Ex Utero Electroporation en Organotypic Slice culturen van muis embryonale hersenen voor Live-Imaging van GABAergic interneuronen migreren
20 april 2018
Hier bieden we een goedkope en betrouwbare methode voor het genereren van electroporated brein organotypic segment culturen van muis embryo's geschikt voor confocale microscopie en live-imaging technieken.
Het algemene doel van dit experiment is om genetisch gemodificeerde corticale GABAerge interneuronen te visualiseren tijdens tangentiële migratie in de meest natuurlijke omgeving die mogelijk is. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de ontwikkelingsneurowetenschappen door het screenen van de impact van het verlies van functie van specifieke genen of eiwitten tijdens de ontwikkeling van de hersenen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een lage kosten en relatief eenvoudig uit te voeren is in vergelijking met andere vergelijkbare methoden zoals elektroporatie in utero.
Deze techniek kan uiteindelijk de diagnose voor patiënten met genetische neurodevelopmentele stoornissen zoals autisme en epilepsie verbeteren door de pathogenetische eigenschappen van specifieke mutaties die bij patiënten zijn geïdentificeerd te verduidelijken, evenals de rol van nieuwe ziektegenen tijdens de ontwikkeling van de hersenen. Begin met het instellen van de bioveiligheidskast met alle instrumenten die nodig zijn voor dissectie en kweek. Spuit alle instrumenten in de bioveiligheidskast royaal in met 70%ethanol en steriliseer de instrumenten en het interieur van de kast met UV-licht gedurende 15 tot 20 minuten.
Als u klaar bent om embryo's te verzamelen, spuit u royaal de buik van de geëuthanasieerde moeder met 70%ethanol. Trek de buikhuid omhoog met een paar gesteriliseerde pincetten en gebruik met de andere hand gesteriliseerde chirurgische schaar om de huid van de buik te snijden. Trek met een tweede paar gesteriliseerde pincetten en schaar de buikfascie omhoog en snijd deze, terwijl u voorzichtig de baarmoeder vermijdt.
Gebruik een derde paar gesteriliseerde pincetten en schaar om de baarmoederhoorns vast te houden en snijd ze uit de bekkenholte. Plaats de gedissecteerde baarmoederhoorns in een steriele 60 millimeter petrischaal gevuld met op zenuwen gebaseerd lebovitz-kweekmedium aangevuld met aminozuren, vitaminen en anorganische zouten. Gebruik in de steriele bioveiligheidskast twee paar fijne pincetten om de embryo's uit de placenta te dissecteren en de koppen te isoleren door onthoofding.
Snijd de punt van een steriele plastic transferpipet van drie milliliter afgeschuind en gebruik deze om de koppen te aspireren en ze over te brengen naar een nieuwe steriele 60 millimeter petrischaal gevuld met hetzelfde aangevulde op zenuwen gebaseerde kweekmedium om het bloed uit te wassen. Breng ze opnieuw over naar een derde petrischaal gevuld met gesmolten zwart was en gevuld met op zenuwen gebaseerd aangevuld kweekmedium. Plaats de 16 millimeter petrischaal gevuld met zwart was en de onthoofde koppen bevattende op zenuwen gebaseerd aangevuld kweekmedium onder de dissectiemicroscoop in de bioveiligheidskast.
Gebruik fijne pincetten in de linkerhand om de kop met de rostrale kant naar rechts te stabiliseren. Gebruik vervolgens de nano-injector in de rechterhand om één tot twee microliters van de met de kleurstof gespikte plasmide-oplossing in het rechter laterale ventrikel te injecteren. Elektroporeer de geïnjecteerde hersenen door het hoofd tussen de elektroden te plaatsen met de negatieve elektrode dorsaal en parallel aan het hoofd en de positieve elektrode richting de ventrale kant van het hoofd om de MGE te targeten.
Zodra de elektroden goed zijn gepositioneerd, lever vierkant pulsen van 40 volt gedurende 50 milliseconden met interpulsintervallen van 500 milliseconden. Terwijl u nog steeds werkt in de steriele omgeving van de bioveiligheidskast, begint u de hersenen uit de schedel te dissekteren. Stabiliseer eerst het hoofd op de laag zwart was door een naald in elk oog in te steken, terwijl u voorzichtig de hersenen vermijdt.
Gebruik vervolgens een paar fijne pincetten om de linkerkant van de nek vast te houden en een tweede paar fijne pincetten om de huid van de schedel van achter naar voren te scheuren. Terwijl u het hoofd lateraal vasthoudt met pincetten in één hand, gebruikt u een ander paar pincetten in de andere hand om voorzichtig de schedel op het niveau van de hersenstam te snijden en de schedel omhoog te trekken. Snijd met elke pincet de schedel in het sagittale vlak naar de voorkant en snij vervolgens lateraal om de schedelfragmenten te bevrijden.
Til vervolgens de hersenstam op en snijd voorzichtig de hersenvliezen en hersenzenuwen door totdat de hersenen volledig uit de schedel zijn. Vul een 35 millimeter petrischaal met gesmolten agarose-oplossing die vloeibaar wordt gehouden bij 42 graden Celsius. Breng vervolgens snel een geëlektroporeerde hersenen over naar de met agarose gevulde schotel met behulp van de eerder gesneden transferpipet.
Roer de agarose met een metalen stok om de hersenen in het midden van de schotel te houden om zinken te voorkomen en positioneer de hersenen in een rostrale caudale vlak parallel aan de schotel. Stop met roeren wanneer de agarose begint te stollen om schade aan de hersenen te voorkomen. Terwijl u wacht op de agarose-inbedding om te stollen, brengt u 750 microliter N2-aanvullend kweekmedium in elke put van de zes-putten kweekplaat volgens het aantal hersenen om te verwerken.
En plaats een 30 millimeter membraaninzet in elke met medium gevulde put. Gebruik een scheermes om de agarose rond de hersenen te snijden om een rechthoekige blok te vormen met een marge van één tot twee millimeter rond de hersenen. Zorg ervoor dat het rostrale deel van de hersenen loodrecht staat op de voorste begrenzing van het blok om de oriëntatie te vergemakkelijken voor de volgende snede stappen.
Lijm het agaroseblok op de vibratomeplatform rostrale rand naar beneden en ventrale rand naar de gebruiker. Snijd de hersenen in coronale secties om 250 micron dikke secties te verkrijgen bij vier graden Celsius. Verzamel met gesteriliseerde spatels twee tot drie secties die de MGE bevatten en plaats alle hersensneden van één dier op een enkele 30 millimeter membraaninzet.
Zorg ervoor dat u overlap tussen secties voorzichtig vermijdt. Plaats de kweekplaat in een geventileerde steriele incubator bij 37 graden Celsius met 60% vochtigheid en vijf procent CO2 gedurende 48 of
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een kosteneffectieve en effectieve techniek voor het genereren van geëlektroporeerde organotypische hersenslice-culturen uit muisembryo's, waardoor visualisatie van genetisch gemodificeerde corticale GABAerge interneuronen tijdens hun tangentiële migratie mogelijk wordt. De methode heeft tot doel de effecten van specifieke genmutaties op hersenontwikkeling te onderzoeken, en biedt mogelijke inzichten in neurodevelopmentele stoornissen.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Ontwikkelingsbiologie
- Neurogenetica
Achtergrond
- Het begrijpen van de migratie van GABAerge interneuronen is cruciaal voor de ontwikkelingsneurowetenschap.
- Verlies van genfunctie tijdens hersenontwikkeling roept vragen op over neurodevelopmentele stoornissen.
- Kostelijke technieken kunnen de diagnostische mogelijkheden voor stoornissen zoals autisme en epilepsie verbeteren.
- Elektroporatiemethoden maken gerichte manipulatie van genexpressie in vivo mogelijk.
Doel van het onderzoek
- Om de migratie en het gedrag van genetisch gemodificeerde GABAerge interneuronen in gekweekte omgevingen te visualiseren.
- Om de impact van genmutaties op neuronale ontwikkeling te identificeren.
- Om een toegankelijker methode te ontwikkelen voor het bestuderen van ontwikkelingsneurowetenschap.
Gebruikte methoden
- De methode maakt gebruik van organotypische slice-culturen afgeleid van muisembryo's.
- Het biologische model betreft corticale GABAerge interneuronen, met specifieke aandacht voor hun migratie.
- Elektroporatie wordt gebruikt om plasmide-oplossingen in de zich ontwikkelende hersenen te introduceren.
- Belangrijke stappen omvatten zorgvuldige embryo-dissectie, elektroporatie en opzetten van de cultuur voor beeldvorming.
- Incubatie en sectie voor beeldvorming worden kritiek getimed en gemonitord.
Belangrijkste resultaten
- De studie maakt de observatie van interne migratiepatronen van GABAerge interneuronen mogelijk.
- De verkregen inzichten kunnen de effecten van mutaties op ontwikkelingsprocessen verduidelijken.
- Mechanische en omgevingscondities tijdens dissectie en cultuur hebben een significant effect op de levensvatbaarheid en observatie.
- De resultaten zullen helpen bij het verduidelijken van de mechanismen die ten grondslag liggen aan neurodevelopmentele stoornissen.
Conclusies
- Deze techniek biedt een betrouwbaar platform voor het bestuderen van neuronale migratie en genfunctie.
- De methode staat op het punt de begrip van genetische invloeden op hersenontwikkeling te bevorderen.
- Inzichten kunnen benaderingen voor de behandeling van neurodevelopmentele stoornissen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D to study GABAergic interneuron migration in a near-physiological context, supporting target validation for neurodevelopmental disorders. By combining ex utero electroporation with organotypic slice cultures, it provides a scalable platform for mechanistic de-risking of gene candidates linked to autism and epilepsy. The approach enhances predictive confidence in early discovery by linking genetic manipulation to dynamic cellular phenotypes in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in migrating GABAergic interneurons to clarify pathogenic mechanisms of neurodevelopmental disorder mutations.
- Operational Value: Supports high-confidence target selection by linking genetic perturbation to quantifiable migration phenotypes in a disease-relevant system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative live-imaging readouts of nucleokinesis, process dynamics, and migration speed for assay standardization.
- Operational Value: Enables reproducible, time-lapse confocal imaging of interneuron behavior across genetic conditions for screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains endogenous guidance cues and thalamic inputs, improving translational relevance of migration phenotypes observed in cortical slices.
- Operational Value: Facilitates continuity from gene targeting in embryonic brain to phenotypic analysis in organotypic culture for preclinical de-risking.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling gene function screening in migrating interneurons prior to lead identification, supporting go/no-go decisions based on migration defect severity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene roles in interneuron migration through direct visualization of cytoskeletal dynamics and nucleokinesis.
- Screening: Delivers quantitative, time-resolved phenotypic outputs such as migration distance, branching, and pausing for comparative analysis across conditions.
- Analytics: Provides morphometric and kinetic measurements from time-lapse imaging and neuronal reconstructions to enable statistical comparison of genetic perturbations.
- Translational Research: Preserves endogenous cortical environment and migratory pathways, enhancing relevance of findings to human neurodevelopmental disorder models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative testing of gene candidates across multiple neurodevelopmental disorder targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by linking gene loss-of-function to specific migration defects in GABAergic interneurons.
- Operational Value: Offers a low-cost, standardized alternative to in utero electroporation with improved embryo survival and sectioning consistency.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets through phenotypic screening in a disease-relevant system.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of gene targets based on severity and specificity of migration phenotypes observed.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic dissection, ventricular injection, and electroporation parameters for MGE targeting.
- Depends on sterile technique, agarose embedding precision, and vibratory sectioning at 4°C to maintain tissue integrity.
- Necessitates environmental control during culture (37°C, 60% humidity, 5% CO2) and confocal imaging setup for time-lapse acquisition.
- Adaptation to other brain regions or cell types may require adjustments to electroporation orientation and culture duration.
- Practical limitations include dependency on embryo viability post-electroporation and section quality for consistent imaging of migrating interneurons.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:01
Collection of Mouse Embryos
2:51
Intraventricular Plasmid Injections and Ex Vivo Electroporation of the MGE
3:53
Brain Dissection and Organotypic Slice Cultures
7:16
Results: Time-lapse Live-imaging of Electroporated INs in Organotypic Slices Cultured for 48 h.
9:09
Conclusion
