrifugeer de monsters bij 20.000 x g bij kamertemperatuur gedurende drie minuten. Draag vervolgens voorzichtig de waterige fase met het DNA over naar een nieuwe microcentrifugebuis. Voeg vervolgens drie volumes 100% ethanol toe om het DNA te precipiteren en vortex gedurende vijf seconden.

Incubeer een nacht bij 20 graden Celsius. De volgende dag centrifugeer de buizen bij 20.000 x g gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius en gooi de supernatant weg. Was vervolgens de DNA-pellet met 500 microliter ijskoud 70% ethanol en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 20.000 x g bij vier graden Celsius.

Zuig zoveel mogelijk supernatant op, zorg ervoor dat de pellet niet loskomt. Laat vervolgens de pellet vijf tot tien minuten aan de lucht drogen. Los de DNA-pellet op in zes microliter nuclease-vrij water.

Voeg vervolgens drie microliter formamidine-laadbuffer toe. Gebruik een sequencingkit om een dideoxy nucleotide sequencing ladder voor te bereiden met de toeprinting-primer en de DNA-construct die het XIAP IRES RNA codeert. Meng vervolgens zes microliter van elke sequencingreactie met drie microliter formamidine-laadbuffer.

Na het schoonmaken en samenstellen van de platen, giet de gel en plaats de kam. Na de polymerisatie van de gel, stel het sequencingapparaat samen en vul de reservoirs met 1x TBE. Prerun vervolgens gedurende 15 minuten bij 1500 volt totdat een temperatuur van 55 graden Celsius is bereikt.

Verwarm alle monsters met formamidine-kleurstof gedurende vijf minuten tot 85 graden Celsius. Laad vervolgens één microliter van elk monster op een 6% polyacrylamide sequencinggel en laat de gel gedurende acht uur bij 1500 volt lopen. Lees ten slotte de banden in realtime met een op fluorescentie gebaseerde imager.

Deze methode toont aan dat bevestiging van RNA cruciaal is voor de vorming van het translatie-initiatiecomplex. De reverse transcriptie van XIAP mRNA ribosoomcomplex geeft typische toeprints 17 tot 19 nucleotiden stroomafwaarts van AUG. De 5'PPT-mutant vertoont een verminderde toeprintvorming.

Wanneer echter met de 5'cap wordt getranscribeerd, vindt vorming van het initiatiecomplex plaats. Evenzo vertoont de 3'PPT-mutant ook een verminderde toeprintvorming. Transscriptie met de 5'cap leidt echter wel tot vorming van het initiatiecomplex.

De dubbele PPT-mutant met zowel de 5'PPT- als 3'PP