Homogene Time-resolved Förster Resonance energie overdracht gebaseerde Assay voor detectie van insuline secretie

Het algemene doel van deze procedure is om de niveaus van uitgescheiden insuline van insuline-afscheidende cellen te induceren en nauwkeurig te kwantificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van diabetes, zoals de belangrijkste mechanismen onder glucose-gestimuleerde insulinesecretie in pancreatische bètacellen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het insulinesecretie nauwkeurig en snel kan kwantificeren als reactie op glucose-stimulatie en potentiële geneesmiddeleffecten op secretie kan detecteren.

De implicaties van deze techniek reiken tot therapie en geneesmiddelontdekking voor de behandeling van type 2 diabetes, omdat het ons zal helpen de mechanismen van door geneesmiddelen geïnduceerde metabole disfunctie beter te begrijpen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de insulinesecretie van geïmmortaliseerde bètacellenlijnen, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals intacte pancreatische eilandjes. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode het moeilijk vinden, vanwege meerdere stapjes voor het hanteren van cellen en geneesmiddelpreparaten.

We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we een snelle assay wilden ontwikkelen om de acties van dopaminerge geneesmiddelen op insulinesecretie te onderzoeken. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de stappen voor het hanteren van cellen moeilijk te leren zijn vanwege de delicate aard van de cellen en de belangrijkheid van precisie om consistentie van de assay tussen experimenten te garanderen. Eerst kweekt u de INS-1E cellen zoals beschreven in de tekstprotocol.

Zodra de cellen de gewenste confluentie bereiken, zuigt u het medium af. Was de cellen met vijf milliliter fosfaatgebufferde zoutoplossing. Voeg vervolgens 0,5 milliliter van 025% trypsine toe aan de cellen en laat de cellen vervolgens drie tot vier minuten in de incubator bij 37 graden Celsius.

Deactiveer het trypsine door negen milliliter compleet medium toe te voegen. Breng de cellen vervolgens over naar een 15 milliliter centrifugeerbuis. Centrifugeer vervolgens de cellen om een pellet te vormen.

Na centrifugatie lost u de pellet op in vijf milliliter vers medium. Pipetteer 10 microliter van de opnieuw opgehangen cellen uit de buis en meng met 10 microliter trypan blauw vitale kleurstof om de levensvatbaarheid te beoordelen. Gebruik vervolgens een hemocytometer om het aantal levende en dode cellen te tellen en ervoor te zorgen dat 90%van de cellen levend is.

Na het tellen, voegt u één miljoen cellen per milliliter toe in vers RPMI 1640 medium, zaait u vervolgens 0,5 milliliter van 500.000 INS-1E cellen in elke put van een poly-L-lysine gecoate 24-well plate. Laat de plaat een hele dag in de incubator. De volgende dag verwijdert u het medium en voegt u 500 microliter vers RPMI 1640 medium toe in elk van de putten.

Incubeer de plaat nog eens 24 uur voor de cellen zich over de putoppervlakken verspreiden. Om de assay uit te voeren, bereidt u eerst de KRB buffer voor, zuigt u het medium uit elk van de putten af en wast u met voorverwarmde fosfaatgebufferde zoutoplossing, twee keer. Voeg vervolgens 450 microliter KRB buffer toe, aangevuld met bovien serumalbumine, maar geen glucose, in elke put.

Laat de kweekplaat een uur staan bij 37 graden Celsius en 5%koolstofdioxide. Bereid seriële verdunningen van de geneesmiddelen in KRB buffer, aangevuld met 10X eindconcentratie van 200 millimolar glucose. Na de glucose-uithongeringsstap, pipetteer 50 microliter van de sterieel verdunde geneesmiddelen in elk van de bijbehorende putten.

Voor glucose-stimulatie, voegt u de respectieve sterieel verdunde geneesmiddelen toe in aanwezigheid van 20 millimolar glucose. Vervolgens incubeert u de cellen bij 37 graden Celsius gedurende 90 minuten. Zodra de stimulatie voorbij is, verzamelt u de supernatanten en brengt u deze over naar gelabelde 1,5 milliliter centrifugeerbuizen.

Breng 10 microliter van elk verzamelde supernatant over naar een 96-well plaat. Voeg 90 microliter KRB toe aan elke put om een verdunningsverhouding van een op tien te bereiken. Meng de verdunningen om homogeniteit te garanderen.

Vervolgens verkrijgt u de insuline standaardcurve voor de HTRF insuline assay. Voeg vervolgens 10 microliter van elk van de standaard insuline monsters en de verdunde assay supernatanten toe aan een 96-well plaat. Bereid het antilichaammengsel voor in een verhouding van een op twee donor tot acceptor in de detectiebuffer.

Na het bereiden van het antilichaammengsel, voegt u 30 microliter toe aan elk van de putten in een 96-well plaat. Verzegeld de plaat en incubeer bij kamertemperatuur. Na twee uur incubatie, leest u de plaat met het antilichaammengsel op de platenlezer.

Gebruik de juiste HTRF optische module bij 665 en 620 nanometer voor het lezen en gebruik 200 flashes voor elke put. Eerst wordt een insuline standaardcurve uitgezet om de werkelijke insulinewaarden uit de assaymonsters te extrapoleren. De standaardcurve toont aan dat de ratiometrische fluorescentiewaarde significant toeneemt als functie van de vooraf gedefinieerde standaard humane insulineconcentraties.

Vervolgens wordt het basale niveau van insulinesecretie van de INS-1E cellen bestudeerd in aanwezigheid of afwezigheid van 20 millimolar glucose. Uit de plot blijkt dat de cellen ongeveer 100 nanogram per milliliter insuline afscheiden in aanwezigheid van glucose. Interessant is dat het insulineniveau bijna de helft is, ongeveer 15 nanogram per milliliter, in afwezigheid van glucose.

Vervolgens worden de cellen geïncubeerd in aanwezigheid van toenemende concentraties dopamine met 20 millimolar glucose. De uitgescheiden insuline wordt genormaliseerd op de gemiddelde waarde van het percentage maximum insuline van elke put. De plot toont aan dat dopamine GSIS remt, waardoor de functionele belangrijkheid van dopaminerge receptoren in GSIS wordt aangetoond.

Deze plot toont aan dat bromocriptine, een type 2 diabetes geneesmiddel, krachtiger is in het induceren van GSIS dan dopamine. Deze plot toont aan