Name: Ex Utero Electroporation en Organotypic Slice culturen van muis embryonale hersenen voor Live-Imaging van GABAergic interneuronen migreren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Leer een kosteneffectieve elektroporatiemethode voor organotypische hersensneden van muizenembryo's om GABAergische interneuronen tijdens tangentiële migratie te visualiseren. Deze techniek helpt onderzoekers genetische effecten op hersenontwikkeling te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de exploitatiesubsidies van de Savoy-Stichting en de Stichting CURE epilepsie en door apparatuur verleent van de Canadese Stichting voor innovatie E.R (confocal microscoop) en G.H (draaiende schijf confocal microscoop). E.R. ontvangt een carrière award van de Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S; Clinician-Scientist Award) en uit de Canadese instituten voor gezondheidsonderzoek (CIHR; Young Investigator Award). G.H. is een senior geleerde van de FRQ-S. Le is de ontvanger van de Steriade-Savoy postdoctorale opleiding award van de Savoy Foundation, de CHU Sainte-Justine Stichting postdoctorale opleiding award en de FRQ-S postdoctorale opleiding award, in samenwerking met de Stichting van de sterren. Dit project is mogelijk gemaakt door hersenen Canada via het Canada hersenen onderzoeksfonds, met de financiële steun van Health Canada, toegekend aan L.E.

Alle experimenten met dieren werden goedgekeurd door het Comité Institutionnel des Bonnes Pratiques avec les Animaux de Recherche (CIBPAR) in het CHU Sainte-Justine Research Center en werden uitgevoerd volgens de Canadese Raad op Animal Care guide de zorg en het gebruik van proefdieren (Ed. 2).
Het protocol hier beschreven is geoptimaliseerd voor electroporation van embryo's ten embryonale dage (e) 13,5, op een moment wanneer MGE afkomstige INs zijn actief gegenereerd, voordat de piek van CGE afkomstige INs productie45,46. Bovendien, om te bias de electroporation richting GABAergic INs, we gebruiken een promotor selectief uitgedrukt in INs (bijvoorbeeld de promotor van de Dlx5/6 met haar minimale versterker)47.
1. bereiding van oplossingen voor Electroporation en Organotypic Slice culturen
<ol><li>125 mL steriele kweekvloeistof voor te bereiden.<ol>
<li>125 mL voor regelmatige neuron-specific kweekmedium meten (Zie Tabel van materialen voor formulering) in een gesteriliseerde fles in een eerder UV-gesteriliseerde bioveiligheid kabinet gespoten met 70% ethanol. Voeg 2,25 mL 50 x serumvrij neuron-specifieke aanvulling, 1,75 mL 200mM glutamine (eindconcentratie van 0,5 mM) en 6,25 mL van warmte-geïnactiveerd paard serum eerder aliquoted onder steriele omstandigheden. Meng grondig, aliquot in 15 mL steriele conische buizen en bewaren bij 4 ° C. Opmerking: Bereid kweekmedium kunnen worden opgeslagen voor maximaal 3 weken bij 4 ° C.</li>
		<li>Verdeel een 100 X stockoplossing van Botteinstein de N-2 formulering48 in 150 µL aliquots onder steriele omstandigheden en bevriezen bij-20 ° C tot gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiden 1 L van steriele kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF).<ol>
<li>Maat 800 mL gedestilleerd water in een bekerglas van 1 L. Voeg 25.67 g van sacharose, 5.08 g natriumchloride (NaCl), 2.18 g natriumbicarbonaat (NaHCO3), 1,80 g glucose, 0,19 g van kaliumchloride (KCl), 0.15 g van monobasisch watervrij natriumfosfaat (NaH2PO4), 1 mL van de 1 M voorraad CaCl2 .2H2O en 2 mL 1 M voorraad MgSO4.7H2O. roer te ontbinden bij kamertemperatuur. Voeg gedistilleerd water te bereiken van een totaal volume van 1 L.</li>
		<li>Met behulp van een 0,22 µm filter, filtreer de oplossing in een steriele fles in een gesteriliseerde bioveiligheid kabinet en bewaren bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid een verse oplossing van 4% agarose in ACSF voor elk experiment.<ol>
<li>Meten van 25 mL eerder bereid ACSF in een steriele conische buis van 50 mL en voeg 1 g van lage-melting point agarose.</li>
		<li>Verwarm gedurende 45 s in een magnetron. Voorkom morsen, onderbreken verwarming elke 3-4-s wanneer het koken begint, opent u de buis zodat de druk uit, sluit u deze opnieuw en handmatig te mengen de agarose doorroeren. Herhaal totdat de agarose oplossing homogeen is. Bewaar de agarose oplossing bij 42 ° C gedurende de rest van het experiment te voorkomen van stollen. Opmerking: Hogere temperaturen zal hersenen weefsels beschadigen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. voorbereiding van plasmiden voor injectie
<ol><li>Trek een glazen microinjection pipet<ol>
<li>De trekker van de micropipet met de juiste parameters instellen, de glazen viscometerbuizen in de verstrekte ruimte beveiligen en ervoor te zorgen dat het met de gloeidraad is gecentreerd.</li>
		<li>Druk op de knop trek.</li>
		<li>Verwijder voorzichtig de nieuw gemaakte microinjection pipetten van de trekker van de warmte en de plaats in een doos of schone petrischaal tot verder gebruik om te voorkomen beschadiging van de tip.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Set-up het biosafety kast met alle instrumenten nodig voor dit experiment (Zie figuur 1A), royaal spuiten alle instrumenten in het biosafety kabinet met 70% ethanol en steriliseren van instrumenten en omgeving met UV-licht voor 15-20 min.</li>
	<li>Tijdens de sterilisatie stap, ontdooi plasmiden op ijs (4 ° C).</li>
	<li>Meet 10 µL van de plasmide van een stamoplossing (4 µg/µL) in een centrifugebuis schone 1,5 mL. 0,01% voor snel groen FCF toevoegen. Meng voorzichtig, kort draaien en houden op ijs tot gebruik. Opmerking: Maxi-prep DNA moet worden opgesteld volgens de fabrikant protocol met behulp van een endotoxine-gratis maxi-prep-kit. DNA kan worden solubilized in TE buffer of nuclease-vrije H2O en de voorbereiding van de plasmide met kleurstof oplossing kan, maar hoeft niet te worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden. Plasmiden van Maxi-prep moet aliquoted om te voorkomen dat meerdere bevriezen-ontdooien cycli. Aliquoted plasmiden moeten worden gemengd met de kleurstof niet meer dat 2 uur vóór gebruik en niet voor verder gebruik moeten worden refrozen.</li>
	<li>Na sterilisatie, bereidt u als volgt de nano-injector.<ol>
<li>Kies een van de eerder bereid glazen microinjection pipet opgeslagen in een schoon vak of petrischaal en gebruik kleine pincet te snijden het uiteinde van de pipet op schuine wijze tot een buitendiameter van ongeveer 15 µm. Opmerking: De hier gegeven buitendiameter is een benaderende maatregel om de gebruiker een idee geven van wat we in onze experimenten gebruiken en ter vergemakkelijking van de piercing van de schedel voor plasmide injectie zonder beschadiging van de hersenen, terwijl voor de vloeistof is geoptimaliseerd laden en vrijval van het DNA. De buitendiameter kan worden gemeten door te kijken naar het uitgesneden topje van de glazen microinjection pipet apposed aan een bar Micrometrische schaal onder een Microscoop helder veld.</li>
		<li>Gebruik een spuit te vullen van de micropipet met minerale olie van het unpulled einde (tot uitzetting van alle lucht).</li>
		<li>Plaats de micropipet gevuld glas in de nano-injector door het volgen van de instructies van de fabrikant.</li>
		<li>Lege 2/3rds van het glas micropipet (Houd er genoeg olie om te voorkomen dat de vermelding van de lucht).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zorgvuldig de bereid micropipet invoegen in de buis met de plasmide/kleurstof oplossing en vul de glazen micropipet met de plasmide/kleurstof oplossing.</li>
</ol>3. collectie van muis embryo's van zwangere koeien
<ol><li>Het bewaken van vrouwelijke fokdieren dagelijks te beoordelen voor vaginale inpluggen, bij voorkeur op hetzelfde moment dagelijks (begin van de middag). Dag e0.5 komt overeen met de eerste dag wanneer een vaginale plug wordt waargenomen. Opmerking: De hier beschreven experimenten kunnen worden uitgevoerd in wild-type muizen. Ter vergemakkelijking van de identificatie van de MGE en op het etiket van alle GABAergic INs (of zoals MGE afkomstige INs specifieke sub sets), transgene dieren kunnen echter worden gebruikt (bijvoorbeeld: GAD67EGFP; Dlx5/6Cre met een Cre-reporter allel,4947,enz.). In deze situatie moet de experimentele plasmide geïnjecteerd express een andere fluorophore (bijvoorbeeld mCherry of TdTomato) zodat de visualisatie van de transfected INs (geel) die kan worden vergeleken met niet-transfected INs (groen).</li>
	<li>Het vrouwtje op embryonale dag e13.5, offeren door nek dislocatie. Opmerking: Verdoving agenten gegeven op het moment van offer IN migratie en overleving50,51 invloed kunnen en moeten worden vermeden.</li>
	<li>Verzamelen van embryo's door C-section als volgt.<ol>
<li>Royaal spuiten de vrouwelijke buik met 70% ethanol. De buikhuid optrekken met een paar van gesteriliseerde pincet en, met de andere hand, gebruik gesteriliseerd chirurgische schaar te snijden van de huid van de buik.</li>
		<li>Met een tweede paar van gesteriliseerde pincet en schaar, de abdominale fascia optrekken en snijd het terwijl het zorgvuldig het vermijden van de baarmoeder.</li>
		<li>Met behulp van een derde paar gesteriliseerde pincet en schaar, trek de baarmoeder horens en snij ze uit het bekken holte. Plaats de ontleed uteriene hoorns in een steriele 60 mm petrischaal gevuld met neurale gebaseerde kweekmedium aangevuld met aminozuren, vitaminen en anorganische zouten (Zie Tabel van materialen voor commercieel beschikbaar product).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gebruik in een steriele bioveiligheid kabinet, twee paar fijne pincet (één in elke hand) om te ontleden de embryo's uit de placenta en de hoofden isoleren door onthoofding.</li>
	<li>Schuine kant-knippen de tip van een steriele 3 mL kunststof transfer pipette, gecombineerd de hoofden en overdracht hen in een nieuwe steriele petrischaal van 60 mm gelaagd met gestolde zwarte wax en gevuld met hetzelfde neurale gebaseerde aangevuld kweekmedium als hierboven. Opmerking: Deze stap minimaliseert de overdracht van contaminanten (muis haar, bloed). De zwarte wax wordt gebruikt om het hoofd te stabiliseren tijdens dissectie. Voedingsbodems hoeft niet te worden zuurstof tijdens deze procedures.</li>
</ol>4. intraventricular plasmide injecties en Ex Vivo Electroporation van de MGE
Opmerking: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in het eerder bereid biosafety kabinet.
<ol><li>Plaats de petrischaal 60 mm gelaagd met zwarte wax en met de onthoofde hoofden in neurale gebaseerde kweekmedium onder de verrekijker in het kabinet biosafety aangevuld.</li>
	<li>Stabiliseren van het hoofd, de rostraal deel naar rechts, met een fijne pincet met de linkerhand en gebruik de nano-injector in de rechterhand te injecteren van 1-2 µL van de plasmide/kleurstof-oplossing in de rechts laterale ventrikel. Opmerking: Co expressie experimenten kunnen worden uitgevoerd door co-electroporating een plasmide redding en een plasmide shRNA-uitdrukken door het mengen van beide plasmiden bij de concentraties van het mengsel.</li>
	<li>Electroporate de ingespoten hersenen.<ol>
<li>Plaats het hoofd tussen de elektroden met de negatieve elektrode geplaatst dorsally en evenwijdig aan het hoofd en de positieve elektrode naar de ventrale zijde van het hoofd te richten op de MGE.</li>
		<li>Zodra de elektroden goed geplaatst zijn, leveren 4 vierkante pulsen van 40 V voor 50 ms bij 500 ms Inter pulse intervallen.</li>
		<li>Verwijder eventuele resterende weefsel van de elektroden met pincet reeds geplaatst in het biosafety kabinet. Opmerking: Deze parameters zijn geoptimaliseerd specifiek voor de electroporator gebruikt in onze experimenten. Het is raadzaam dat de gebruikers optimaliseren tests vooraf uitvoeren als gebruiken van een verschillend type van electroporator.</li>
		<li>Herhaal stap 4.1 tot 4.3 voor alle resterende hersenen. Opmerking: Hoewel dit protocol de manipulaties vereist voor één hersenen beschrijft, is het mogelijk om te injecteren maximaal 4 hersenen sequentieel voordat electroporating elke hersenen, waardoor de opbrengst. Deze strategie is vooral voordelig wanneer 2 of meer verschillende plasmiden zijn ingespoten sequentieel (bijvoorbeeld controle of experimentele plasmide) tijdens hetzelfde experiment (waardoor vergelijking tussen nestgenoten). Daarnaast is het mogelijk om te injecteren en electroporate tegelijk beide kanten van de hersenen te verhogen van het rendement, door de positionering van de elektroden volledig parallel aan het oppervlak van de hersenen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. brain dissectie en Organotypic Slice culturen
<ol><li>Terwijl nog manipuleren in de steriele omgeving van het biosafety kabinet, ontleden de hersenen uit de schedel.<ol>
<li>Het stabiliseren van het hoofd op de laag van zwarte was door het invoegen van een naald in elk van beide ogen terwijl het zorgvuldig het vermijden van de hersenen.</li>
		<li>Gebruik een paar fijne pincet te houden van de linker zijkant van de nek en een tweede paar fijne pincet te scheuren van de huid van de schedel, van terug naar voorzijde.</li>
		<li>Houd het hoofd zijdelings met een pincet in de ene hand en kunt een ander paar pincet in de andere hand zorgvuldig gesneden de schedel op het niveau van de hersenstam en trek voorzichtig de schedel. Met elke pincetten, snij de schedel in het sagittale vlak (middellijn) naar voren en vervolgens incise lateraal te bevrijden van de fragmenten van de schedel.</li>
		<li>Til de hersenstam en de hersenvliezen en de hersenzenuwen zorgvuldig gesneden tot de hersenen volledig uit de schedel is. Opmerking: Alle stappen die worden beschreven in punt 5.1 moeten worden uitgevoerd onder strenge steriele omstandigheden in een kabinet bioveiligheid.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De hersenen in 4% laag-melting point agarose voor afdelen insluiten.<ol>
<li>Vul een 35-mm petrischaal met de agarose oplossing bereid boven (vloeibare gehouden bij 42 ° C).</li>
		<li>Breng snel een electroporated hersenen aan de agarose gevulde schotel met behulp van de eerder gesneden overdracht pipet. De schotel houden bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Roer de agarose met een metalen stok om te houden van de hersenen in het midden van de put (om te voorkomen dat zinken) en de positie van de hersenen in een rostro-caudal vlak evenwijdig aan de schotel. Stoppen met roeren wanneer het agarose begint te stollen, om te voorkomen dat eventuele schade aan de hersenen.</li>
		<li>Gebruik een scheermesje te snijden de agarose rond de hersenen om te vormen van een rechthoekig blok, waardoor een marge van 1-2 millimeter rond de hersenen. Zorg ervoor dat de rostraal deel van de hersenen loodrecht op de voorste grens van het blok om de afdrukstand voor de volgende vectorafbeeldingsbestanden stappen.</li>
		<li>Herhaal voor elke hersenen. Opmerking: Het is mogelijk om meer dan één hersenen tegelijk (maximaal 3) gesneden door de indeling van afzonderlijke agarose blokken tijdens het instellen van elke hersenen op verschillende hoogtes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vibratome coronale secties en segment cultuur.<ol>
<li>Dooi een aliquoot gedeelte van het 100 X N-2 (150 µL) aanvulling op ijs en voeg aan 15 mL aliquoted kweekmedium onder steriele omstandigheden.</li>
		<li>750 µL cultuurmedium (met 1 X N2 supplement) overdragen aan elk putje van de plaat van een 6-well cultuur.</li>
		<li>Met gebogen pincet, één cel cultuur invoegen (30 mm diameter, 0.4 µm poriegrootte, PTFE) in elk medium gevulde goed te plaatsen.</li>
		<li>Vul het vibratome bad met continu zuurstofrijk ACSF. Koelen tot 4 ° C met ijs rond het bad, of gebruik een gekoelde vibratome.</li>
		<li>Zet de snelheid van de vibratome naar 0.150 mm/s en de frequentie aan 80 Hertz.</li>
		<li>Lijm het agarose blok op het platform van de vibratome, de rostraal rand naar beneden en de ventrale rand geconfronteerd met de gebruiker.</li>
		<li>Snijd de hersenen in coronale secties te verkrijgen van 250 µm dik secties (bij 4 ° C).</li>
		<li>Verzamelen met gesteriliseerde spatels, 2-3 secties met de MGE en plaats alle secties van de hersenen van het ene dier op een enkel 30 mm membraan invoegt, terwijl het vermijden van overlapping tussen secties zorgvuldig. Plaats de invoegen in een put van een 6-well cultuur plaat (met 750 µL cultuurmedium aangevuld, zoals hierboven beschreven). U kunt ook kan elke sectie worden geplaatst op een aparte 13-mm diameter membraan in een 12-well cultuur bord gevuld met 500 aangevuld µl cultuurmedium. De hoeveelheid kweekmedium aanbevolen voor elk putje kunt de gedeelten van de hersenen te worden gevoed door de media zonder wordt ondergedompeld. Opmerking: De stappen die worden beschreven in 5.3.6 en 5.3.7 worden niet uitgevoerd onder volledige steriele condities, tenzij de vibratome kan worden gesteriliseerd en kan worden gebruikt in een kabinet bioveiligheid. Het is daarom van cruciaal belang voor het uitvoeren van deze stappen zorgvuldig om elke besmetting te voorkomen. Passende beschermende uitrusting (schone masker, chirurgische handschoenen en laboratoriumjas) moet gedragen worden in alle tijden en lichaamsdelen, zelfs vallen, zoals haren, gezicht en handen, moet cultuur platen (met of zonder kweekmedium) nooit voorbij. Het is ook aanbevolen om het spuiten van 70% ethanol vaak op de handschoenen en spatels gebruikt voor het verzamelen van de secties van de hersenen.</li>
		<li>Plaats de plaat van de cultuur in een geventileerde steriele incubator bij 37 ° C met 60% vochtigheid en 5% CO2 voor 48 of 72 h. Opmerking: Deze incubatie tijden werden geoptimaliseerd voor time-lapse beeldvorming van MGE afkomstige INs en confocal beeldvorming van vaste segmenten, respectievelijk. Optimale incubatie keer moeten vooraf worden getest voor elk experimenteel design. Bovendien, behoeft als de gekozen incubatie 72 h is en onder, niet te veranderen van het kweekmedium. Voor langere momenten van de incubatie, moet het kweekmedium worden gewijzigd om 2-3 dagen.</li>
		<li>Na de gewenste incubatietijd, de secties van belang overbrengen in een 8-chambered dekglaasje aan en voeg 3-5 µL cultuurmedium. Plaats het dekglaasje aan in een milieu kamer (37 ° C, luchtvochtigheid van 60%, 5% CO2) op een omgekeerde aangesloten draaiende schijf confocal uitgerust met de software van een computer-assisted verwerving aan opstelling de time-lapse imaging sessie. Opmerking: U kunt ook secties kunnen worden opgelost met 4% paraformaldehyde ('s nachts bij 4 ° C of 2 h bij kamertemperatuur) en vervolgens immunostained met verschillende antilichamen voor visualisatie van de morfologische kenmerken van electroporated INs onder een confocale Microscoop. Hoewel eGFP en mCherry kunnen worden gevisualiseerd door confocale microscopie zonder contra kleuring van proces, is het raadzaam het uitvoeren van immunohistochemistry tegen GFP en mCherry ter versterking van het signaal omdat de fixatie proces fluorescentie verminderen kan, verminderen het opsporen van fijnere onderdelen van embryonale neuronen, zoals kleinere takken in de voorloop- of naloopspaties processen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen. De standpunten die hierin noodzakelijkerwijs niet de visie van de Minister van volksgezondheid of de regering van Canada.

In dit artikel bieden wij een betrouwbare methode voor het uitvoeren van ex utero electroporation van de muis MGE op e13.5 en voor de generatie van organotypic culturen van embryonale hersenen segmenten. Hoewel in vitro methoden, zoals de Boyden kamer Assay, zijn relatief gemakkelijk uit te voeren en kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van de specifieke rol van verschillende genen en eiwitten zonder tussenkomst van andere factoren, zij het onderzoek van de IN de weg dat migratie dynamiek met betr...

Corticale GABAergic interneuronen (INs) zijn divers met betrekking tot hun eigenschappen van biochemische, fysiologische eigenschappen en connectiviteit, en bemiddelen zij verschillende functies in volwassen netwerken1,2,3 ,4,5. De specificatie van verschillende subtypen van corticale INs is strak geregeld door middel van genetische cascades die uitgebreid bestudeerde1,2 zijn. Het merendeel (70%) van corticale GABAergic INs zijn afkomstig uit de vermelding in de mediale ganglionaire eminentie (MGE), een ventrally gelegen embryonale structuur, en moet migreren over relatief lange afstanden te bereiken van de corticale plaat1, 2 , 6. terwijl de corticale piramidale cellen migreren radiaal van de ventriculaire zone (VZ) naar de corticale plaat langs de radiale glia steiger, de tangentiële migratie van INs, die zijn niet gekoppeld aan een dergelijke steiger, vereist een verscheidenheid van intrinsieke en Extrinsieke signalen te trekken migreren neuronen richting de corticale plaat, terwijl begeleiden hen uit de buurt van niet-corticale structuren2,7,8. Na het verlaten van de celcyclus, INs zijn afgestoten uit de MGE door middel van chemo-afstotend signalen uitgedrukt binnen de VZ van de MGE, die triggers van tangentiële migratie naar de corticale plaat9,10. Migreren van INs voorkomen het striatum met behulp van verschillende afstotend aanwijzingen11 en, na het bereiken van de corticale plaat, ze overschakelen van een tangentiële naar een radiale migratiemodus en bereiken hun definitieve laminaire standpunt, mede in reactie op signalen van piramidale cellen12 en andere cellulaire bevolking13. De migratie van INs, wat betreft andere neuronale populaties, omvat verschillende dynamische morfologische veranderingen zodat de werkelijke beweging van het neuron. Deze zogenaamde neuronale motoriek wordt gekenmerkt door herhaalde cycli van drie opeenvolgende stappen: de rek van een toonaangevende proces, een actieve anterograde motie van de kern (nucleokinesis), en de intrekking van de afsluitende proces14. Migratie is gereglementeerd door talrijke intrinsieke en extrinsieke signalen dat station de vertakking en actieve verbouwing van het toonaangevende proces begeleiden INs in de juiste richting, bepalen van zowel de richting en de snelheid van migratie14,15 ,16.
De regulering van de corticale migratie determinanten zijn uitvoerig bestudeerd in de afgelopen jaren1,2,7,17,18,19,20, en ontwrichting in sommige van deze moleculaire actoren heeft geweest gepostuleerd leiden tot neurologische aandoeningen, zoals pediatrische Refractaire Epilepsie of autisme spectrum stoornissen1,2,21, 22 , 23 , 24. daarom de ontwikkeling van verschillende benaderingen van in vitro en in vivo heeft uitgeoefend om ons vermogen om te studeren dit dynamisch proces, als eerder gerecenseerd25aanzienlijk verder te gaan. In vitro methoden, met inbegrip van de bepaling van Boyden kamer en de Stripe keuze Assay, bieden de snelste en meest reproduceerbare middelen voor de beoordeling van de eis en de cel-autonome impact van specifieke genen of eiwitten tijdens de neuronale migratie zonder de invloed van andere factoren-25. Deze testen zijn met name handig wanneer gecombineerd met live-imaging8,26,27. Met deze technieken, INs gemakkelijk kunnen worden opgehaald van e13.5 MGE en geïsoleerd door enzymatische en mechanische dissociatie, waarna verschillende signaalroutes en begeleiding signalen kunnen worden onderzocht, zoals eerder geïllustreerd8,28 . Echter, deze tests vinden plaats in een kunstmatige extracellulaire matrix in de afwezigheid van drie-dimensionale weefsel architectuur, die van neuronale gedrag en cel eigenschappen veranderen kan, potentieel op het gebied van migratie en/of overleving van de cel25. Om te omzeilen deze beperkingen, zijn ex vivo MGE explantaten ontwikkeld als een alternatieve instrument te kwantificeren van de dynamische morfologische veranderingen die zich voordoen tijdens de migratie samen met parameters zoals snelheid en oriëntatie14, 29. Genereren van MGE explantaten is betrekkelijk eenvoudig en uitgebreid is geweest30elders beschreven. Goed bestuur houdt de beplating van een klein uittreksel van de MGE op een monolayer van gemengde corticale cellen of in een mengsel van matrigel en collageen in de aanwezigheid van aantrekkelijke of weerzinwekkend signalen25, hoewel de laatste optionele31 zijn. MGE explantaten toestaan voor hoge resolutie imaging van dunbevolkte gelabelde cellen, vereenvoudiging van de studie van intracellulaire processen, zoals het cytoskeletal remodelleren toonaangevende tijdens vertakking, zoals eerder32,33 ,34 en in de huidige studie. MGE explantaten hebben met succes gebruikt om te beoordelen van dynamische cytoskeletal veranderingen tijdens de migratie in een 2D omgeving, bijvoorbeeld na specifieke farmacologische of Chemotactische manipulaties (zie bijvoorbeeld Tielens et al. 201633) . Echter, met deze benadering, INs migreren binnen een kunstmatige matrix, en dit kan worden gewijzigd IN het gedrag en de reproduceerbaarheid en de betekenis van de experimentele resultaten.
Daarentegen, in utero electroporation kan de genetische manipulatie van INs in hun eigen omgeving en is een veel gebruikte methode om snel en efficiënt beoordelen de impact van winst en verlies van de genfunctie tijdens het omzeilen van de beperkingen van kostbare en tijdrovende knock-out en knock-in strategieën25,35. In utero electroporation kan een vertekend beeld geven richting IN de progenitoren met behulp van cel type specifieke initiatiefnemers en door positionering van de elektroden naar ventromediale structuren, met inbegrip van de MGE36. Bovendien, in utero electroporation zorgt voor de tijdige uitdrukking van experimentele constructies binnen 1-2 dagen, in vergelijking met de 7-10 dagen nodig voor construct expressie met behulp van virale vectoren25. Echter, in utero electroporation van IN progenitoren neigt te zijn van lage-opbrengst. Inderdaad, hoewel piramidale cel progenitoren gelegen in de dorsale ventriculaire zone kunnen efficiënt zijn transfected gebruiken in utero electroporation, gericht op meer ventrally gelegen structuren, zoals de MGE, is meer technisch uitdagende, vooral in kleine e13.5 vermindert embryo's en het hoge tempo van embryonale letaliteit verder de experimentele opbrengst25.
Te omzeilen enkele technische beperkingen in vitro gekoppeld MGE explant experimenten en in vivo in utero electroporation, ex vivo organotypic segment culturen geweest ontwikkelde8,37, 38,39. Hersenen organotypic segment culturen bieden het voordeel van het nabootsen van in vivo voorwaarden, terwijl het minder dure en tijdrovende dan genereren25 diermodellen. Inderdaad, deze preparaten toestaan een gemakkelijke toegang tot de MGE, samen met de specifieke visualisatie van INs, en kunnen worden gecombineerd met focal electroporation te onderzoeken van specifieke moleculaire pathways in INs migreren in een meer fysiologische omgeving8 , 39 , 40 , 41. Wij hebben daarom een aanpak voor organotypic culturen38, waarin we gecombineerd met ex utero electroporation en time-lapse confocal imaging geoptimaliseerd, verdere beoordeling van de morfologische en dynamische proces optreedt tijdens de tangentiële migratie van MGE-INs. Dit protocol werd aangepast en geoptimaliseerd van anderen die hebben gebruikt ex utero of in utero hersenen electroporation en organotypic segment culturen bij het bestuderen van de migratie van piramidale cellen42,43 en corticale INs36,39,44. In het bijzonder muis embryo's zijn onthoofd en de MGE is electroporated ex vivo na de intraventricular injectie van de experimentele plasmiden, waardoor meer efficiënte en nauwkeurige targeting van MGE voorlopercellen dan wat kan worden bereikt met in utero electroporation. De hersenen worden vervolgens uitgepakt en gesegmenteerd in hele hersenen coronale plakjes die kunnen worden gekweekt voor een paar dagen, waardoor continu bijhouden en beeldvorming van transfected INs. Deze aanpak meestal etiketten het tangentieel migreren INs 5-20 per segment van de hersenen, het minimaliseren van het aantal experimentele iteraties verplicht te bereiken van statistische significantie, terwijl het labelen van een voldoende neuronale bevolkingsdichtheid zodat eenvoudige scheiding van Individuele neuronen voor wederopbouw en fijne morfologische beoordeling. Bovendien, in vergelijking met MGE explantaten, organotypic culturen zorgen dat migreren INs worden blootgesteld aan een meer natuurlijke omgeving, met inbegrip van lokaal secreted chemokines en inbreng van de thalamus afferents. Deze aanpak is dus zeer geschikt voor het kwantificeren van de directionaliteit en trekkende pad goedkeuring door transfected INs, terwijl het aanbieden van voldoende anatomisch gedetailleerde informatie over de karakterisatie van fijnere dynamische processen zoals het leidende proces vertakking, zodat nucleokinesis en afsluitende proces intrekking.

<table><tbody><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21103049</td><td>Commercieel verkrijgbaar neuron-specifiek kweekmedium. Volledige formulering beschikbaar op deze website: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html</td></tr><tr><td>B-27 serum-free supplement</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504044</td><td>50X Serum-vrij neuron specifiek supplement</td></tr><tr><td>15 mL steriele centrifugebuizen</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11415064</td><td>Commercieel verkrijgbaar op neuronen gebaseerd kweekmedium gesupplementeerd met aminozuren, vitaminen en anorganische zouten. Volledige formulering beschikbaar op de website van de distributeur&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Paarden serum, hitte geïnactiveerd</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H1138-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Neurocell supplement N-2 100X</td><td>Wisent</td><td>305-016</td><td>Bottenstein's N-2 Formulering</td></tr><tr><td>VWR Vierkante PETG Media Flessen 125 mL</td><td>VWR</td><td>89132-062</td><td></td></tr><tr><td>Class II Type A Bioveiligheidskast</td><td>Nuaire</td><td>NU-540</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>BioShop</td><td>SUC700.1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>BioShop</td><td>SOD001.1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>D+ glucose</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G7528-250G</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfosfaat monobasisch anhydrisch</td><td>BioShop</td><td>SPM400.500</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride dihydraat&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat heptahydraat</td><td>BiosShop</td><td>MAG522</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BioShop</td><td>AGA002.500</td><td></td></tr><tr><td>50 mL steriele centrifugebuizen</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL centrifugebuizen</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>P-97 Flaming/Brown Micropipet puller</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>Model P-97</td><td></td></tr><tr><td>0,4 mm I.D. x 75 mm capillaire buis</td><td>Drummond scientific</td><td>1-000-800/12</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>E193</td><td></td></tr><tr><td>5 mL spuit</td><td>Becton Dickinson &amp; Co</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Mineralolie (zwaar)</td><td>Rougier Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WPI Zwitserse Pincetten #5</td><td>World Precision Instruments</td><td>504511</td><td>11 cm, recht, 0,06x0,07mm uiteinden, antimagnetisch. U hebt er 2 van nodig.</td></tr><tr><td>WPI Zwitserse Pincetten #7</td><td>World Precision Instruments</td><td>504504</td><td>11,5 cm, 0,18x0,2mm, gebogen uiteinden</td></tr><tr><td>HTC Pincetten</td><td>World Precision Instruments</td><td>504617</td><td>11 cm, recht, plat</td></tr><tr><td>Operatie schaar</td><td>World Precision Instruments</td><td>501225</td><td>16 cm, scherp/scherp, recht. U hebt er 3 van nodig.</td></tr><tr><td>Dressing Pincetten</td><td>World Precision Instruments</td><td>501217</td><td>12,5 cm, recht, gekarteld</td></tr><tr><td>Iris Pincetten</td><td>World Precision Instruments</td><td>504478</td><td>10,2 cm, volledige curve, gekarteld</td></tr><tr><td>DeBakey Tissue Pincetten</td><td>World Precision Instruments</td><td>501996</td><td>15 cm, 45&deg; hoek, Delicate kaak, 1,5mm breed</td></tr><tr><td>Fisherbran Microspatula met afgeronde uiteinden</td><td>FisherScientific</td><td>21-401-5</td><td>U hebt er 2 van nodig.</td></tr><tr><td>Nanoject II Auto-Nanoliter Injector</td><td>Drummond scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>TC Dish 60, Standaard</td><td>Sarstedt</td><td>83.3901</td><td>60-mm schaal</td></tr><tr><td>Weefselcultuur schaal</td><td>Sarstedt</td><td>83.1800</td><td>35-mm schaal</td></tr><tr><td>Zwarte Wax</td><td>FisherScientific</td><td>S17432</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipetten&nbsp;</td><td>Ultident</td><td>170-CTB700-212</td><td>3 mL, kleine kop</td></tr><tr><td>Stereo Microscoop</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica M80</td><td>In vervanging van onze stereomicroscoop die door de fabrikant is stopgezet (StereoMaster van FisherScientific)</td></tr><tr><td>Electro Square Porator</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>ECM 830</td><td></td></tr><tr><td>Tweezertrodes, platina bekleed, 3mm</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0487</td><td></td></tr><tr><td>25G 1 1/2</td><td>Becton Dickinson &amp; Co</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>Leica VT1000S Vibrerende mes microtome</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>GEM, Enkele rand scheermesje</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71952-10</td><td>Verwijder de stompe kant voordat u deze in de mes aangegeven ruimte van de vibratome inbrengt</td></tr><tr><td>&micro;-Slide 8 wel</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td>Verpakking van 15</td></tr><tr><td>Millicell celkweek inzetstuk</td><td>Millipore-Sigma</td><td>PICM0RG50</td><td>30 mm, hydrofiel PTFE, 0,4 &micro;m poriën, verpakking van 50.&nbsp;</td></tr><tr><td>Leica DMi6000 microscoop</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Spinning disk confocale hoofd Ultraview Vox</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Volocity 6.0 acquisitiesoftware</td><td>Improvision/Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>LiveCell Stage top incubatie systeem</td><td>Pathology devices</td><td>LC30030</td><td>Biedt temperatuur, CO2 en vochtigheidscontrole.&nbsp;</td></tr><tr><td>SP8 confocale microscoop</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mCherry-Lifeact-7</td><td>Addgene</td><td>54491</td><td>Gift van Michael Davidson</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Millipore-Sigma</td><td>F7258-25G</td><td>25G fles, gecertificeerd door de Biological Stain Commission</td></tr></tbody></table>

ex utero electroporation en organotypic slice culturen van muis embryonale hersenen voor live-imaging van gabaergic interneuronen migreren

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABAergic interneuronen (INs) zijn kritieke onderdelen van neuronale netwerken dat station cognitie en gedrag. INs bestemd voor het vullen van de cortex tangentieel migreren van hun plaats van herkomst in het ventrale telencephalon (met inbegrip van de mediale en caudal ganglionaire eminenties (MGE, CGE)) naar de dorsale corticale plaat in reactie op een verscheidenheid van intrinsieke en extrinsieke signalen. Verschillende methoden zijn ontwikkeld de afgelopen jaren genetisch manipuleren van specifieke studierichtingen en onderzoeken hoe zij de dynamische cytoskeletal veranderingen die nodig zijn voor goede werking regelen IN migratie. In utero electroporation is uitgebreid gebruikt voor het bestuderen van het effect van gene onderdrukking of overexpressie in specifieke IN subtypen terwijl het beoordelen van de effecten op de morfologie en definitief standpunt. Echter, terwijl deze aanpak gemakkelijk gebruikt wordt voor radiaal migreren piramidale cellen wijzigen, het is meer technisch uitdagende wanneer gericht op INs. In utero electroporation een lage opbrengst gegeven de verminderde overlevingscijfers van pups genereert wanneer Electroporation geschiedt vóór e14.5, zoals gebruikelijk is bij de studie van INs MGE-afgeleide. In een alternatieve benadering, MGE explantaten bieden gemakkelijk toegang tot de MGE en vergemakkelijken van de beeldvorming van genetisch gemodificeerde INs. Echter, in deze explantaten, INs migreren naar een kunstmatige matrix, verstoken van endogene begeleiding signalen en de thalamus ingangen. Dit leidde ons te optimaliseren van een methode waar INs in een meer natuurlijke omgeving, migreren kunt terwijl het omzeilen van de technische uitdagingen van in utero benaderingen. In dit artikel beschrijven we de combinatie van ex utero electroporation van muis embryonale hersenen gevolgd door organotypic segment culturen gemakkelijk bijhouden, afbeelding en reconstrueren van genetisch gemodificeerde INs migreren over hun natuurlijke paden in reactie op endogene signalen. Deze aanpak maakt het mogelijk voor zowel de kwantificering van de dynamische aspecten van migratie met time-lapse confocal beeldvorming, evenals de gedetailleerde analyse van verschillende morfologische parameters met behulp van neuronale reconstructies op vaste immunolabeled weefsel.

In deze sectie bieden wij representatieve resultaten verkregen na de ex utero electroporation van een controle-plasmide of een experimentele plasmide gericht op een gen van belang, in de MGE van e13.5 muis embryo's gevolgd door organotypic segment culturen geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 48 uur (voor time-lapse imaging) of 72 h (voor fixatie en labelen van immunohistochemical) (Zie figuur 1B voor schematisch protocol). Representatieve voorbeelden va...

Hier bieden we een goedkope en betrouwbare methode voor het genereren van electroporated brein organotypic segment culturen van muis embryo's geschikt voor confocale microscopie en live-imaging technieken.

Ex Utero Electroporation en Organotypic Slice culturen van muis embryonale hersenen voor Live-Imaging van GABAergic interneuronen migreren

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

Het algemene doel van dit experiment is om genetisch gemodificeerde corticale GABAerge interneuronen te visualiseren tijdens tangentiële migratie in de meest natuurlijke omgeving die mogelijk is. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de ontwikkelingsneurowetenschappen door het screenen van de impact van het verlies van functie van specifieke genen of eiwitten tijdens de ontwikkeling van de hersenen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een lage kosten en relatief eenvoudig uit te voeren is in vergelijking met andere vergelijkbare methoden zoals elektroporatie in utero.Deze techniek kan uiteindelijk de diagnose voor patiënten met genetische neurodevelopmentele stoornissen zoals autisme en epilepsie verbeteren door de pathogenetische eigenschappen van specifieke mutaties die bij patiënten zijn geïdentificeerd te verduidelijken, evenals de rol van nieuwe ziektegenen tijdens de ontwikkeling van de hersenen. Begin met het instellen van de bioveiligheidskast met alle instrumenten die nodig zijn voor dissectie en kweek. Spuit alle instrumenten in de bioveiligheidskast royaal in met 70%ethanol en steriliseer de instrumenten en het interie

ex-utero-electroporation-organotypic-slice-cultures-embryonic-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We presenteren een methode om organotypische plakjes van mid-dracht muis embryo's voor te bereiden op de teelt en de time-lapse imaging van perifere zenuwen uitgroei.

Organotypische Slice Cultuur van GFP-expressie muis embryo&#39;s voor real-time beeldvorming van perifere zenuwen uitgroei

Een methode om organotypische segmenten van de E12.5 muriene embryonale middenhersenen genereren is beschreven. De organotypische slice culturen kan worden gebruikt om het gedrag van dopaminerge neuronen of andere ventrale middenhersenen neuronen te observeren.

Organotypische Slice culturen van embryonale ventrale middenhersenen: Een systeem om Dopaminerge Neuronale Development Study In vitro</em

Om een ​​snelle evaluatie van de functie van genen in de ontwikkeling van cerebrale cortex voeren beschrijven we werkwijzen...

Methoden voor Studie van Neuronale Morphogenesis:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi Elektroporatie in Embryonale Murine Cerebral Cortex

Source: Wiegreffe, C., et. al.,  Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (2017) This video demonstrates time-lapse confocal microscopy to observe cortical neuron radial migration from the subventricular zone to the cortical plate via radial glial scaffolds in transduced mouse embryonic brain slices.

Time-Lapse Imaging of Cortical Neuron Radial Migration in Transduced Mouse Embryonic Brain Slices

Source: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the procedure for injecting a plasmid vector carrying the gene of interest into interneuron progenitors in an embryonic brain slice, followed by electroporation for plasmid entry and gene expression. These modified progenitors can later be used for treating brain disorders.

Agarose-Embedded Electroporation-Assisted Gene Transfer in Mouse Cortical Interneuron Progenitors

Neuroblast migratie is een fundamentele gebeurtenis in postnatale neurogenese. We beschrijven een protocol voor efficiëntie-etikettering van neuroblasts door in vivo postnatale elektroporatie en de daaropvolgende visualisatie van hun migratie met behulp van time-lapse imaging van acute hersenen plakjes. Wij beschikken over een beschrijving van de kwantitatieve analyse van neuroblast dynamiek door video-tracking.

In vivo Postnatale Elektroporatie en time-lapse imaging van neuroblast Migratie in Muis Acute Brain Slices

Hier presenteren we een protocol dat een hulpmiddel biedt om regulerende mechanismen van specifieke genen tijdens de ontwikkeling van de hippocampus te onderzoeken. Het gebruik van ex utero elektroporatie en organotypische plakcultuur maakt de op- en neerregulatie van de expressie van genen van belang in enkele cellen mogelijk en volgt hun lot tijdens de ontwikkeling.

Ex Utero Electroporatie en Organotypische Slice Cultuur van de muis hippocampus Tissue

Dit manuscript biedt protocollen die gebruik maken van in de baarmoeder elektroporatie (IUE) om de structurele connectiviteit van neuronen te beschrijven op het single-cell niveau en de prikkelbaarheid van fluorescent gelabelde neuronen. Histologie wordt gebruikt dendritische en axonale uitsteeksels karakteriseren. Whole-cell opname in acute plakjes wordt gebruikt om prikkelbaarheid te onderzoeken.

In Utero Elektroporatie benaderingen om de prikkelbaarheid van neuronale subpopulaties en Single-cell Connectivity Studie

Dit protocol geeft instructies voor directe observatie van radiaal migrerende corticale neuronen. Bij utero- elektroporatie, organotypische snijcultuur en tijdverlopen confocal beeldvorming worden gecombineerd om de effecten van overexpressie of downregulatie van genen die geïnteresseerd zijn in migrerende neuronen direct en dynamisch te bestuderen en hun differentiatie tijdens de ontwikkeling te analyseren.

Time-lapse Confocal Imaging van Migreren Neuronen in Organotypische Slice Cultuur van Embryonale Muishersenen Met behulp van<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporatie

Dit protocol demonstreert een eenvoudige en robuuste methode om in situ axongroei en groeikegeldynamiek te bestuderen. Het beschrijft hoe ex vivo fysiologisch relevante acute hersenplakken kunnen worden bereid en biedt een gebruiksvriendelijke analysepijplijn.

In situ Visualisatie van Axon-groei en groeikegeldynamiek in acute ex vivo embryonale hersenplakculturen

Tijdens de ontwikkeling van de hersenschors ontstaan neuronen en gliacellen in de ventriculaire zone die het ventrikel bekleedt en migreren ze naar het hersenoppervlak. Bij dit proces zijn veel genen betrokken. Dit protocol introduceert de techniek voor de time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen.

Time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen in embryonale hersenplakjes van muizen

Leer een kosteneffectieve elektroporatiemethode voor organotypische hersensneden van muizenembryo's om GABAergische interneuronen tijdens tangentiële migratie te visualiseren. Deze techniek helpt onderzoekers genetische effecten op hersenontwikkeling te bestuderen.

Ex Utero Electroporation en Organotypic Slice culturen van muis embryonale hersenen voor Live-Imaging van GABAergic interneuronen migreren (Video) | JoVE Journal

Ex Utero Electroporation en Organotypic Slice culturen van muis embryonale hersenen voor Live-Imaging van GABAergic interneuronen migreren

Meer video's verkennen