Name: Homogene Time-resolved Förster Resonance energie overdracht gebaseerde Assay voor detectie van insuline secretie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Leer HTRF voor snelle detectie van insulinesecretie uit pancreas-bètacellen. Deze methode kwantificeert glucose-gestimuleerde secretie nauwkeurig en ondersteunt diabetesonderzoek en geneesmiddelontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs hebben niets te onthullen.

1. INS-1E cellen: onderhoud en beplating
<ol><li>Handhaven INS-1E cellen in een bevochtigde 37 ˚C/5% CO2 incubator en gekweekte met RPMI 1640 medium aangevuld met 5% (v/v) warmte-geïnactiveerd foetale runderserum, 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, 1 mM natrium pyruvaat, 100 U/mL penicilline/streptomycine oplossing, 50 µM β-mercaptoethanol. Cultuur cellen in de volledige RPMI 1640 10 mL medium (per plaat), totdat ze bij 80-90% samenvloeiing, wanneer ze kunnen worden trypsinized en gepasseerd of voor de insuline secretie assay gebruikt.</li>
	<li>
Dag 1: Gecombineerd media en wassen van cellen een keer met 5 mL voorverwarmde PBS. Voeg 0,5 mL trypsine (0,025%) verdund 1:1 in 0,5 mL PBS trypsinize van de cellen en incubeer gedurende 3-4 minuten bij 37 ˚C. Trypsine door toevoeging van de volledige media 9 mL en overdracht cellen aan een tube van 15 mL centrifuge door pipetteren deactiveren</li>
	<li>Pellet cellen door centrifugeren en resuspendeer de pellet cel in ongeveer 5 mL verse media.</li>
	<li>Neem 10 µL van het opnieuw gesuspendeerde cellen en meng met 10 µL van de vitale kleurstof Trypan blauw te controleren voor de levensvatbaarheid van de cellen. Levende en dode cellen in 10 µL van dit mengsel met behulp van een hemocytometer tellen. Levensvatbaarheid niveau moet boven de 90%. Verdun het opnieuw gesuspendeerde cellen in verse media naar 1 miljoen cellen per mL.</li>
	<li>Vooraf gecoat zaad 0,5 mL INS-1E cellen per putje in een poly-L-Lysine 24-well plaat, bij een dichtheid van 500.000 cellen per putje.</li>
	<li>
Dag 2: Verwijder media 18-24 uur na plating en 500 µL per putje van verse RPMI 1640 media toevoegen. Incubeer de cellen gedurende een andere 24 uur om de cellen volledig herstellen uit de voorafgaande passaging stap toestaan. Deze extra tijd het toelaat de cellen te verspreiden op de plaat weefselkweek.</li>
</ol>2. de insuline secretie Assay (dag 3)
<ol><li>Bereiden KRB buffer: 132.2 mM NaCl, KCl, 5 mM NaHCO3, 0.5 mM NaH2PO4, 0.5 mM MgCl2, 1.5 mM CaCl2en 0,001 g/mL bovien serumalbumine (BSA), pH van de 3.6 mM 7.4.</li>
	<li>Media uit cellen gecombineerd en spoel tweemaal met voorverwarmde PBS.</li>
	<li>Toevoegen voor de glucose honger stap, 450 µL per putje KRB (met BSA) zonder glucose gedurende 1 uur bij 37 ˚C/5% CO2.</li>
	<li>Tijdens de glucose honger stap, maak seriële verdunningen van de drugs in KRB 200 mM met Glucose (10 x concentratie).<ol>
<li>Drug voor te bereiden op 10 x de uiteindelijke concentratie in KRB aangevuld met 200 mM glucose (ook 10 x de laatste assay glucose concentratie). Als de voorraad van de drug (plus de toegevoegde 10 x glucose) is in DMSO, zorg ervoor dat DMSO percentage is consequent door de bepaling (idealiter definitieve percentage van minder dan 0,1% DMSO) beperkt.</li>
		<li>Voor dopamine en quinpirole behandelingen, gebruik een laatste assay drug concentratiebereik van 100 µM tot 100 uur (van hoogste naar laagste concentratie), met het laatste punt van de dosis-respons met geen drug. Voor bromocriptine, door een definitieve assay concentratiebereik van 10 µM tot 22.00, te gebruiken met het laatste punt van de dosis-respons de drugsvrije controle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Toevoegen seriële verdunningen van de drug aan de bepaling voor de productie van een dosis-respons na glucose honger.</li>
	<li>Breng 50 µL per putje van elke seriële verdunning in de overeenkomstige putjes (totale assay volume 500 µL).</li>
	<li>Voor de glucose stimulatie stap, Incubeer de cellen met de seriële verdunningen van de respectieve drug (in aanwezigheid van 20 mM glucose) gedurende 90 minuten bij 37 ˚C/5% CO2. Geleverd met een set van controleputjes: (1) stimulatie met 20 mM glucose alleen in de afwezigheid van eventuele aanvullende drug en (2) cellen die noch worden gestimuleerd met drug noch glucose (waarmee een basale tarief van secretie).</li>
	<li>Na de stimulatie stap, verwijder voorzichtig het supernatant (gebruik direct of bewaren bij 4 ˚C). Opmerking: Een extra 5 min zachte centrifugeren stap (600 x g, 1 min) kan worden ingevoerd op dit punt als u wilt verwijderen van alle resterende cellen in het supernatant assay.</li>
</ol>3. HTRF aan maatregel insuline secretie
<ol><li>Verdun assay supernatant 1:10 in KRB (zonder BSA), bij voorkeur in duidelijke 96-wells-platen.</li>
	<li>De standaard curve van insuline voor te bereiden voor de HTRF insuline assay (tabel 1).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Standaard stockoplossing, 500 ng/ml</td>
			<td>Seriële verdunningen</td>
			<td>Werken [insuline] ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 7</td>
			<td>30 µl voorraad + 140 µl KRB</td>
			<td>150</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 6</td>
			<td>30 µl STD 7 + 45 µl KRB</td>
			<td>60</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 5</td>
			<td>30 µl STD 6 + 45 µl KRB</td>
			<td>24</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 4</td>
			<td>30 µl STD 5 + 45 µl KRB</td>
			<td>9.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 3</td>
			<td>30 µl STD 4 + 45 µl KRB</td>
			<td>3.84</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 2</td>
			<td>30 µl STD 3 + 45 µl KRB</td>
			<td>1.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 1</td>
			<td>30 µl STD 2 + 45 µl KRB</td>
			<td>0.61</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 0</td>
			<td>45 µl KRB</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Opmerking: STD voorraad is 500 ng/ml</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Seriële verdunningen te maken van de standaard curve van insuline.
<ol start="3"><li>De standaard curve monsters en het verdunde assay supernatant toevoegen aan de HTRF plaat. De meting van secreted insuline door HTRF kan worden uitgevoerd in een 96-Wells of een 384-well plaat-indeling, in het achterhoofd dat het volume van de test moet opnieuw worden aangepast. Gebruik 10 µL per putje monster in 96-Wells witte helft-gebied platen of 5 µL per putje in een 384-well witte laag-volume, ronde bodem plaat (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Bereiden van antilichaam mix in detectie buffer (Zie Tabel van materialen) in een 1:2 donor (cryptate) / acceptor (XL-665) verhouding. Opmerking: Verdere bijzonderheden over de bepaling van de HTRF zijn verkrijgbaar bij de fabrikant.</li>
	<li>Antilichaam mix toevoegen aan de bepaling op 30 µL per putje (voor een 96 well-plate assay-indeling) of 15 µL per putje (voor een 384-well plaat assay formaat).</li>
	<li>Afdichting van de plaat en laat bij kamertemperatuur inwerken.</li>
	<li>Lees plaat na 2U, 4 h, en/of overnachting incubatie met antilichamen met behulp van de afleesapparaat en de juiste HTRF optische module (337 665 620 nm) (Zie Tabel van materialen en aanwijzingen van de fabrikant). De integratie start vastgesteldop 60 µs en de tijd van de integratie op 400 µs. gebruik 200 flitsen per putje. Opmerking: Deze parameters waren gebaseerd op het gebruik van onze bijzondere lezer. De uitlezing op 620 nm en 665 nm kan variëren tussen verschillende instrumenten. Dit is een van de redenen raden we u aan de 665/620-verhouding. Bij de berekening van deze ratio, elke potentiaalverschillen van lezer aan lezer zal worden genormaliseerd en consistente waarden ongeacht het instrument gebruikt voor het meten van HTRF leveren.</li>
</ol>4. data-analyse en normalisatie
<ol><li>Berekenen van de concentraties van insuline van de assay putten via extrapolatie van ratiometric fluorescentie lezingen (665 nm/620 nm) naar een tweede bestelling kwadratische polynomiale curve (Figuur 2).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57531/57531fig2.jpg"> Figuur 2 : Insuline standaard curve. Menselijke insuline voorraad van bekende concentraties werd gebruikt voor het genereren van de standaard curve van insuline. De resulterende HTRF ratio's (665 nm / 620 nm) werden uitgezet tegen de concentraties van insuline. De gegevens was beste pasvorm voor een tweede bestelling kwadratische polynomiale curve (R2 = 0.99996). Dit is een representatieve standaard curve. Foutbalken = SEM. <a href="/files/ftp_upload/57531/57531fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<ol start="2"><li>Met de geëxtrapoleerde gegevens als ng/mL van insuline afgescheiden, normaliseren (insuline afgescheiden in reactie op de toenemende ligand concentraties) aan de gemiddelde waarde van de % maximale insuline secretie assay putten (20 mM glucose alleen voorwaarde).</li>
	<li>De pasvorm van de kromme (R2) van een één experiment gebruiken voor de berekening van de variatie van de intraplate. Binnen het experiment, door de afzonderlijke R2 waarden te afgeleid door de intra experimentele duplicaten, waardoor berekening de standaardfout van het gemiddelde voor de curve past.</li>
	<li>Voor het bepalen van de interplate variatie, door de gegevens uit ten minste drie afzonderlijke experimenten te gebruiken voor het berekenen van de standaardfout van het gemiddelde voor de R2 waarde van de collectieve curve.</li>
</ol>

<ol><li>Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+nodes+in+signalling+pathways%3A+Insights+into+insulin+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (2), 85-96 (2006).</li>
<li>Vetere, A., Choudhary, A., Burns, S. M., Wagner, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+pancreatic+beta-cell+to+treat+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Targeting the pancreatic beta-cell to treat diabetes.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (4), 278-289 (2014).</li>
<li>Despres, J. P., Lemieux, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abdominal+obesity+and+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Abdominal obesity and metabolic syndrome.</a> Nature. 444 (7121), 881-887 (2006).</li>
<li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).</li>
<li>Barg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+exocytosis+in+insulin-secreting+B-cells+and+glucagon-secreting+A-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of exocytosis in insulin-secreting B-cells and glucagon-secreting A-cells.</a> Pharmacol Toxicol. 92 (1), 3-13 (2003).</li>
<li>Braun, M., Ramracheya, R., Rorsman, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22928575">Autocrine regulation of insulin secretion.</a> Diabetes Obes Metab. 14 Suppl 3, 143-151 (2012).</li>
<li>Farino, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+rapid+insulin+assay+by+homogenous+time-resolved+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of a rapid insulin assay by homogenous time-resolved fluorescence.</a> PLoS One. 11 (2), e0148684(2016).</li>
<li>Simpson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine-mediated+autocrine+inhibitory+circuit+regulating+human+insulin+secretion+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Dopamine-mediated autocrine inhibitory circuit regulating human insulin secretion in vitro.</a> Mol Endocrinol. 26 (10), 1757-1772 (2012).</li>
<li>Heyduk, E., Moxley, M. M., Salvatori, A., Corbett, J. A., Heyduk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+insulin+and+C-Peptide+sensors+for+rapid+assessment+of+insulin+and+C-peptide+secretion+by+the+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Homogeneous insulin and C-Peptide sensors for rapid assessment of insulin and C-peptide secretion by the islets.</a> Diabetes. 59 (10), 2360-2365 (2010).</li>
<li>Heyduk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+protein+conformational+changes+by+FRET%2FLRET%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Measuring protein conformational changes by FRET/LRET.</a> Curr Opin Biotechnol. 13 (4), 292-296 (2002).</li>
<li>Degorce, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTRF%28%28R%29%29%3A+Pioneering+technology+for+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">HTRF((R)): Pioneering technology for high-throughput screening.</a> Expert Opin Drug Discov. 1 (7), 753-764 (2006).</li>
<li>Degorce, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTRF%3A+A+technology+tailored+for+drug+discovery+-+a+review+of+theoretical+aspects+and+recent+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Chem+Genomics%22%5BJournal%5D)">HTRF: A technology tailored for drug discovery - a review of theoretical aspects and recent applications.</a> Curr Chem Genomics. 3, 22-32 (2009).</li>
<li>Mathis, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10838427">HTRF(R) Technology.</a> J Biomol Screen. 4 (6), 309-314 (1999).</li>
<li>Daijo, J. E., Sportsman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-resolved+fluorescence+immunoassay+for+insulin+in+rodent+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Biomed+Anal%22%5BJournal%5D)">A time-resolved fluorescence immunoassay for insulin in rodent plasma.</a> J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 335-342 (1999).</li>
<li>Merglen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+sensitivity+and+metabolism-secretion+coupling+studied+during+two-year+continuous+culture+in+INS-1E+insulinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Glucose sensitivity and metabolism-secretion coupling studied during two-year continuous culture in INS-1E insulinoma cells.</a> Endocrinology. 145 (2), 667-678 (2004).</li>
<li>Ustione, A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+synthesis+and+D3+receptor+activation+in+pancreatic+beta-cells+regulates+insulin+secretion+and+intracellular+%5BCa%282%2B%29%5D+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Dopamine synthesis and D3 receptor activation in pancreatic beta-cells regulates insulin secretion and intracellular [Ca(2+)] oscillations.</a> Mol Endocrinol. 26 (11), 1928-1940 (2012).</li>
<li>Ustione, A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+introduction+to+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A simple introduction to multiphoton microscopy.</a> J Microsc. 243 (3), 221-226 (2011).</li>
<li>Ustione, A., Piston, D. W., Harris, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+Dopaminergic+regulation+of+insulin+secretion+from+the+pancreatic+islet%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Minireview: Dopaminergic regulation of insulin secretion from the pancreatic islet.</a> Mol Endocrinol. 27 (8), 1198-1207 (2013).</li>
<li>Rubi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+D2-like+receptors+are+expressed+in+pancreatic+beta+cells+and+mediate+inhibition+of+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dopamine D2-like receptors are expressed in pancreatic beta cells and mediate inhibition of insulin secretion.</a> J Biol Chem. 280 (44), 36824-36832 (2005).</li>
<li>Garcia-Tornadu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+dopamine+d2+receptor+impairs+insulin+secretion+and+causes+glucose+intolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Disruption of the dopamine d2 receptor impairs insulin secretion and causes glucose intolerance.</a> Endocrinology. 151 (4), 1441-1450 (2010).</li>
<li>Garcia-Tornadu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+endocrine+and+metabolic+roles+of+dopamine+D2+receptors+gained+from+the+Drd2+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">New insights into the endocrine and metabolic roles of dopamine D2 receptors gained from the Drd2 mouse.</a> Neuroendocrinology. 92 (4), 207-214 (2010).</li>
<li>Lopez Vicchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+drugs+in+type+2+diabetes+and+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic drugs in type 2 diabetes and glucose homeostasis.</a> Pharmacol Res. 109, 74-80 (2016).</li>
<li>Kalra, S., Kalra, B., Agrawal, N., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine%3A+The+forgotten+felon+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Pat+Endocr+Metab+Immune+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Dopamine: The forgotten felon in type 2 diabetes.</a> Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov. 5 (1), 61-65 (2011).</li>
<li>Mahajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bromocriptine+mesylate%3A+FDA-approved+novel+treatment+for+type-2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Bromocriptine mesylate: FDA-approved novel treatment for type-2 diabetes.</a> Indian J Pharmacol. 41 (4), 197-198 (2009).</li>
<li>Caicedo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+and+autocrine+interactions+in+the+human+islet%3A+more+than+meets+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Paracrine and autocrine interactions in the human islet: more than meets the eye.</a> Semin Cell Dev Biol. 24 (1), 11-21 (2013).</li>
<li>Ballon, J. S., Pajvani, U., Freyberg, Z., Leibel, R. L., Lieberman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathophysiology+of+metabolic+effects+of+antipsychotic+medications%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Molecular pathophysiology of metabolic effects of antipsychotic medications.</a> Trends Endocrinol Metab. , (2014).</li>
<li>Freyberg, Z., Aslanoglou, D., Shah, R., Ballon, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+and+antipsychotic+drug-induced+metabolic+dysfunction+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Intrinsic and antipsychotic drug-induced metabolic dysfunction in schizophrenia.</a> Front Neurosci. 11, 432(2017).</li>
<li>de Leeuw van Weenen, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dopamine+receptor+D2+agonist+bromocriptine+inhibits+glucose-stimulated+insulin+secretion+by+direct+activation+of+the+alpha2-adrenergic+receptors+in+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The dopamine receptor D2 agonist bromocriptine inhibits glucose-stimulated insulin secretion by direct activation of the alpha2-adrenergic receptors in beta cells.</a> Biochem Pharmacol. 79 (12), 1827-1836 (2010).</li>
</ol>

Wij danken Nicolas Pierre (Cisbio Bioassays) voor nuttig advies en Dr. Pierre Maechler (Universiteit van Genève) royaal voorzien van INS-1E cellen. Dit werk werd gesteund door financiële middelen van het ministerie van defensie (grant PR141292 aan Z.F.), en de John F. en Nancy A. Emmerling Fund van de Pittsburgh Stichting (Z.F.).

De HTRF insuline assay hier beschreven biedt een snelle, efficiënte systeem voor het meten van de insuline secretie van een gekweekte cel-gebaseerd systeem. Onder zijn belangrijkste voordelen biedt deze test een signaal van de laag achtergrond als gevolg van de hoge signaal-/ ruisverhouding. Bovendien, we hebben bevestigd dat het HTRF signaal stabiel voor langere tijd (> 24 h)7. Niettemin, aangezien snel de insuline-bindende monoclonal antilichamen bindende verzadiging na toevoeging aan de bepalin...

De regulering van de energie-stofwisseling is verfijnd door een grote anabole hormoon, insuline. Insuline wordt gesynthetiseerd en uitgebracht door alvleesklier beta cellen in reactie op de toegenomen extracellulaire glucoseniveaus. De vrijgegeven insuline activeert de opname van glucose door insuline-gevoelige weefsels1,2. Fysiologisch, is dit gekoppeld aan de hoogte van glucose concentratie na een maaltijd, gevolgd door de secretie van insuline te reguleren van glucose-opname. Verstoringen in glucose homeostase leiden tot metabole waardeverminderingen culminerend in insulineresistentie en uiteindelijk in het begin van type 2 diabetes2,3,4.
Hoewel insuline secretie is uitgebreid bestudeerd, blijven de regulerende mechanismen slecht begrepen. Een cruciaal gebied van onderzoek is identificatie van roman modulatoren van insuline secretie door beta cellen5,,6,,7,8. Deze studies vereisen een beter begrip van de relatie van de koppeling tussen stimulatie van glucose en insuline secretie. Daarom is de mogelijkheid om nauwkeurig controleren en kwantificeren van de niveaus van de glucose-gestimuleerd insuline secretie (GSIS) essentieel geweest. Tot op heden, waren echter slechts een beperkt aantal methoden om een kwantificering van GSIS met behulp van insuline-afscheidende cellijnen en/of de alvleesklier eilandjes. Een is de radioimmunoanalyse (RIA), die gebruik maakt van de isotoop-gelabeld insuline en antilichamen. De belangrijkste beperkingen van deze aanpak zijn veiligheidsproblemen als gevolg van de behandeling en de verwijdering van radioactieve materialen. Bovendien, is deze methode arbeidsintensief, waarbij meerdere lange wassen en incubatie stappen. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is een andere duur en arbeidsintensief benadering die gebruikmaakt van antilichamen voor insuline detectie. Variatie in antilichaam affiniteiten en de efficiëntie van de erkenning van insuline factoren van deze methode zijn beperkt, en de reproduceerbaarheid van de resultaten kan beïnvloeden. ELISA noch RIA is ontworpen voor high-throughput experimenten. AlphaScreen is een homogene test gebruikt voor het opsporen en het meten van niveaus van insuline secretie. AlphaScreen technologie is gebaseerd op de omzetting van ambient zuurstof in een opgewonden zuurstof singlet staat die met chemiluminescentie soorten reageren kan, resulterend in de generatie van Chemoluminescentie. Omdat de bepaling homogeen is, worden veel van de stappen van de Supermarket gekoppeld RIA en ELISA geëlimineerd. De instabiliteit van het signaal door de aard van de reactie is echter een beperkende factor die invloed kan hebben op de uitlezing van de bepaling. (TR-Tang, ontwikkeld door Heyduk en collega's9, is een andere homogene aanpak van insuline waarderingsmethode op basis van de binding van twee aparte antilichamen tegen verschillende epitopen op de insuline-molecuul. De antilichamen zijn elk chemisch verbonden met dubbele gestrande DNA met korte overhangen voor aanvullende gestrande enkele DNA. Binding van de antilichamen aan insuline brengt hen samen en leidt tot een dubbele duplex voor gestrande DNA. Elke antilichaam wordt ook geassocieerd met een respectieve donor of acceptor fluorophore en de vereniging van de DNA-duplex verenigt deze fluorophores te genereren Förster resonance energy transfer (FRET). Een mogelijke beperking van TR-Tang, berust echter bij de FRET zelf. Het onvermogen om snel het verdrijven van achtergrond fluorescentie tijdens de FRET reactie kan leiden tot relatief hoge achtergrond fluorescentie en een lage signaal / ruisverhouding binnen de bepaling. Daarom bestaat een noodzaak nog steeds voor een betrouwbare, robuuste en rendabele assay voor het kwantificeren GSIS zodanig hoge gegevensdoorvoer.
Recente vooruitgang in de biofysica hebben geresulteerd in de ontwikkeling van een homogene time-resolved fluorescentie energie resonantie overdracht (HTRF) gebaseerd assay. Specifiek, terwijl de energie overdracht binnen kan de bepaling worden omschreven als FRET gebaseerde, nauwkeuriger, dat HTRF afhankelijk van luminescentie energie resonantie overdracht (LRET)10 die de niet-stralingstransport van energie tussen de donor en de acceptor soorten11,12,13. Dit onderscheid is belangrijk, aangezien de timing van een fluorescentie of blussen gebaseerde FRET interactie is veel anders dan die van LRET, hoewel het dezelfde soorten gating kunnen worden gebruikt voor de FRET en LRET. Bovendien, het gebruik van zeldzame aarden lanthanide cryptate verbindingen zoals europium of terbium cryptate in HTRF produceert lange fluorescentie halfwaardetijd12,14. Dit biedt het unieke voordeel van de invoering van een vertraging (µsec) tussen excitatie van de donor en de meting van de emissie van de acceptor (dat wil zeggen, time-resolved assay). Deze vertraging zorgt voor voldoende tijd voor de achtergrond fluorescentie te verdrijven voorafgaand aan de meting van de acceptor emissie fluorescentie. Bijgevolg, de uitlezing is gratis voor niet-specifieke fluorescentie en dus een hoge signaal-/ ruisverhouding wordt bereikt (Figuur 1). Bovendien, het homogene karakter van de HTRF elimineert de noodzaak voor het wassen van de stappen aan het afwassen van de niet-afhankelijke soorten, het maken van de test veel sneller dan ELISA of RIA gebaseerde methoden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57531/57531fig1.jpg"> Figuur 1: schematische van het mechanisme voor HTRF insuline detectie. Twee onafhankelijk gegenereerde monoklonale antilichamen specifiek herkennen en binden aan insuline op afzonderlijke sites. Deze antilichamen zijn geconjugeerd aan hetzij de europium cryptate donor of de XL665 acceptor. Excitatie van de donor op 337 nm resultaten in emissie bij 620 nm. De resulterende energieoverdracht veroorzaakt XL665 te stoten bij een langere golflengte, 665 nm. <a href="/files/ftp_upload/57531/57531fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het bepalen van de niveaus van GSIS van INS-1E cellen met een HTRF gebaseerde benadering, een gevestigde insuline-afscheidende bèta cel-afgeleide rat Insulinoom cel lijn15. Bovendien, kan deze bepaling worden gebruikt voor de identificatie van het farmacologisch profiel van moleculaire regulatoren van insuline secretie. We passen deze test van de HTRF gebaseerde insuline te onderzoeken van dopamine D2-like receptor regulering van GSIS. Steeds meer studies hebben aangetoond dat de neurotransmitter dopamine een belangrijke regulator van GSIS8,16,17,18,19,20, 21 , 22. dopamine beïnvloedt GSIS op een negatieve wijze van de autocrine/paracrine via acties op de dopamine D-2-receptoren (D2, D3D4 receptoren) uitgedrukt op het oppervlak van beta cellen van de alvleesklier8 graag , 16 , 19. met behulp van deze test, wij bevestigen dopamine de rol als een negatieve regulator van GSIS en aantonen dat de dopamine D2-like receptor agonisten bromocriptine en quinpirole ook GSIS verminderen.

<table><tbody><tr><td>96-well white half area plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82050-042</td><td></td></tr><tr><td>384-well white low-volume, round-bottom plate</td><td>Corning</td><td>15100157</td><td></td></tr><tr><td>Insulin High Range Kit</td><td>Cisbio Bioassays</td><td>62IN1PEH&nbsp;</td><td>10.000 test HTRF-based insulin assay kit</td></tr><tr><td>PHERAstar FSX plate reader</td><td>BMG Labtech</td><td>FSX</td><td>Plate reader aangepast voor HTRF-based assay metingen</td></tr><tr><td>Plate sealers</td><td>Fisher Scientific</td><td>DY992</td><td>Om plaat te verzegelen terwijl antilichamen incuberen</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1x)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11875-093</td><td>[+] L-glutamine</td></tr><tr><td>Trypsin 0.05%&nbsp;</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td>0,53 mM EDTA, (-) natriumbicarbonaat</td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>Zonder calcium en magnesium</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>156-30-080</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine oplossing 100x</td><td>Corning</td><td>30-002 CT</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M1348</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blauw Stain (0,4%)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Dopamine hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>8502</td><td></td></tr><tr><td>Bromocriptine mesylaat</td><td>Tocris</td><td>427</td><td></td></tr><tr><td>(-)-Quinpirol hydrochloride</td><td>Tocris</td><td>1061</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine</td><td>Calbiochem</td><td>12659</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td><td>Sigma</td><td>276855</td><td></td></tr></tbody></table>

homogene time-resolved förster resonance energie overdracht gebaseerde assay voor detectie van insuline secretie

Homogeneous Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

De detectie van insuline secretie is essentieel voor informatief mechanismen van gereglementeerde secretie zo goed zoals in de studie van het metabolisme. Hoewel talrijke insuline tests hebben al tientallen jaren bestaan, heeft de recente komst van homogene time-resolved Förster Resonance Energy Transfer (HTRF) technologie deze metingen aanzienlijk vereenvoudigd. Dit is een snelle, rendabele, reproduceerbare en robuuste optische test afhankelijker van antilichamen geconjugeerd met heldere fluorophores met langdurige emissie die time-resolved Förster Resonance Energy Transfer vergemakkelijkt. Bovendien is HTRF insuline detectie vatbaar voor de ontwikkeling van high-throughput screening tests. Hier gebruiken we HTRF om het detecteren van insuline secretie in INS-1E cellen, een rat Insulinoom afkomstige cellijn. Dit kan we schatten van basale niveaus van insuline en hun veranderingen in reactie op de stimulatie van de glucose. Daarnaast gebruiken wij deze insuline-detectiesysteem om te bevestigen de rol van dopamine als een negatieve regulator van glucose-gestimuleerd insuline secretie (GSIS). Op een vergelijkbare manier, andere dopamine D2-like receptor agonisten, quinpirole en bromocriptine, GSIS in een concentratie-afhankelijke manier verminderen. Onze resultaten wijzen op het nut van het HTRF insuline assay formaat bij het bepalen van de rol van talrijke drugs in GSIS en hun farmacologische profielen.

We onze insuline HTRF assay gevalideerd door het genereren van een insuline standaard curve met behulp van gezuiverde menselijke insuline normen van vooraf gedefinieerde concentraties (Figuur 2). Generatie van de standaard curve toegestaan ons om te extrapoleren de ratiometric fluorescentie lezingen en dus om te bepalen van de secreted insulineniveaus in reactie op de behandelingen van de drug (Figuur 2). Intraplate variatie voor...

Hier presenteren we homogene tijd opgelost FRET (HTRF) als een efficiënte methode voor snelle detectie van insuline afgescheiden uit cellen.

Homogene Time-resolved Förster Resonance energie overdracht gebaseerde Assay voor detectie van insuline secretie

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous ...

Het algemene doel van deze procedure is om de niveaus van uitgescheiden insuline van insuline-afscheidende cellen te induceren en nauwkeurig te kwantificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van diabetes, zoals de belangrijkste mechanismen onder glucose-gestimuleerde insulinesecretie in pancreatische bètacellen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het insulinesecretie nauwkeurig en snel kan kwantificeren als reactie op glucose-stimulatie en potentiële geneesmiddeleffecten op secretie kan detecteren.De implicaties van deze techniek reiken tot therapie en geneesmiddelontdekking voor de behandeling van type 2 diabetes, omdat het ons zal helpen de mechanismen van door geneesmiddelen geïnduceerde metabole disfunctie beter te begrijpen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de insulinesecretie van geïmmortaliseerde bètacellenlijnen, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals intacte pancreatische eilandjes. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode het moeilijk vinden, vanwege meerdere stapjes voor het hanteren van cellen en geneesmiddelpreparaten.We hadden voor het eerst het idee voor deze

homogeneous-time-resolved-frster-resonance-energy-transfer-based

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Förster resonance energy transfer (FRET) microscopie is een krachtige techniek voor real-time monitoring van signalering gebeurtenissen in levende cellen met behulp van verschillende biosensoren als verslaggevers. Hier beschrijven we hoe u een aangepaste epifluorescentie bouwen FRET beeldverwerkingssysteem van in de handel verkrijgbare componenten en hoe deze te gebruiken voor FRET experimenten.

FRET microscopie voor Real-time monitoring van Signalering Evenementen in levende cellen met behulp Unimoleculaire Biosensoren

This video describes the time-resolved Förster resonance energy transfer or TR-FRET assay to determine endogenous protein phosphorylation with the help of donor and acceptor fluorophores tagged on antibodies specific to a test protein. This technique is designed to measure the phosphorylation of test proteins in cell lysates.

Time-Resolved Forster Resonance Energy Transfer for Monitoring Protein Phosphorylation in Cells

This video showcases the electrochemiluminescence detection of islet autoantibodies in human serum. The antibodies in the serum bridge the ruthenium-conjugated antigen to the biotinylated capture antigen, forming complexes that are detected by electrochemiluminescence measurements.

Detection of Human Islet Autoantibodies Using an Electrochemiluminescence Assay

Een beschrijving van hoe je Förster Resonance Energy Transfer geïntegreerde biologische sensoren (FIBS) kalibreren voor in situ metabool profiel wordt gepresenteerd. De FIBS kan worden gebruikt om de intracellulaire niveaus van metabolieten invasief leveren aan de ontwikkeling van metabole modellen en hoge doorvoer screening van bioproces omstandigheden te meten.

FIBS-enabled Noninvasive metabole

Dit protocol beschrijft een snelle en gevoelige kwantificatie van Förster resonantie energieoverdracht (FRET) sensorgegevens met een maat draagbare FRET analyzer. De inrichting werd gebruikt voor maltose binnen een kritisch temperatuurtraject dat detectiegevoeligheid maximaliseert, zodat praktische en efficiënte evaluatie van het suikergehalte detecteren.

Uiterst gevoelige en Rapid fluorescentiedetectie met een Portable FRET Analyzer

Het doel van dit protocol is voor het meten van het effect van glucose-gemedieerde wijzigingen in mitochondriale ademhaling in de aanwezigheid van natuurlijke verbindingen op intact 832/13 beta cellen met behulp van hoge-resolutie respirometrie.

Hoge resolutie respirometrie voor het meten van mitochondriale functie van Intact Beta-cellen in de aanwezigheid van natuurlijke verbindingen

In dit protocol wordt beschreven hoe u snelle Low-cost Luciferase-analyses uitvoeren bij medium-throughput met behulp van een insuline-linked Gaussia Luciferase als proxy voor insuline secretie van beta-cellen. De assay kan uitgevoerd worden met de meeste luminescentie plaat lezers en multichannel pipetten.

Meten van relatieve insuline secretie met behulp van een co-afgescheiden Luciferase surrogaat

Tijd-opgeloste Förster resonantie energieoverdracht cel-gebaseerde assay protocollen worden beschreven voor de eenvoudige, specifieke, gevoelige en robuuste kwantificering van endogene gefosforyleerde signaal transducer en activator van transcriptie (STAT) 1/3/4/5/6 eiwitten in cellysaten in een 384-well formaat.

Tijd-opgeloste Förster Resonantie Energie Transfer Assays voor meting van endogene gefosforyleerde STAT-eiwitten in menselijke cellen

Dit protocol beschrijft een methode voor de synchrone acquisitie en co-registratie van intracellulaire signaleringsgebeurtenissen en de secretie van insuline en glucagon door primaire menselijke pseudo-eilandjes met behulp van de adenovirale toediening van een cyclische adenosinemonofosfaat (cAMP) biosensor, een cAMP-verschildetector in situ (cADDis) en een microperifusiesysteem.

Menselijk pseudo-eilandsysteem voor synchrone beoordeling van fluorescerende biosensordynamica en hormoonsecretoire profielen

Hier presenteren we een protocol om de spatiotemporele dynamiek van Akt-activering en fosforylering in levende HepG2-cellen te kwantificeren. Förster resonantie energieoverdracht (FRET) beeldvorming is een krachtig hulpmiddel dat waardevolle inzichten biedt in insulinesignaleringsroutes en metabole regulatie in kankercellen.

Levende cel Förster resonantie energieoverdracht beeldvorming van metabolisch gereguleerde akt-activeringsdynamiek in HepG2-cellen

We hebben een Duplex in situ hybridisatietest opgezet om insulinereceptorisovormen IR-A en IR-B in de plexus choroid muizen in kaart te brengen, waardoor de beperkingen van traditionele methoden worden overwonnen. Deze benadering met hoge resolutie onthult isovormspecifieke expressie en biedt nieuwe inzichten in insulinesignalering in de hersenen en mogelijke isovormgerichte therapieën voor neurologische aandoeningen.

Nauwkeurige visualisatie van insulinereceptoren A en B in de hersenen van muizen met een RNA in situ hybridisatietest

Leer HTRF voor snelle detectie van insulinesecretie uit pancreas-bètacellen. Deze methode kwantificeert glucose-gestimuleerde secretie nauwkeurig en ondersteunt diabetesonderzoek en geneesmiddelontwikkeling.

Homogene Time-resolved Förster Resonance energie overdracht gebaseerde Assay voor detectie van insuline secretie

Meer video's verkennen