Name: Driedimensionale Organotypic culturen van vestibulaire en auditieve zintuigen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Leer driedimensionale organotypische culturen van vestibulaire en auditieve zintuigen te maken met muizen. Deze methode behoudt weefselmorfologie en maakt mechanische stimulatie en gendelivery mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij bedanken Dr. A. Jacobo, Dr. J. Salvi, en A. Petelski voor hun bijdragen aan het oorspronkelijke onderzoek waarop dit protocol is gebaseerd. Wij danken ook J. Llamas en W. Makmura voor technische bijstand en de veehouderij. Wij erkennen NIDCD Training subsidie T32 DC009975, NIDCD verlenen R01DC015530, Robertson therapeutische Ontwikkelingsfonds en de Caruso Family Foundation voor financiering. Tot slot, wij erkennen steun van Howard Hughes Medical Institute, waarvan Dr. Hudspeth een onderzoeker is.

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik commissies van de Rockefeller universiteit en van de University of Southern California.
1. (optioneel) bereiding van collageen ik oplossing van Mouse-tail pezen
Opmerking: Collageen ik oplossingen commercieel beschikbaar zijn. Volg de instructies van de fabrikant voor de voorbereiding van het gel.
<ol><li>5-10 jonge volwassene (3-5 weken oud) muizen van een wild type stam met koolstofdioxide overeenkomstig het protocol goedgekeurd door de relevante institutionele Animal Care en gebruik Comité16euthanaseren. Verzamel de staarten en ontsmetten door dompelen in 70% ethanol voor een minimum van 4 uur bij kamertemperatuur. Opmerking: Incubatie gedurende meer dan 48 uur moet worden voorkomen, aangezien het leidt tot buitensporige weefsel uitdroging en het extractieproces van de pees belemmert.</li>
	<li>Verwijder de huid van elke staart door de invoering van een longitudinale knippen met een scalpel mes en intrekken van de hele huid met een tang. De gevilde staarten overbrengen in een petrischaal 100 mm gevuld met schone 70% ethanol en snij ze in 10-mm segmenten. Opmerking: Gooi het dunste deel van de staart, die moeilijk te manipuleren.</li>
	<li>Met behulp van Tang, beveiligen van elk segment van de staart naar de onderkant van de petrischaal en een tweede paar fijne pincet gebruiken om uit te pakken van de pezen van de staart een tegelijk. Individuele pees vezels moeten ontstaan met minimale weerstand. Opmerking: Oude, saaie #5 pincet werken goed voor deze stap.</li>
	<li>Bereiden van 100 mL van de oplossing van een 0,1% (volumeprocent) azijnzuur in steriele, moleculaire-grade water en voeg 10 mL van deze oplossing aan een steriele petrischaal van 100 mm. De pezen overbrengen in de petrischaal en laat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur te denatureren van de collageen ik.</li>
	<li>Gebruik een steriel scalpel of iridectomy schaar met botte, gebogen tips om gehakt van de pees in 1-2 mm fragmenten. De gehakt pezen overbrengen in een steriele buis van 50 mL en Voeg 0,1% azijnzuur om het volume op 50 mL. Opmerking: Gebruik vier of vijf tails voor elke 50 mL zuur om een collageen ik concentratie van 2.0-2,5 mg/mL.</li>
	<li>Koel de collageen ik oplossing bij 4 ° C gedurende ten minste 48 uur om complete eiwitten denatureren. Vortex met een tafelblad vortex ingesteld op de maximale snelheid voor 1 min twee keer per dag.</li>
	<li>Meten van de eiwitconcentratie van de oplossing met behulp van de zure test van bicinchoninic, aanpassen van de collageen ik concentratie tot 2.0-2,5 mg/mL door toevoeging van 0,1%-oplossing van azijnzuur en winkel bij 4 ° C. Opmerking: Collageen ik oplossing voor één tot twee jaar kan worden opgeslagen.</li>
	<li>(Optioneel) Centrifugeer het collageen ik oplossing bij 2.000 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C en gebruik de doorschijnende top fractie (ongeveer de helft van het volume), om te bereiken optisch duidelijk collageen gels in punt 4.</li>
</ol>2. dissectie van vestibulaire en auditieve organen
<ol><li>Zwangere muizen van elke stam met koolstofdioxide overeenkomstig het protocol goedgekeurd door de relevante institutionele Animal Care en gebruik Comité16euthanaseren. Pak en het onthoofden van de embryo's. Opmerking: Lfng-CreERT2/tdTomato muizen kunnen worden gebruikt voor permanente labeling cellen bij blootstelling aan 4-hydroxytamoxifen17te ondersteunen.</li>
	<li>Het steriliseren van alle werkende oppervlakken en dissectie instrumenten, met inbegrip van twee paren van #5 pincet en een haar mes18, door het reinigen met 70% ethanol.</li>
	<li>Splitsen elk hoofd in twee helften door de invoering van een longitudinale knippen met een steriel scalpel mes of met behulp van twee paren van #5 pincet. Pak de temporale botten, die de inner oren19 bevatten, en plaats ze in 15 mL ijskoud Henks evenwichtige zoutoplossing (HBSS) in een petrischaal 60 mm. Houd de schotel op het ijs. Opmerking: Embryo's op een aantal stadia van E13.5 tot E18.5 hebben met succes gebruikt.</li>
	<li>(Optioneel) De inner oren wassen door zachtjes schudden ze in een conische tube van 50 mL met 30 mL ijskoud HBSS en vervangen de HBSS drie of vier keer. Houd de buis op ijs. Opmerking: Deze stap beperkt van eventuele verontreiniging van de weefselkweek en snel brengt de temperatuur tot 4 ° C, waardoor de afbraak en cel dood weefsel.</li>
	<li>Met behulp van twee paar fijne #5 pincet, de oren van de innerlijke scheiden van de temporale-bot en breng de oren, drie of vier tegelijk, in een 60-mm petrischaal gevuld met ijskoude HBSS.</li>
	<li>Ontleden de vestibulaire zintuigen.<ol>
<li>Oriënteren de oren mediale kant omhoog en ga naar de utricle. Met twee paren van #5 verlostang, verwijderen van het kraakbeen rondom de vestibulaire organen. Zachtjes verbreken de nervus vestibularis, de verbinding tussen de utricle en saccule en de semicircular-grachten, zoals afgebeeld in Figuur 1. Trek voorzichtig aan de utricle en de bijgevoegde ampullen van de superieure en horizontale semicircular kanalen van het oor. Opmerking: Deze methode kan worden gebruikt op inner oren van stadia E16.5 - E18.5. Behoud van het kraakbeen fragmenten voor sectie 3 hieronder.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het ontleden van het slakkenhuis.<ol>
<li>Verwijder de kraakbeenachtige weefsel rondom het orgel van de hoorzitting met twee paren van #5 pincet. Zachtjes het verbreken van de verbinding tussen de cochleair base en de saccule zoals aangegeven in Figuur 1. Opmerking: Voor stadia E13.5 - E14.5, het kraakbeen vóór dissectie verzachten door de behandeling van de binnenste oren voor met 0,25% collagenase ik in-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Behoud van het kraakbeen fragmenten voor sectie 3 hieronder.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Met behulp van een 200-µL Pipetteer uitgerust met een brede nonstick tip, de utricles en cochleae overbrengen naar een 30-mm petrischaal gevuld met groeimedium, bestaande uit DMEM/F12 aangevuld met 33 mM Dglucose, natriumbicarbonaat 19 mM, 15 mM 4(2hydroxyethyl)- 1piperazineethanesulfonic zuur (HEPES), 1 mM glutamine, 1 mM nicotinamide, 20 mg/L epidermale groeifactor, 20 mg/L fibroblast groeifactor, 10 mg/L insuline, 5,5 mg/L transferrine en 5 µg/L Natriumseleniet.</li>
	<li>De voorbereidingen van de utricle voor maximaal 3 uur bij 37 ° C in een weefselkweek incubator vergast met 5% kooldioxide dat genezing van de bezuinigingen in het epithelium geïntroduceerd tijdens de dissectie handhaven. Slakkenhuis preparaten moeten worden overgedragen aan de collageen gel 10 min na de dissectie. Opmerking: Omdat de dissectie is uitgevoerd in ijskoude HBSS, is er geen behoefte om te warmen vooraf het groeimedium tot 37 ° C.</li>
</ol>3. (optioneel) aanpassen van collageen ik stijfheid door toe te voegen uiteenlopendeconcentratiesverkrijgbaar van chondrocyten Gel
Opmerking: De methode voor chondrocyten isolatie werd vanaf Gosset et al. gewijzigd 20
<ol><li>Bereid een 1%-oplossing van collagenase ik in steriele 1 x PBS en winkel 100-200 µL aliquots bij-80 ° C. Ontdooien op ijs wanneer nodig, het vermijden van meerdere bevriezen-ontdooien cycli.</li>
	<li>Gebruik fijne pincet te verzamelen de stukjes kraakbeen overgebleven uit de dissectie van de vestibulaire en auditieve organen van 10-12 oren. Aparte connective en binnenoor weefsels van het kraakbeen. Het kraakbeen overbrengen in een petrischaal 30 mm en voeg 300 µL van steriele groeimedium.</li>
	<li>Kunt een steriel scalpel blad of iridectomy schaar met stompe gebogen tips gehakt van het weefsel om kraakbeen stukken ongeveer 0,5 mm in lengte.</li>
	<li>Toevoegen van collagenase I tot en met het medium met kraakbeen aan het bereiken van een definitieve enzym concentratie van 0,25%. De schotel overbrengen in een incubator weefselkweek bij 37 ° C vergast met 5% kooldioxide. Pipetteer krachtig met een 1.000 µL Pipetteer elke 20 minuten totdat de stukjes kraakbeen distantiëren en zijn niet langer te onderscheiden in de oplossing vervolgens Incubeer gedurende een extra 20 min. Opmerking: In het geval van de utricle voorbereidingen, kan chondrocyten isolatie worden uitgevoerd tijdens stap 2.9; het duurt ongeveer 2 h (3-4 pipetting rondes).</li>
	<li>Verzamelen van de celsuspensie in een conische tube van 15 mL en regel het volume op 10 mL met steriele 1 x PBS. Centrifugeer bij 800 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 10 mL steriele 1 x PBS. Centrifugeer bij 800 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en verwijder de bovendrijvende substantie. Opmerking: Het is van cruciaal belang om te wassen de cellen tweemaal; eventuele resterende collagenase zal ik de collageen die ik gel verteren.</li>
	<li>Met behulp van een pipet 200-µL, 100 µL cultuurmedium aan de cel pellet en pipet zachtjes aan resuspendeer toevoegen. Met behulp van een hemocytometer cellen tellen en handhaven op ijs vóór gebruik.</li>
	<li>Om stijfheid van de gel, chondrocyten aan de geneutraliseerde collageen ik gel oplossing (afdeling 1) en meng snel toevoegen voor het distribueren van de cellen in de hele de gel vóór stollen. Opmerking: De elasticiteitsmodulus van de collageen ik gel (een maatregel van stijfheid), stijgt lineair met het aantal chondrocyten11toegevoegd. De relatie wordt beschreven door de experimenteel bepaalde lineaire functie E = 206· NC + 15, waarin E de elasticiteitsmodulus in luchtdruk en Nc is is het aantal chondrocyten in miljoenen. Voor een gedetailleerd protocol voor gel Raadpleeg stijfheid metingen het oorspronkelijke artikel11.</li>
</ol>4. plaats de vestibulaire en/of akoestisch zintuiglijke orgel in een collageen die ik Gel
<ol><li>In een steriele 1.5-mL-buis, bereiden collageen ik polymerisatie oplossing door het mengen van 160 µL van 10 x PBS met fenol rood pH-indicator, 133 µL van 0,34 M natriumhydroxide-oplossing, 70 µL van 0,9 M natriumbicarbonaat en 40 µL van 1 M HEPES. Houd de buis op ijs. Opmerking: Dit recept biedt de polymerisatie-oplossing die nodig zijn voor het bereiden van 2 mL van collageen ik gel, maar kunnen zo nodig worden aangepast.</li>
	<li>Mix 100 µL van de polymerisatie oplossing en 400 µL van collageen ik oplossing op ijs door pipetteren zachtjes op en neer in een gekoeld 1.5-mL-buis. Het vergroten van gel stijfheid, voeg 50 µL van met chondrocyten groeimedium en meng voorzichtig zoals beschreven in sectie 3.</li>
	<li>Breng 500 µL van de geneutraliseerde collageen ik oplossing een gekoeld 30-mm petrischaal met een 10 mm glas-onder invoegen of een putje van de plaat van een vier-well. Opmerking: Het is van cruciaal belang dat alle reagentia op ijs om te voorkomen dat snelle en ongelijke polymerisatie van het collageen ik.</li>
	<li>Snel overbrengen in de cochleae of utricles de geneutraliseerde collageen ik oplossing en aanpassen van de organen naar de gewenste positie met een steriele haar mes18 of paar fijne pincet. Opmerking: Collageen ik polymerisatie wordt merkbaar na 1-2 minuten, als de oplossing troebel wordt.</li>
	<li>Nadat de oplossing rond het weefsel heeft polymeervorm, plaats de petrischaal of vier-well plaat gedurende 20 minuten bij 37 ° C in een weefselkweek incubator vergast met 5% koolstofdioxide om ervoor te zorgen volledige polymerisatie.</li>
	<li>Voeg 3 mL groeimedium aangevuld met 0,5% foetale runderserum (FBS) per petrischaal of 500 µL van hetzelfde medium per putje van de plaat van een vier-well. Het behouden van de cultuur bij 37 ° C in een weefselkweek incubator vergast met 5% kooldioxide. Indien gewenst, vullen het groeimedium met 10 µM 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU) op het etiket van de delende cellen. Opmerking: Hogere FBS concentraties kunnen worden gebruikt indien gewenst.</li>
</ol>5. virale injecties in driedimensionale culturen van vestibulaire en auditieve zintuigen
<ol><li>Ontdooi de gewenste virus op ijs en meng met trypan blauwe oplossing in een conische buis van 0,5 mL tot een concentratie van de uiteindelijke kleurstof van 0,05%. 10-20 x kleurstof gebruiken om te voorkomen dat aanzienlijke verdunning van het virus. Houd op ijs. Opmerking: Adenovirus serotype 5 werken beste voor infecteren ondersteunende cellen in de utricle19, overwegende dat adeno-associated virus Anc80 beide haarcellen kan infecteren en ondersteuning van de cellen in de utricle en het slakkenhuis21.</li>
	<li>Breken de tip van een glas naald bereid op een micropipet trekker met schone fijne pincet met inachtneming van het bij het hoogste vergrotingsniveau van een verrekijker ontrafeling van Microscoop. Opmerking: Het is belangrijk voor het optimaliseren van de instellingen op de trekker van de naald. Naalden met 9 - 12 mm shanks en 20 - 30-µm openingen werken het beste.</li>
	<li>Verwijder een cultuur van sensorische-orgel uit de incubator. Bevestig de naald aan de microinjector en vul het met 2-3 µL van het mengsel van kleurstof en virus. Vooraf de naald in de sensorische organen met inachtneming van het onder de binoculair ontrafeling van Microscoop.</li>
	<li>Voorzichtig rijden de naald tip door mesenchymale en epitheliale lagen van het dak van een driedimensionale utricular cultuur. Injecteer het virale mengsel totdat de holten van de utricle en de ampullen met de blauwe kleurstof vullen. Opmerking: Omdat het biedt gemakkelijk toegang tot de zintuigen, is een 10 mm glas-onderkant petrischaal optimaal voor de injecties.</li>
	<li>Incubeer bij 37 ° C in een weefselkweek incubator vergast met 5% kooldioxide. Opmerking: Als groen of rood fluorescerende eiwit wordt gebruikt in de virale constructie, is de fluorescentie blijkt 24u na virale transductie.</li>
</ol>

<ol><li>Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair-cell+regeneration+in+organ+cultures+of+the+postnatal+chicken+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear.</a> Hear Res. 70 (1), 85-108 (1993).</li>
<li>Meyers, J. R., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+change+controls+supporting+cell+proliferation+in+lesioned+mammalian+balance+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Off+J+Soc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium.</a> J Neurosci Off J Soc Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).</li>
<li>Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+mouse+utricle+as+an+in+vitro+preparation+for+studies+of+ototoxic-drug-induced+sensory+hair+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death.</a> Brain Res. 1091 (1), 277-281 (2006).</li>
<li>Warchol, M. E., Lambert, P. R., Goldstein, B. J., Forge, A., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+proliferation+in+inner+ear+sensory+epithelia+from+adult+guinea+pigs+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regenerative proliferation in inner ear sensory epithelia from adult guinea pigs and humans.</a> Science. 259 (5101), 1619-1622 (1993).</li>
<li>Lin, V., Golub, J. S., Nguyen, T. B., Hume, C. R., Oesterle, E. C., Stone, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Notch+activity+promotes+nonmitotic+regeneration+of+hair+cells+in+the+adult+mouse+utricles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Off+J+Soc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Notch activity promotes nonmitotic regeneration of hair cells in the adult mouse utricles.</a> J Neurosci Off J Soc Neurosci. 31 (43), 15329-15339 (2011).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-regulation+of+the+Notch+and+Wnt+signaling+pathways+promotes+supporting+cell+proliferation+and+hair+cell+regeneration+in+mouse+utricles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Co-regulation of the Notch and Wnt signaling pathways promotes supporting cell proliferation and hair cell regeneration in mouse utricles.</a> Sci Rep. 6, 29418(2016).</li>
<li>Chai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+induces+proliferation+of+sensory+precursors+in+the+postnatal+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling induces proliferation of sensory precursors in the postnatal mouse cochlea.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8167-8172 (2012).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%2B+cells+regenerate+hair+cells+via+proliferation+and+direct+transdifferentiation+in+damaged+neonatal+mouse+utricle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lgr5+ cells regenerate hair cells via proliferation and direct transdifferentiation in damaged neonatal mouse utricle.</a> Nat Commun. 6, 6613(2015).</li>
<li>Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+growth+and+differentiation+of+mammalian+sensory+hair+cell+progenitors%3A+a+requirement+for+EGF+and+periotic+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme.</a> Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).</li>
<li>White, P. M., Stone, J. S., Groves, A. K., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+signaling+is+required+for+regenerative+proliferation+in+the+cochlea%3A+conservation+in+birds+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">EGFR signaling is required for regenerative proliferation in the cochlea: conservation in birds and mammals.</a> Dev Biol. 363 (1), 191-200 (2012).</li>
<li>Gnedeva, K., Jacobo, A., Salvi, J. D., Petelski, A. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+force+restricts+growth+of+the+murine+utricle%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Elastic force restricts growth of the murine utricle.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Aragona, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanical+checkpoint+controls+multicellular+growth+through+YAP%2FTAZ+regulation+by+actin-processing+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors.</a> Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).</li>
<li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+a+universal+size-control+mechanism+in+Drosophila+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Elucidation of a universal size-control mechanism in Drosophila and mammals.</a> Cell. 130 (6), 1120-1133 (2007).</li>
<li>Low, B. C., Pan, C. Q., Shivashankar, G. V., Bershadsky, A., Sudol, M., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ+as+mechanosensors+and+mechanotransducers+in+regulating+organ+size+and+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ as mechanosensors and mechanotransducers in regulating organ size and tumor growth.</a> FEBS Lett. 588 (16), 2663-2670 (2014).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+YAP+oncoprotein+by+the+Hippo+pathway+is+involved+in+cell+contact+inhibition+and+tissue+growth+control%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control.</a> Genes Dev. 21 (21), 2747-2761 (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22AVMA+Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals%3A+2013+Edition%22">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition</a>. , (2013).</li>
<li>Semerci, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lunatic+fringe-mediated+Notch+signaling+regulates+adult+hippocampal+neural+stem+cell+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Lunatic fringe-mediated Notch signaling regulates adult hippocampal neural stem cell maintenance.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Tuan, R. S., Lo, C. W. Developmental biology protocols. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/series/7651">Methods in molecular biology</a>. , Humana Press. Totowa, N.J. 137(2000).</li>
<li>Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+adult+mouse+utricle+and+adenovirus-mediated+supporting-cell+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp+JoVE%22%5BJournal%5D)">Dissection of adult mouse utricle and adenovirus-mediated supporting-cell infection.</a> J Vis Exp JoVE. (61), (2012).</li>
<li>Gosset, M., Berenbaum, F., Thirion, S., Jacques, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+phenotyping+of+murine+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Primary culture and phenotyping of murine chondrocytes.</a> Nat Protoc. 3 (8), 1253-1260 (2008).</li>
<li>Landegger, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+AAV+vector+enables+safe+and+efficient+gene+transfer+to+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear.</a> Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).</li>
<li>Burns, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reinforcement+of+cell+junctions+correlates+with+the+absence+of+hair+cell+regeneration+in+mammals+and+its+occurrence+in+birds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Reinforcement of cell junctions correlates with the absence of hair cell regeneration in mammals and its occurrence in birds.</a> J Comp Neurol. 511 (3), 396-414 (2008).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+polarized+extension+and+planar+cell+polarity+in+the+cochlea+by+the+vertebrate+PCP+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of polarized extension and planar cell polarity in the cochlea by the vertebrate PCP pathway.</a> Nat Genet. 37 (9), 980-985 (2005).</li>
<li>Chacon-Heszele, M. F., Ren, D., Reynolds, A. B., Chi, F., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cochlear+convergent+extension+by+the+vertebrate+planar+cell+polarity+pathway+is+dependent+on+p120-catenin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Camb+Engl%22%5BJournal%5D)">Regulation of cochlear convergent extension by the vertebrate planar cell polarity pathway is dependent on p120-catenin.</a> Dev Camb Engl. 139 (5), 968-978 (2012).</li>
<li>Yamamoto, N., Okano, T., Ma, X., Adelstein, R. S., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+regulates+extension%2C+growth+and+patterning+in+the+mammalian+cochlear+duct%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Camb+Engl%22%5BJournal%5D)">Myosin II regulates extension, growth and patterning in the mammalian cochlear duct.</a> Dev Camb Engl. 136 (12), 1977-1986 (2009).</li>
<li>Tada, M., Heisenberg, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+extension%3A+using+collective+cell+migration+and+cell+intercalation+to+shape+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Camb+Engl%22%5BJournal%5D)">Convergent extension: using collective cell migration and cell intercalation to shape embryos.</a> Dev Camb Engl. 139 (21), 3897-3904 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De moleculaire signalen die bemiddelen groei en differentiatie in het binnenoor tijdens de ontwikkeling geweest bestudeerde uitvoerig5,6,7,8,9,10. Echter aanwijzingen het utricular modelsysteem verkregen dat mechanische signalen, voelde door cel kruispunten en de activering van Hippo signalering, ook een belangrijke rol in de...

De studie van de meeste aspecten van zoogdieren orgel ontwikkeling is bevorderd door in vitro -systemen. Twee belangrijkste methoden worden nu gebruikt voor de cultuur van vestibulaire zintuigen: vrij zwevende1 en aanhangend2 preparaten. Beide methoden toestaan dat het onderzoek van Haarcel kwetsbaarheden3 en regeneratie1,4 in vitro. Bovendien hebben de ontwikkelingstoxiciteit rollen van de inkeping5,6, Wnt7,8en epidermale groeifactor receptor (EGFR)9,10 signalering cascades in het binnenoor vastgesteld, gedeeltelijk door het gebruik van in vitro culturen van sensorische epitheel. Echter celgroei en differentiatie worden beheerd, niet alleen door middel van de signalering door morphogens, maar ook door middel van fysieke en mechanische signalen zoals intercellulaire contacten, de stijfheid van de extracellulaire matrix, en mechanische uitrekken of vernauwing. De rol van dergelijke mechanische stimuli is uitdagend om te onderzoeken in de ontwikkelingslanden binnenoor in vivo. Bovendien, bestaande vrij zwevende en aanhangend cultuur methoden zijn niet geschikt voor dergelijk onderzoek in vitro. Hier beschrijven we een methode voor driedimensionale organotypic cultuur in collageen gels ik verschillende stijfheid. Deze methode grotendeels bewaart de in vivo -architectuur van de vestibulaire en cochleair zintuigen en laat onderzoek naar de gevolgen van mechanische kracht voor de groei en differentiatie11.
Omdat de mechanische prikkels zijn bekend om te activeren downstream moleculaire gebeurtenissen, zoals de Hippo signalering traject12,13,14,15, is het belangrijk om het combineren van mechanische stimulatie te kunnen met biochemische en genetische manipulaties. De hier beschreven methode van cultuur virus-gemedieerde gene levering toestaat en kan daarom gebruikt worden om te studeren zowel mechanische als moleculaire signalering tijdens binnenoor ontwikkeling11.

<table><tbody><tr><td>#10 Chirurgische messen</td><td>Miltex</td><td>4-110</td><td></td></tr><tr><td>#5 Pincetten</td><td>Dumont</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petri-schaal</td><td>Sigma</td><td>P5856-500EA</td><td></td></tr><tr><td>250 uL grote oriëntatiepijpjes</td><td>USA Scientific</td><td>1011-8406</td><td></td></tr><tr><td>30 mm glazen bodem Petri-schaal</td><td>Matsunami Glass USA Corporation</td><td>D35-14-1.5-U</td><td></td></tr><tr><td>4-well plate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>4-Hydroxytamoxifen&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td></td></tr><tr><td>60&nbsp;mm Petri-schaal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>123TS1</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>537020</td><td></td></tr><tr><td>Ad-GFP</td><td>Vector Biolabs</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP, kippenei IgY fractie</td><td>Invitrogen</td><td>A10262&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Myo7A</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sox2-antilichaam (Y-17)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-17320</td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninic zuur assay</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>Collageenase I</td><td>Gibco</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Epidermale groeifactor</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal runderserum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16140063</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastgroeifactor</td><td>Sigma</td><td>F5392</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer&nbsp;</td><td>Daigger</td><td>EF16034F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I3536</td><td></td></tr><tr><td>Iridectomie schaar&nbsp;</td><td>Zepf Medical Instruments</td><td>08-1201-10&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Narishige</td><td>IM-6</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X), pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1X), pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red pH-indicator&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P4633&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pure Ethanol, 200 Proof</td><td>Decon Labs&nbsp;</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>RFP-antilichaam</td><td>ChromoTek</td><td>&nbsp;5F8</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Natriumseleniet</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Tisch-vortex&nbsp;</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td></td></tr><tr><td>Transferrine</td><td>Sigma</td><td>T8158</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblauw&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T6146</td><td></td></tr></tbody></table>

driedimensionale organotypic culturen van vestibulaire en auditieve zintuigen

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

De zintuigen van het binnenoor zijn uitdagend om te studeren bij zoogdieren als gevolg van hun onbereikbaarheid experimentele manipulatie en optische observatie. Bovendien, hoewel bestaande cultuur technieken toestaan biochemische verstoringen, deze methoden bieden niet een middel tot het bestuderen van de effecten van mechanische kracht en weefsel stijfheid tijdens de ontwikkeling van de zintuigen van het binnenoor. Hier beschrijven we een methode voor driedimensionale organotypic cultuur van de intact lymfkliertest utricle en slakkenhuis overwint deze beperkingen. De techniek voor aanpassing van de stijfheid van een drie-dimensionale matrix hier beschreven staat manipulatie van de elastische kracht tegen weefsel groei. Deze methode kan daarom worden gebruikt om te studeren van de rol van mechanische krachten tijdens de ontwikkeling van het binnenoor. Bovendien, toestaan de culturen virus-gemedieerde gene levering, die kan worden gebruikt voor experimenten van de winst - en verlies-van-functie. Deze methode van cultuur behoudt aangeboren haarcellen en ondersteunende cellen en fungeert als een potentieel superieur alternatief voor de traditionele tweedimensionale cultuur van vestibulaire en auditieve zintuigen.

Vestibulaire en auditieve zintuigen uit embryonale oren, gekweekt in 40-Pa collageen ik gels nabootsen van lage stijfheid embryonale voorwaarden11, relatief normale driedimensionale structuren (Figuur 1) behouden en onderhouden van haarcellen en ondersteunende cellen (Figuur 2 en Figuur 3). Hoewel de ondersteuning van de celdichtheid daalt met meer dan 30% (Student t -</em...

Driedimensionale organotypic culturen van de lymfkliertest utricle en het slakkenhuis in optisch duidelijk collageen ik gels behouden aangeboren weefsel morfologie, toestaan voor mechanische stimulatie via aanpassing van matrix stijfheid en virus-gemedieerde gene levering toestaan.

Driedimensionale Organotypic culturen van vestibulaire en auditieve zintuigen

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

Het algemene doel van deze procedure is om driedimensionale organotypische culturen van de muis-vesticulaire en auditieve sensorische organen tot stand te brengen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van de belangrijkste vragen in het onderzoeksgebied van het binnenoor, zoals wat de rollen zijn van mechanische kracht en weefselstijfheid tijdens de ontwikkeling van de sensorische organen van het binnenoor. Het grote voordeel van deze techniek is dat deze de ingeboren architectuur van de vestibulaire cochlea grotendeels behoudt en ons in staat stelt om zowel moleculaire als mechanische signalering tijdens de ontwikkeling van het binnenoor te bestuderen.Dr. Hudspeth en ik kregen het idee voor deze methode toen we ons realiseerden dat driedimensionale culturen morfologische omstandigheden kunnen bieden om de groei van het vestibulaire orgaan in vitro te bestuderen. Gebruik eerst 70% ethanol om het werkgebied en alle benodigde dissectie-instrumenten, inclusief nummer vijf pincetten en een haarmes, te reinigen en te desinfecteren. Gebruik vervolgens een steriele scalpel om een longitudinale snede te maken, splits de kop van de muis in twee helften en verwijder de temporale botte

three-dimensional-organotypic-cultures-vestibular-auditory-sensory

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Deze procedure beschrijft een methode voor de isolatie en de cultuur van het muriene orgaan van Corti, met of zonder de spiraal limbus en spiraal ganglion neuronen. We tonen ook aan een methode voor de expressie van een exogeen reportergen in het orgaan van Corti explant door elektroporatie.

Primaire Cultuur en Plasmide Elektroporatie van de muizen orgaan van Corti.

Een eenvoudige procedure van vibratome snijden het orgaan van Corti, gevolgd door immunohistochemie en confocale microscopie is beschreven. Deze procedure zorgt voor een betere conservering van de fijne cytoarchitecture van de zoogdieren orgaan van Corti, en dus zorgt voor accurate kwantificering van celtypen.

Vibratome Sectioning voor Enhanced Behoud van de Cytoarchitecture van de zoogdieren orgaan van Corti

This video demonstrates the process for isolating spiral ganglion explants from the inner ear and co-culturing them with the organ of Corti on a multielectrode array. Spiral ganglia are carefully extracted and sectioned into smaller tissue sections or explants. These explants are cultured on the multielectrode array's active area to promote neuronal process outgrowth.

Culturing Murine Spiral Ganglion Neuron Explants on Multielectrode Arrays

Analyse van vestibulaire haar celfunctie wordt bemoeilijkt door hun locatie diep in het moeilijkste deel van de schedel, de petrous temporale bot. Meest functionele haarcellen studies hebben acuut gebruikt geïsoleerde haarcellen. Hier beschrijven we een semi-intacte bereiding van muis vestibulaire epitheel voor elektrofysiologische en twee-foton microscopie studies.

Een GeÃ ¯ soleerde semi-intacte Voorbereiding van de muis Vestibulaire Sensory epitheel voor elektrofysiologie en hoge-resolutie twee-foton microscopie

We presenteren een protocol om primaire murine spiraalvormige ganglion neuron explantaten te kweken op multi-elektrode arrays om neuronale responsprofielen te bestuderen en stimulatieparameters te optimaliseren. Dergelijke studies zijn gericht op het verbeteren van de neuron-elektrode interface van cochleaire implantaten om het gehoor bij patiënten te verbeteren evenals het energieverbruik van het apparaat.

Spiraal Ganglion Neuron Explantatie Cultuur en elektrofysiologie op Multi Electrode Arrays

In deze studie presenteren we een real-time beeldvormingsmethode met confocale microscopie om cellen te observeren die naar beschadigd weefsel bewegen door ex vivo incubatie met het cochleaire epitheel dat het orgaan van Corti bevat.

In vitro time-lapse live-cell imaging om celmigratie naar het orgaan van Corti te verkennen

Het kuiken is een kosteneffectief, toegankelijk en algemeen beschikbaar modelorganisme voor verschillende onderzoeken. Hier wordt een reeks protocollen beschreven om de moleculaire mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en regeneratie van het aviaire binnenoor.

In Ovo en Ex Ovo methoden om aviaire binnenoorontwikkeling te bestuderen

Hier worden methoden gepresenteerd die gedetailleerde instructies geven voor het ontleden, dissociëren, kweken en patch-clamp-opname van vestibulaire ganglion- en spiraalvormige ganglionneuronen van het binnenoor.

Isoleren en kweken van vestibulaire en spiraalvormige ganglion somata van neonatale knaagdieren voor patch-clamp opnames

Het huidige protocol is een update van eerdere protocollen en bevat relatief eenvoudige benaderingen voor het kweken van hoogwaardige cochleaire explantaten. Dit zorgt voor betrouwbare data-acquisitie en beeldvorming met hoge resolutie in levende en vaste cellen. Dit protocol ondersteunt de voortdurende trend om binnenoorcellen te bestuderen.

Volledige neonatale cochleaire explantaten als een in vitro model

Hierin presenteren we een gedetailleerd protocol voor het isoleren en kweken van primaire cochleaire haarcellen van muizen. Aanvankelijk werd het orgaan van Corti onder een microscoop ontleed uit neonatale (3-5 dagen oud) muizenslakkenhuis. Vervolgens werden cellen enzymatisch verteerd tot een eencellige suspensie en geïdentificeerd met behulp van immunofluorescentie na enkele dagen in kweek.

Isolatie en kweek van primaire cochleaire haarcellen van neonatale muizen

Hier beschrijven we een techniek voor het oogsten van menselijke vestibulaire eindorganen onder fysiologische omstandigheden tijdens labyrinthectomie en hun analyse met behulp van immunokleuring.

Oogst van vestibulaire eindorganen onder fysiologische omstandigheden tijdens labyrinthectomie

Leer driedimensionale organotypische culturen van vestibulaire en auditieve zintuigen te maken met muizen. Deze methode behoudt weefselmorfologie en maakt mechanische stimulatie en gendelivery mogelijk.

Driedimensionale Organotypic culturen van vestibulaire en auditieve zintuigen

Meer video's verkennen