Evaluatie van de opname van de Exon geïnduceerd door Splice switch Antisense Oligonucleotides in SMA patiënt fibroblasten
11 mei 2018
Verschillende antisense oligonucleotides (AONs) hebben aangetoond dat induceren exon integratie (splice modulatie) en SMN expressie voor spinale musculaire atrofie (SMA) te redden. Hier beschrijven we een protocol voor AON lipotransfection ertoe exon opneming in het SMN2 -gen en de evaluatiemethoden te bepalen van de werkzaamheid bij SMA patiënt fibroblasten.
Het algemene doel van dit lipotransfectieprotocol is om antisense-oligonucleotiden in de cellen te introduceren en de werkzaamheid van deze geneesmiddelen op exon-inclusie in SMA-cellen te evalueren. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van antisensetherapie te beantwoorden. Bijvoorbeeld de werkzaamheid van nieuwe antisense oligo's om behandeling voor patiënten te bieden.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het snel, eenvoudig en gevoelig genoeg is voor het testen van verschillende antisense-oligonucleotiden-chemieën. Hoewel deze methode kan worden gebruikt voor de transfectie van antisense oligo's in fibroblasten, kan deze ook worden toegepast op andere celtypen, zoals primaire myoblasten en verschillende andere cellijnen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Aleks, een technicus uit mijn laboratorium.
Ontdooi eerst een 10 micromolar oplossing van LNA/DNA mixmer op ijs. Verdun de mixmer-oplossing in serum-vrij medium tot de vereiste concentratie in een buisje van 1,5 milliliter. Verdun vervolgens het transfectiemiddel en voeg het verdunde transfectiemiddel toe aan de mixmer in een verhouding van één op één.
Het is cruciaal dat de celconfluëntie rond de 65 tot 80% is tijdens het uitvoeren van de transfectie. Als de confluëntie boven de 80% ligt, zal de transfectie-efficiëntie worden verminderd. Bewaar vervolgens het transfectiemiddelmengsel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
Na 10 minuten, pipet 900 microliters serum-vrij medium met 5% foetaal bovien serum in de buis. Voeg de FBS niet toe vóór de incubatie met het transfectiemiddel en de LNA/DNA mixmers, omdat dit ook de transfectie-efficiëntie beïnvloedt. Aspeer vervolgens het oude medium uit de kweekplaat.
Voeg nu één milliliter van het medium dat de LNA/DNA mixmer bevat toe aan de kweekplaat. Laat de plaat vervolgens 24 tot 48 uur in de incubator bij 37 graden Celsius. Na incubatie, aspeer het medium uit de kweekplaat.
Pipet vervolgens één milliliter GPC-reagens naar de cellen. Was vervolgens de putjes meerdere keren met het GPC-reagens. Na meerdere wasbeurten, verzamel de cellen in een buisje van 1,5 milliliter en bewaar de monsters op ijs.
Vortex vervolgens de buis met hoge snelheid gedurende 30 seconden. Bewaar vervolgens de buis gedurende een uur op min 80 graden Celsius. Ontdooi vervolgens het monster op kamertemperatuur en vortex het snel.
Voeg vervolgens 200 microliter chloroform toe aan het monster en schud het krachtig gedurende 15 seconden. Bewaar vervolgens de buis gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Na drie minuten, centrifugeer het monster gedurende 15 minuten bij 12.000 g bij vier graden Celsius.
Zodra de centrifugatie voorbij is, verzamel de waterige fase vanaf de bovenkant van het centrifugeerbuisje. Draag vervolgens de waterige fase over naar een nieuwe buis. Voeg vervolgens 500 microliter isopropanol en één microliter van acht microgram per microliter RNA-kwaliteit glycogeen toe aan de waterige fase.
Vortex het monster snel gedurende 10 seconden en incubeer het bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Na de incubatie, centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 12.000 g bij vier graden Celsius. Decanteer het supernatant na de run.
Voeg één milliliter koud 75%-ethanol toe en vortex kort om het verkregen pellet te wassen. Centrifugeer het monster opnieuw gedurende vijf minuten bij 7500 g bij vier graden Celsius. Verwijder vervolgens al het ethanol en droog het pellet bij kamertemperatuur.
Nadat het pellet is opgedroogd, lost het op in 30 microliter DNAse/RNAse-vrij water. Bewaar vervolgens het monster gedurende 10 minuten bij 60 graden Celsius. Lees vervolgens de concentratie van het RNA bij 260 nanometer in de spectrofotometer en pas deze aan op 15 nanogram per microliter.
Om de RT-PCR master mix samen te stellen, voegt u de twee X RT-PCR reactiebuffer, een stap RT-PCR enzymmix, voorwaartse en achterwaartse primers en RNAse/DNAse-vrij gedistilleerd water toe. Verdeel de master mix in PCR-buisjes van 0,2 millimeter en voeg het totale RNA toe voor elk respectief monster. Start vervolgens de PCR-reactie.
Nadat de RT-PCR voltooid is, voegt u vijf microliters van zes X ladingsdye toe aan het geamplificeerde product. Laad vervolgens vijf microliters van het mengsel op een 2%-agarosegel. Start de elektroforese-eenheid bij 100 volt gedurende 40 minuten.
Eerst wordt de efficiëntie van verschillende mixmers bestudeerd. Om dit te doen, wordt de inclusie van het SMN2-exon 7 en GAPDH-niveaus in SMA-fibroblasten getransfecteerd met de mixmers geanalyseerd. Het gelbeeld toont de inclusie van exon 7 waarbij de bovenste en de onderste banden de exon 7 inclusie en exclusie SMN2 RNA vertegenwoordigen.
De inclusie-efficiëntie wordt ook gekwantificeerd tot 78 tot 98% wanneer getransfecteerd met de mixmers een tot vijf. Aan de andere kant worden er geen significante resultaten verkregen wanneer mixmer zes tot acht wordt gebruikt om de patiënt SMA-fibroblasten te transfecteren in vergelijking met de controle. In het experiment wordt GAPDH gebruikt als controle.
Vervolgens wordt kwantitatieve PCR uitgevoerd om de relatieve expressie van de volledige lengte SMN2 te analyseren in vergelijking met GAPDH. Er wordt een scherpe toename in de hoeveelheid van het SMN2-transcriptniveau waargenomen wanneer getransfecteerd met mixmers een tot drie en nummer vijf, in vergelijking met de controle. Ook de SMN-eiwitexpressieniveau wordt bestudeerd, wat een toename in de SMN-eiwitexpressieniveau in de patiënt-fibroblast getransfecteerd met mixmers een tot vijf toont.
Er wordt een scherpe 1,5 tot 1,9-voudige toename in het SMN-eiwitniveau waargenomen. Hierbij is cofilin de gebruikte controle. Daarentegen, mixmer zes tot acht veranderen het SMN-eiwitexpressieniveau niet.
Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een lipotransfectieprotocol voor het introduceren van antisense-oligonucleotiden (AON's) in cellen om exon-inclusie in het SMN2-gen te induceren, met als doel de behandeling van spinale musculaire atrofie (SMA). De effectiviteit van deze methode wordt geëvalueerd in fibroblasten van SMA-patiënten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Genetica
- Celbiologie
Achtergrond
- Spinale musculaire atrofie (SMA) is een genetische aandoening die de motorneuronen aantast.
- Antisense-oligonucleotiden kunnen splicing moduleren en de expressie van SMN herstellen.
- Effectieve afleveringsmethoden voor AON's zijn cruciaal voor therapeutische toepassingen.
- Dit protocol maakt het mogelijk om verschillende AON-chemieën te testen.
Doel van de studie
- Om AON's effectief in SMA-cellen te introduceren.
- Om de effectiviteit van AON's bij het induceren van exon-inclusie te evalueren.
- Om een snelle en gevoelige methode te bieden voor het testen van AON's.
Gebruikte methoden
- Lipotransfectie van antisense-oligonucleotiden in fibroblasten.
- Evaluatie van exon-inclusie in het SMN2-gen.
- Toepassing van de methode op verschillende celtypen, inclusief primaire myoblasten.
- Demonstratie van de procedure door een laboratoriumtechnicus.
Belangrijkste resultaten
- De lipotransfectiemethode is effectief voor de aflevering van AON.
- Exon-inclusie in het SMN2-gen werd succesvol geïnduceerd.
- Het protocol is aanpasbaar voor verschillende celtypen.
- De resultaten ondersteunen het potentieel van AON's als behandeling voor SMA.
Conclusies
- Dit lipotransfectieprotocol is een waardevol instrument voor onderzoek naar antisense-therapie.
- Het maakt snelle toetsing van de effectiviteit van AON in SMA-cellen mogelijk.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methode om nieuwe AONs te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
Dit protocol maakt een snelle, gevoelige evaluatie mogelijk van de effectiviteit van antisense-oligonucleotiden (AON) bij het induceren van SMN2-exon-inclusie in fibroblasten afgeleid van patiënten, ter ondersteuning van vroege targetvalidatie en lead-identificatie voor splicing-modulerende therapieën. Door de exon-inclusie en eiwitherstelling te kwantificeren bij lage AON-concentraties, biedt het voorspellend vertrouwen bij het prioriteren van kandidaten met een verbeterde potentie en gereduceerde toxiciteitsprofielen. De aanpasbaarheid van de methode voor verschillende celtypen en chemieën vergemakkelijkt preclinical de-risking en translationele continuïteit in drug development-pipelines voor SMA.
Strategische toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt toetsing van therapeutische hypothesen mogelijk door de inclusie-efficiëntie van SMN2 exon 7 te meten als functionele aflezing van de target-binding.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van RT-PCR en qPCR om exon-inclusie en transcriptniveaus te kwantificeren, wat reproduceerbare, kwantitatieve resultaten oplevert voor target-validatie.
- Voorspellende waarde: Toont dosisafhankelijke herstel van het SMN-eiwit aan via Western blot, wat bijdraagt aan mechanische risicoreductie en portfolio-triage van AON-kandidaten.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Vestigt een op lipotransfectie gebaseerde workflow die compatibel is met high-throughput testing van diverse AON-chemieën, waaronder LNA/DNA-mixmers.
- Reproduceerbaarheid: Standaardiseert transfectiecondities (65–80% confluentie, reagentverhoudingen) en normalisatie naar GAPDH- en cofiline-controles, wat consistentie tussen experimenten waarborgt.
- Schaalbaarheid: Compatibel met primaire myoblasten en andere cellijnen, waardoor het platform opnieuw kan worden gebruikt in verschillende ziekterelevante modellen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor de ziekte: Maakt gebruik van fibroblasten van SMA-patiënten om genetische en fenotypische getrouwheid te behouden, wat de translationele validiteit van de AON-screeningsgegevens verhoogt.
- Preklinische continuïteit: Koppelt exon-inclusie aan de expressie van het SMN-eiwit, waardoor een mechanische brug wordt geslagen van moleculaire targetmodulatie naar functioneel fenotypisch herstel.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Maakt go/no-go-beslissingen mogelijk op basis van de efficiëntie van de exon-inclusie (78–98%) en de protein fold-change (1,5–1,9), waardoor het biologische risico in een laat stadium wordt verminderd.
Integratie van pijplijn & workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingcontinuüm, van targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische evaluatie, waardoor iteratieve beoordeling van de AON-efficiëntie mogelijk is voorafgaand aan in vivo-studies.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van splice-switching-mechanismen door exon-inclusie te kwantificeren en off-target effecten uit te sluiten via GAPDH-normalisatie.
- Screening: Biedt assay-gereedheid en kwantitatieve output (exon-inclusie %, transcript fold-change) voor betrouwbare evaluatie van verbindingen over verschillende AON-chemieën.
- Analytics: Genereert meetbare resultaten (RT-PCR band-kwantificering, qPCR relatieve expressie, Western blot eiwitniveaus) die vergelijkende analyse van condities mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt moleculaire effectiviteit met eiwitherstel in patiëntafgeleide cellen, wat bijdraagt aan biomarker-afstemming en preklinische continuïteit.
- Enterprise Reuse: Vestigt een gestandaardiseerd lipotransfectieprotocol dat toepasbaar is op meerdere AON-typen en celsystemen, waardoor redundante methodeontwikkeling wordt verminderd.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellende zekerheid bij target-validatie door directe meting van exon-inclusie en herstel van het SMN-eiwit.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie, reproduceerbaarheid en sensitiviteit bij het testen van diverse AON-chemieën bij lage concentraties.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door de efficiëntie van exon-inclusie te koppelen aan eiwitexpressie, waardoor het risico op falen in een laat stadium wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van AON-kandidaten mogelijk op basis van kwantitatieve efficiëntiedrempels.
Overwegingen bij implementatie
- Vereist expertise in de omgang met nucleïnezuren, optimalisatie van transfectie en RNA/proteïne-analyse.
- Afhankelijk van de compatibiliteit van het transfectiereagens, een spectrofotometer voor RNA-kwantificering en instrumentatie voor gelelektroforese/qPCR/Western blot.
- Standaardisatie van transfectiecondities (confluentie, reagensverhoudingen) en normalisatie van controles (GAPDH, cofiline) over teams heen is noodzakelijk voor reproduceerbare resultaten.
- Aanpassing aan primaire myoblasten of andere cellijnen kan optimalisatie van de transfectie-efficiëntie en beoordeling van de cytotoxiciteit vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten variabiliteit in het passagenummer van patiëntfibroblasten en de noodzaak om de RNA-integriteit tijdens de extractie te behouden.
