Name: Snelle en specifieke Immunomagnetic isolatie van de primaire oligodendrocyten muis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Leer immunomagnetische isolatie van primaire oligodendrocyten uit neonatale muizen voor in vitro myelinisatiestudies. Deze methode bereikt meer dan 80% zuiverheid in ongeveer een uur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door subsidies van de National Multiple Sclerosis Society (RG4591A1/2) en de National Institutes of Health (R03NS06740402). De auteurs bedanken Dr Ivan Hernandez en zijn leden van de lab voor het verstrekken van laboratorium ruimte, apparatuur en advies.

De muizen gebruikt in deze studie werden verzorgd volgens de richtlijnen van het protocolnummer SUNY Downstate Medical Center divisie van laboratorium dier middelen (DLAR) 15-10492.
Opmerking: Primaire oligodendrocyten werden geïsoleerd van neonatale (P5-P7 wild-type C57Bl/6N) muizen. In dit stadium vormen onvolwassen OLs meer dan 80% van de knaagdier witte stof zorgen voor hoge cellulaire opbrengst. Alle buffer en reagens composities zijn beschikbaar aan het einde van de Tabel van materialen.
1. Coverslips voorbereiding
Opmerking: Poly-D-lysine (PDL) / laminin gecoat coverslips moet worden voorbereid voordat OL isolatie.
<ol><li>Plaats #1 Duits coverslips glas in een conische buis van 50 mL en voeg 35 mL 70% EtOH om deze te reinigen.</li>
	<li>Sluit de buis, plaatst u deze in een nutating mixer en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten terwijl het voorzichtig rocken. Coverslips kan 's nachts worden geïncubeerd.</li>
	<li>Gooi de 70% EtOH.</li>
	<li>De coverslips 3 keer met gedeïoniseerd water wassen, verwijder het water telkens met vacuüm aspiratie.</li>
	<li>30-35 mL PDL 50 µg/ml toevoegen aan de coverslips in de buis met 50 mL, genoeg ter dekking van de coverslips.</li>
	<li>Plaats van de 50 mL-buis met de coverslips op een nutating mixer en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten terwijl het voorzichtig rocken.</li>
	<li>Wassen van de coverslips 3 keer met gedeïoniseerd water, het verwijderen van het water telkens met vacuüm aspiratie.</li>
	<li>Breng de coverslips in de 60-mm petrischalen met gedeïoniseerd water.</li>
	<li>Gebruik een tip van de pipet P200 te regelen van de coverslips als een laag die betrekking hebben op het gehele oppervlak van de petrischaal.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig, het water van de schotels met vacuüm aspiratie.</li>
	<li>Verwijder de overmaat water rond de coverslips en laat ze drogen overnachting met deksel open en onder UV-licht in de kap. Opmerking: PDL gecoat glas coverslips kan worden achtergelaten bij 4 ° C in steriele petrischalen voor maximaal drie maanden.</li>
	<li>Plaats de coverslips in 24-Wells-platen, één per goed, met behulp van fijne pincet.</li>
	<li>Verplaats de coverslips naar het midden van het goed om ervoor te zorgen dat de randen raak niet aan de muur van de waterput.</li>
	<li>Voeg 100 µL van 10 µg/mL laminin verdund in B27NBMA (Zie de Tabel van materialen) beginnen in het midden van elke dekglaasje aan en verplaatsen in een circulaire mode naar de randen ter dekking van alle gebied. Opmerking: Aangezien laminin betrokken bij OL onderhoud is en differentiatie in volwassen OLs bevordert, het is een belangrijke factor van de overleving van de OL voor in vitro cultuur41,42,43,44.</li>
	<li>Incubeer de plaat in een incubator van 37 ° C bij 5% CO2 voor ten minste 1 uur of totdat de OLs klaar voor de beplating zijn.</li>
</ol>2. muis hersenen Cortex dissociatie
<ol><li>Offeren postnatale 5-7-daagse oude C57Bl/6N muis pups door snelle onthoofding met een schaar eerder gereinigd in 70% ethanol. Opmerking: cerebrale cortices van 5-6 neonatale muizen pups werden gebruikt voor elk preparaat. Een muis hersenen levert gemiddeld 1-1,5 x 106 OLs.</li>
	<li>Snijd de hoofdhuid huid langs de middellijn met een kleine ontleden schaar en intrekken om de schedel bloot te stellen.</li>
	<li>Snijd de schedel zorgvuldig langs de middellijn vanaf de opening aan de achterkant van de schedel naar het frontaal oppervlak, opheft met de schaar om te voorkomen beschadiging van de hersenen. Knip dan, met behulp van de opening aan de achterkant van de schedel naar elke oogkas langs de onderkant van de schedel.</li>
	<li>Gebruik fijne pincet voorzichtig plagen van de cortices uit de buurt van de veroorzaakt en hen overbrengen naar een 60-mm weefselkweek schotel met 7 mL B27NBMA. Herhaal stap 2.2 tot 2.4 voor elke hersenen, bundeling van de ontleed cortices.</li>
	<li>De cortices overbrengen in een nieuwe 60 mm weefselkweek schotel met 5 mL dissociatie buffer (B27NBMA, 20-30 U/mL papaïne en 2.500 U DNase ik).</li>
	<li>Snijd de cortices in kleine stukjes van ongeveer 1 mm-3 met behulp van een scalpel #15-mes en incubeer gedurende 20 min in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.</li>
	<li>Voeg vervolgens 1 mL van boviene groei serum (BGS) om te stoppen met de enzymatische reactie.</li>
	<li>De cortices samen met de dissociatie media overbrengen in een 15-mL conische buis met behulp van een serologische Pipetteer van 10 mL.</li>
	<li>Zachtjes begint te distantiëren van het hersenweefsel door langzaam pipetteren omhoog en naar beneden 6 - 8 keer met behulp van een 10-mL serologische Pipetteer, met behulp van care om te minimaliseren van de bubbels.</li>
	<li>Laat de stukjes weefsel te regelen voor 2-3 min en het supernatant overbrengen in een verse buis.</li>
	<li>Voeg 3 mL B27NBMA met 10% BGS/2500 U DNase ik aan het weefsel pellet.</li>
	<li>Een serologische 5 mL-pipet zachtjes het verwerpen van het hersenweefsel terwijl pipetteren omhoog en omlaag gebruiken 6 - 8 keer. Wees voorzichtig om te minimaliseren van de bubbels.</li>
	<li>Laat de stukjes weefsel te regelen voor 2-3 min.</li>
	<li>Het supernatant overbrengen in een verse buis. Voeg 3 mL B27NBMA met 10% BGS/DNase ik aan het weefsel pellet.</li>
	<li>Zachtjes distantiëren van het hersenweefsel met behulp van een P1000 Pipetteer tip, terwijl de mix van media pipetteren en brain weefsel op en neer. Herhaal stappen 2.13 en 2.14 totdat geen grote brokken van weefsel blijven of tot B27NBMA die 10 gewichtspercenten BGS/DNase ik is uitgeput, indien dit eerder is. Wees voorzichtig om te minimaliseren van de bubbels.</li>
	<li>Zwembad celsuspensie met vorige supernatant.</li>
	<li>70-µm cel zeef in een 50 mL-buis te plaatsen. Met behulp van een 10-mL serologische Pipetteer, voorbij de gepoolde celsuspensie zachtjes de zeef van de cel 70-µm.</li>
	<li>De cel zeef wassen door toevoeging van 1 mL B27NBMA met 10% BGS/DNase ik.</li>
	<li>Gooi de cel zeef. Zodat het volume 30 mL met B27NBMA met 10% BGS/DNase ik.</li>
	<li>Spoel de celsuspensie twee 15-mL conische buizen. De celsuspensie gedurende 10 minuten bij 200 x g centrifugeren.</li>
	<li>Verwijder de bovendrijvende vloeistof zonder het verlaten van de cellen die zijn blootgesteld aan de lucht. De bovendrijvende vloeistof zullen bewolkt als gevolg van cel puin. Voeg 3 mL B27NBMA met 10% BGS aan de pellet.</li>
	<li>Zorgvuldig distantiëren de pellet van de cel met behulp van een pipet P1000. Zodat het volume tot 15 mL met B27NBMA met 10% BGS.</li>
	<li>De celsuspensie voorbij een vers 40 µm cel zeef.</li>
	<li>De cel zeef wassen door toevoeging van 1mL B27NBMA met 10% BGS. Gooi de cel zeef.</li>
	<li>Zodat het volume 30 mL met B27NBMA met 10% BGS.</li>
	<li>De celsuspensie overbrengen in 2 x 15 mL conische buizen. De celsuspensie gedurende 10 minuten bij 200 x g centrifugeren.</li>
	<li>Allermeest naar de bovendrijvende vloeistof verwijderen zonder het verlaten van de cellen die zijn blootgesteld aan de lucht. Resuspendeer de cel-pellets op in 5 mL ijs koud magnetische cel sorteren (MCS) buffer.</li>
</ol>3. bepaling van de cellen en levensvatbaarheid
<ol><li>Verdun 100 µL van de celsuspensie met 400 µL van Trypan blauwe oplossing in een buis van de 1.5-mL microcentrifuge om een verdunning 1:5 in 0,4% (m/v).</li>
	<li>Hiermee centreert u een glas cover over een hemocytometer kamer en vul de twee kamers met 10 µL van de verdunning van de cel met behulp van een precisiepipet P10 en het vermijden van overvulling. De oplossing zal passeren onder het glas cover door capillaire werking.</li>
	<li>Plaats van de hemocytometer in het werkgebied van de Microscoop en aanpassen van de focus met behulp van 40 X vergroting. Opmerking: De cellen zijn opgenomen met behulp van een hand-held teller in elk van de vijf pleinen (vier hoeken en een centrum). Alleen niet-levensvatbare cellen absorberen de kleurstof en blauw, terwijl live en gezonde cellen verschijnen ronde en refractieve en doen niet absorberen de blauw gekleurde kleurstof, zodat voor de bepaling van het aantal levensvatbare en totale cellen per milliliter.</li>
</ol>4. isolatie van O4+ oligodendrocyten
<ol><li>Centrifugeer de celsuspensie bij 200 x g gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Verwijder het supernatant zorgvuldig met behulp van vacuüm aspiratie, vermijden van blootstelling van de cellen aan de lucht.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in 90 µL van MCS buffer per 1 x 107 totaal aantal cellen, gevolgd door de toevoeging van 10 µL van anti-O4 kralen per 1 x 107 cellen.</li>
	<li>Meng de celsuspensie en kralen door zachtjes flicking de buis 15 mL kegelvormig met de vinger 4 - 5 keer.</li>
	<li>Incubeer de mix voor 15 min bij 4 ° C, flicking de buis 15 mL kegelvormig met de vinger 4-5 timesevery 5 min.</li>
	<li>Het wassen van de mix door zachtjes de toevoeging van 2 mL van MCS buffer per 1 x 107 cellen aan de buis. Centrifugeer de mix bij 200 x g gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Verwijder het supernatant door zorgvuldig met behulp van vacuüm aspiratie, vermijden van blootstelling van de cellen aan de lucht. Resuspendeer de pellet cel in 500 µL van MCS buffer voor elk 1 x 107 cellen.</li>
	<li>Een magnetische scheidingsteken aan de stand van een magnetische scheidingsteken koppelen. Een selectiekolom hechten aan het magnetische scheidingsteken en plaatst u een 40 µm cel zeef op de top van de kolom. Plaats twee 15-mL of een 50 mL conische buis onder de kolom van de scheiding voor het verzamelen van de stroom door.</li>
	<li>Vooraf spoelen de 40-µm cel zeef en scheiding kolom met 3 mL MCS buffer en laat de buffer uitvoeren door de kolom zonder het te laten drogen.</li>
	<li>Toe te voegen de mix van celsuspensie en kralen aan de zeef van de cel in de selectiekolom.</li>
	<li>Wassen van de 40 µm cel zeef met 1 mL MCS buffer.</li>
	<li>Negeren van de cel zeef en laat de mengeling van cellen, kralen en buffer uitvoeren door de kolom zonder het te laten drogen.</li>
	<li>Was de scheiding kolom 3 keer met 3 mL MCS buffer en 1 keer met OL proliferatie media.</li>
	<li>Verwijder de scheiding kolom uit de magnetische scheidingsteken, plaats het snel in een conische buis 15 mL en onmiddellijk Voeg 5 mL OL proliferatie media.</li>
	<li>Plaats een zuiger op de top van de kolom en stevig druk te spoelen van de gelabelde cellen in de conische buis 15 mL.</li>
	<li>Verwijder 100 µL celsuspensie cellen en levensvatbaarheid als aangegeven in punt 3 met behulp van de Trypan blauw en hemocytometer te bepalen. Opmerking: De levensvatbaarheid van de cellen boven de 80% is aanvaardbaar om door te gaan met de cultuur van OLs, maar levensvatbaarheid groter is dan 90% is optimaal.</li>
</ol>5. de beplating van geïsoleerde O4+ oligodendrocyten
<ol><li>Verdun de celsuspensie aan de wens plating dichtheid (5 x 10,5 cellen per dekglaasje aan) met behulp van OL proliferatie media. Opmerking: OL zaaien dichtheid is zeer belangrijk, zodat passende celdichtheid dient bevestigd te worden met behulp van een Microscoop weefselkweek voordat u verdergaat. Dichtheid onder 10.000 cellen/coverslips zaaien kan leiden tot overleving van de arme cel. Dichtheid bij 10.000 tot 25.000, OL plating is morfologische differentiatie traag45. We plaat OLs bij een seeding dichtheid van ten minste 50.000 cellen/coverslips om de overleving van de cel.</li>
	<li>De 24-Wells-platen met coverslips bekleed met laminin van incubator aan de kap van weefselkweek verplaatsen</li>
	<li>Laminin uit elke dekglaasje aan verwijderen en vervangen door 100 µL van OL schorsing.</li>
	<li>Incubeer OLs in de 37 °C/5% CO2 incubator voor een maximum van 45 min ter bevordering van OL hechting op de coverslips.</li>
	<li>Na incubatie het 24-Wells-platen uit de incubator te verwijderen. Overstroming van elk van de 24-well plaat met 500 µL van OL proliferatie media.</li>
	<li>Plaats de OLs terug in de 37 °C/5% CO2 incubator voor extra 24 h.</li>
	<li>24 uur na de beplating van OLs, proliferatie media verwijderen en vervangen door OL differentiatie media voor het opwekken van differentiatie.</li>
	<li>Het OLs plaats terug in de incubator en verwijder niet totdat de cellen klaar voor fixatie zijn. Opmerking: Wijzigingen in pH zijn schadelijk voor OLs en afnemen van de levensvatbaarheid van de cellen, daarom geen onnodige verwijdering van OLs culturen uit de incubator moet worden vermeden.</li>
</ol>6. immunofluorescentie kleuring
<ol><li>Voor de detectie van cel Verwijder oppervlakte markeringen (NG2, O1 en O4) het medium van de putten.</li>
	<li>Voeg 250 µL van muis hybridoma supernatant met primaire antilichamen tegen O1 (onverdund)13 en O4 (onverdund)13 en konijn polyklonale tegen NG2 (1:150 verdund in B27NBMA). Opmerking: Als verkrijgbare anti-O1 en anti-O4 antilichamen zijn om te worden gebruikt, is het raadzaam om te gebruiken verdunningen voorgesteld door de fabrikant.</li>
	<li>Incubeer de cellen met primair antilichaam voor 45 min maximale in een 37 °C/5% CO2 incubator.</li>
	<li>Wassen tweemaal met 0,05% Tween-20/1 X PBS. Herstellen van de cellen met de 4% paraformaldehyde (4% PFA) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Wassen drie keer, gedurende 5 min met 0,05% Tween-20/1 X PBS.</li>
	<li>Verdun Alexa 488-geconjugeerde geit-antimuis IgM of anti-konijn IgG secundair antilichaam (1:400) in B27NBMA.</li>
	<li>De 0,05% Tween-20/1 X PBS uit de coverslips verwijderen. Incubeer de cellen met secundair antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.</li>
	<li>Wassen drie keer, gedurende 5 min met 0,05% Tween-20/1 X PBS.</li>
	<li>Voor dubbele kleuring voor het detecteren van interne merkers (GFAP), verwijdert u de 0,05% Tween-20/1 X PBS en blok/permeabilize cellen met blok/permeabilization buffer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Ga anders verder met stap 6.17.</li>
	<li>Verwijder blok/permeabilization buffer en voeg van 250 µL kip anti-GFAP (1:100) verdund in blok/permeabilization buffer.</li>
	<li>Incubeer de cellen met anti-GFAP gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Wassen drie keer, gedurende 5 min met 0,05% Tween-20/1 X PBS.</li>
	<li>Verdun Alexa 594-geconjugeerde geit anti-kip IgG secundair antilichaam deze (1:400) in B27NBMA.</li>
	<li>De 0,05% Tween-20/1 X PBS uit de coverslips verwijderen. Incubeer de cellen met secundair antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.</li>
	<li>Wassen drie keer, gedurende 5 min met 0,05% Tween-20/1 X PBS.</li>
	<li>Counterstain met 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) en monteer de cellen met antifade montage DAPI met media.</li>
	<li>Laat de coverslips overnachten in het donker bij kamertemperatuur genezen.</li>
	<li>Het imago van de gekleurde cellen met een Microscoop epifluorescence. Opmerking: In dit protocol, de cellen werden beeld bij 40 X vergroting met behulp van een uniforme belichtingstijd.</li>
</ol>

De auteurs hebben geen informatieverschaffing.

In deze mededeling presenteren we een methode voor de efficiënte isolatie van hoogst gezuiverde onvolwassen muis Oligodendrocyt culturen. In vergelijking met eerder gepubliceerde protocollen39,40, leverde deze methode een hogere zuiverheid met een veel lager niveau van GFAP-positieve astrocyten en een zeer laag percentage van andere cellen niet-gekenmerkt. Het is belangrijk om erop te wijzen dat deze onrijpe OLs al toegezegd om de oligodendroglial afstamming. Dus...

Oligodendrocyten (OLs) zijn de cellen van de myelinating van het centrale zenuwstelsel (CNS)1. De isolatie en de cultuur van primaire oligodendrocyten in een strak gereguleerde omgeving is een waardevol instrument voor het in vitro onderzoek naar de ontwikkeling van oligodendroglia, alsook de biologie van demyeliniserende ziekten zoals multiple sclerose,2 . Dit vereist een efficiënte en robuuste Oligodendrocyt isolatie en cultuur methode3. In deze studie profiteerde we van de expressie van een onderscheidende Oligodendrocyt cel oppervlakte markering om een gemodificeerde isolatie-techniek die is snelle en specifieke.
Vier verschillende fasen van Oligodendrocyt rijping zijn geïdentificeerd, elk gekenmerkt door de expressie van de oppervlakte merkers onderscheidend cel voor elke ontwikkelings fase (Figuur 1). Deze cel oppervlakte markers kunnen worden herkend door specifieke antilichamen4,5, en kunnen worden gebruikt voor het isoleren van OLs in specifieke stadia. In de eerste fase, Oligodendrocyt voorlopercellen (OPCs) de capaciteit hebben om te vermenigvuldigen, migreren en specifiek express bloedplaatjes afkomstige groei factor receptor (PDGF-Rα)6, ganglioside A2B5, Proteoglycaan NG27,8 , polysialic zuur-neurale cel adhesie molecuul9 en vetzuren-zuur-bindend-proteïne 7 (FABP7)10. Bipolaire morfologie hebben OPCs met enkele korte processen die afkomstig zijn van de tegengestelde Polen van de cel lichaam, dat is kenmerkend voor de voorloper van de neurale cellen11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57543/57543fig1v2.jpg"> Figuur 1: expressie van cel oppervlakte markers tijdens de ontwikkeling van de muis Oligodendrocyt. OLs cel oppervlakte markeringen zoals A2B5, GalC (O1), NG2, O4 en PDGF-Rα kunnen worden gebruikt om te isoleren specifiek oligodendrocyten specifieke ontwikkelingsstoornissen stadium met behulp van specifieke antilichamen.   <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57543/57543fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
In de tweede fase, OPCs aanleiding geven tot preoligodendrocytes en express op het celmembraan niet alleen OPC markeringen, maar ook het sulfatide (een sulfated galactolipid) erkend door de O4 antilichaam12,13, en de GPR17-eiwit14, die blijft bestaan tot de fase van onrijpe Oligodendrocyt (OL). In dit stadium uitbreiden preoligodendrocytes multipolaire korte processen. Preoligodendrocytes zijn de grote OL Stadium op postnatale dag 2 (P2) in de cerebrale witte stof voor zowel rat en muis met een kleine bevolking van onrijpe OLs15.
Tijdens de derde fase blijven de onrijpe OLs express van O4, uitdrukking van A2B5 en NG2 markers verliezen en beginnen te express galactocerebroside C16. In dit stadium, OLs zich inzetten voor de oligodendroglial afkomst en post mitotische cellen met lange vertakte takken17,18geworden. Onrijpe OL vormen meer dan 80% van de knaagdier witte stof op P7 en op dit moment de eerste cellen van MBP+ 15,19,20,21worden waargenomen. Daarom kon Isolatievan OLs op P7 cellulaire hoogrentende zorgen.
In het laatste en vierde ontwikkelingsstadium OL express volwassen OLs myelinating eiwitten (myeline basic protein (MBP), proteolipid eiwitten (PLP), myeline verbonden glycoproteïne (MAG) en myeline Oligodendrocyt glycoproteïne (MOG)22,23 ,24,25,26. In dit stadium, volwassen OLs uitbreiden van membranen dat formulier compact enwrapping omhulsels rond de axonen en zijn in staat om myelinate. Dit valt samen met de waarneming dat in hersenen rat en muis, MBP+ cellen steeds meer overvloedig op P1419,20,21 worden.
Sinds de eerste Isolatievan Oligodendrocyt door Fewster en collega's in 196727, zijn verschillende methoden voor de isolatie van OLs uit het knaagdier CNS doorgevoerd met inbegrip van de immunopanning28,29,30, fluorescentie-geactiveerde cel sorteren (FACS) exploiteren cel oppervlak-specifieke antigenen28,31, differentiële kleurovergang centrifugeren32,33,34,35 en een schudden methode gebaseerd op differentiële hechting van verschillende CNS glia36,37. Bestaande cultuur methoden hebben echter beperkingen, met name wat betreft zuiverheid, de opbrengst en de tijd die nodig is voor het uitvoeren van de procedures38. Meer efficiënte isolatie methoden voor oligodendrocyten zijn dus vereist.
In deze paper presenteren we een eenvoudige en efficiënte selectiemethode voor de isolatie van de immunomagnetic van fase drie O4+ preoligodendrocytes cellen van neonatale muizen pups. Deze methode is een wijziging van de technieken die zijn gemeld door Emery et al. 39 en Dincman et al. 40 en biedt een Oligodendrocyt voorbereiding zuiverheid boven de 80% in ongeveer 4 uur.

<table><tbody><tr><td>10ml serologische pipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>10ml spuit Luer-Loc tip</td><td>BD, Becton Dickinson</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>15ml conische buizen</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>24-well weefselkweekplaten</td><td>Falcon</td><td>353935</td><td></td></tr><tr><td>40&micro;m cellezaaier</td><td>Fisher Scientific</td><td>22368547</td><td></td></tr><tr><td>50ml conische buizen</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>5ml serologische pipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10H</td><td></td></tr><tr><td>60mm weefselkweekplaten</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>70&micro;m cellezaaier</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 geit anti-muis IgG (H+L) secundair antilichaam</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 geit anti-konijn IgM (H+L) secundair antilichaam</td><td>Invitrogen</td><td>A21042</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 geit anti-konijn IgM (H+L) secundair antilichaam</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 geit anti-kip IgG (H+L) secundair antilichaam</td><td>Invitrogen</td><td>A11042</td><td></td></tr><tr><td>Anti-O4 kralen- Anti-O4MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-543</td><td></td></tr><tr><td>Apo-Transferrine mens</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Autofil complete flesdopfilterassemblage, 0.22um filter, 250ml</td><td>USA Scientific</td><td>6032-1101</td><td></td></tr><tr><td>Autofil complete flesdopfilterassemblage, 0.22um filter, 250ml</td><td>USA Scientific</td><td>6032-1102</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Boorzuur</td><td>Sigma</td><td>B7660</td><td></td></tr><tr><td>Rundserum (BGS)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30541.03</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1600-100</td><td></td></tr><tr><td>CNTF</td><td>Peprotech</td><td>450-50</td><td></td></tr><tr><td>d-Biotine</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Desoxyribonuclease I (DNAse I)</td><td>Worthington</td><td>LS002007</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescente microscoop met Olympus DP70 camera</td><td>Olympus</td><td>Bx51</td><td></td></tr><tr><td>Feather wegwerp scalpels</td><td>Andwin Scientific</td><td>EF7281C</td><td></td></tr><tr><td>Forskoline</td><td>Sigma</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>Duitse glazen dekglasjes, #1 dikte, 12mm diameter rond</td><td>NeuVitro</td><td>GG-12-oz</td><td></td></tr><tr><td>GFAP antilichaam</td><td>Aves</td><td>GFAP</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-61</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Invitrogen</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>Magnetische scheidingstandaard - MACS multistand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Magnetische scheider-MiniMACS scheider</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Millex PES 0.22&micro;m filtereenheid</td><td>Millipore</td><td>SLG033RS</td><td></td></tr><tr><td>Montagemedia- Prolong Gold met DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyl-cysteïne (NAC)</td><td>Sigma</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>Natuurlijke muis laminine</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium A</td><td>Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Neurotrophine-3 (NT-3)</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td></td></tr><tr><td>NG2 antilichaam</td><td>Millipore</td><td>AB5320</td><td></td></tr><tr><td>Papaïne</td><td>Worthington</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>PBS zonder Ca2+ en Mg2+</td><td>Sigma</td><td>D5652</td><td></td></tr><tr><td>PDGF</td><td>Peprotech</td><td>100-13A</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-2</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Selectiekolom-LS kolommen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Natriumseleniet</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Trace elementen B</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>Trijoodthyronine (T3)</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blauw oplossing</td><td>Corning</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>B27NBMA</td><td></td><td></td><td>487.75 mL Neurobasal Medium A; 10 mL B27 Supplement; 1 mL Primocin; 1.25 mL Glutamax; Filter steriliseren en bewaren bij 4 &deg;C tot gebruik.</td></tr><tr><td>B27NBMA + 10% BGS</td><td></td><td></td><td>27 mL B27NBMA; 3 mL Bovine growth serum</td></tr><tr><td>CNTF oplossing stock (10 &micro;g/ml; 1000X)</td><td></td><td></td><td>Bestel bij Peprotech (450-50). Maak op bij 0.1 tot 1 mg/ml volgens de instructies van de fabrikant (kan variëren per partij) in buffer (bijv. DPBS + 0.2% BSA). Bewaar bij -80 &deg;C. Werkoplossing (10 &micro;g/ml, 1000X) 1. Maak op 0.2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) in DPBS oplossing en filter steriliseren. 2. Verdun master stock aliquot tot 10&micro;g/ml in steriele, gekoelde 0.2% BSA/DPBS. 3. Aliquoteer (20&micro;l/buis) en snel invriezen in vloeibare stikstof. 4. Bewaar aliquots bij -80 &deg;C.</td></tr><tr><td>d-Bio

snelle en specifieke immunomagnetic isolatie van de primaire oligodendrocyten muis

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

De efficiënte en robuuste isolatie en de cultuur van primaire oligodendrocyten (OLs) is een waardevol instrument voor het in vitro onderzoek naar de ontwikkeling van oligodendroglia, alsook de biologie van demyeliniserende ziekten zoals multiple sclerose en Pelizaeus-Merzbacher-achtige ziekte (PMLD). Hier presenteren we een eenvoudige en efficiënte selectiemethode voor de isolatie van de immunomagnetic van fase drie O4+ preoligodendrocytes cellen van neonatale muizen pups. Aangezien onvolwassen OL vormen meer dan 80% van de knaagdier-hersenen witte stof op postnatale dag 7 (P7) deze methode isolatie zorgt niet alleen voor hoge cellulaire opbrengst, maar ook de specifieke Isolatievan OLs al toegezegd om de oligodendroglial afstamming, daalt het mogelijkheid van het isoleren van contaminerende cellen zoals astrocyten en andere cellen uit de hersenen van de muis. Deze methode is een wijziging van de technieken die eerder gerapporteerd en biedt Oligodendrocyt voorbereiding zuiverheid boven de 80% in ongeveer 4 uur.

Het doel van deze studie was om een verbeterde isolatie methode voor O4+ primaire muisknop oligodendrocyten waarvoor de minste mogelijke manipulatie van de doelcellen. De hele procedure van euthanasie voor de pups aan de beplating van de cellen in coverslips duurt ongeveer 4 uur en gegevens hieronder vertegenwoordigen drie onafhankelijke experimenten. Na weefsel dissociatie, gemiddeld 4,3 ± 0,46 x 107 cellen waren geïsoleerd voor elke onafhankelijke experiment met ee...

We beschrijven de immunomagnetic isolatie van primaire muisknop oligodendrocyten, waarmee het snelle en specifieke isolement van de cellen voor in vitro cultuur.

Snelle en specifieke Immunomagnetic isolatie van de primaire oligodendrocyten muis

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Het algemene doel van deze techniek is om immunomagnetische isolatie te gebruiken om O4-positieve oligodendrocyten van neonatale muisjes te selecteren voor hun in vitro-cultuuranalyse. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de neurale wetenschap met betrekking tot de studie van ziekten die myeline en myelinisatie beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de voorbereiding van de uiteindelijke oligodendrocytencultuur van meer dan 80% zuiverheid in ongeveer uur uren mogelijk maakt.Begin door kleine disserperende schaar te gebruiken om de huid langs de middenlijn van de hoofdhuid van een muis van vijf tot zeven postnatale dagen te snijden. Trek de huidflap terug om de schedel bloot te leggen en snijd de schedel voorzichtig langs de middenlijn van de opening aan de achterkant tot het voorste gebied. Vanuit de opening aan de achterkant van de schedel, snijd naar elke oogkas langs de basis van het bot en gebruik fijne pincetten om de cortices voorzichtig los te maken van de middenhersenen.Breng vervolgens de cortices over in een 60 millimeter weefselcultuurbakje dat zeven milliliter B-27 Neurobasal A Medium bevat. Wanneer alle hersenen zijn verzameld, breng de cortices over in een nieuw 60 millimeter weefselcultuurbakje dat vijf milliliter dissociatiebuffer bevat en gebruik een scalpelmesje nummer 15 om de cortices in één kubieke millimeter stukken te snijden. Incubeer de hersenstukken in een 37 graden Celsius 5%CO2 incubator gedurende 20 minuten.Voeg vervolgens een milliliter bovien groei serum toe om de enzymatische reactie te stoppen. Gebruik een 10 milliliter serologische pipet om de weefselslurry over te brengen in een 15 milliliter conische buis en dissocieer het hersenweefsel zes tot acht keer voorzichtig met pipetten. Laat de gedissocieerde weefselklontjes twee tot drie minuten bezinken.Breng vervolgens het supernatant over in een nieuwe buis. Voeg vervolgens drie milliliter Neurobasal A Medium, aangevuld met bovien groei serum en DNase I toe aan de weefsels en gebruik een vijf milliliter pipet om de weefsels voorzichtig te dissociëren met meer pipetten. De juiste pipetkrachten zijn cruciaal om een hoog rendement aan levensvatbare cellen te garanderen.Als pipetten te hard is, kan de levensvatbaarheid laag zijn. Terwijl als pipetten te zacht is, het cellulaire rendement laag kan zijn. Laat de weefselstukken nog eens twee tot drie minuten bezinken.Breng vervolgens het supernatant over in een nieuwe buis en voeg drie milliliter vers Neurobasal A Medium, aangevuld met bovien groei serum en DNase I toe aan het weefsel. Dissocieer het hersenweefsel voorzichtig met een P-1000 pipettip totdat er geen grote weefselklontjes meer overblijven, zorg ervoor dat u bubbels vermijdt. Gebruik een 10 milliliter pipet om de celsuspensie door een 70 micron celzeven te filteren in een 50 milliliter conische buis en breng het eindvolume van de enkele celsuspensie op 30 milliliter met vers Neurobasal A Medium, aangevuld met bovien groei serum en DNase I. Splits de celsuspensie in twee 15 milliliter conische buizen en pellet de neurale cellen door centrifugatie.Verwijder alle behalve de laatste vijf tot 10 microliters troebele supernatant en voeg drie milliliter Neurobasal A Medium aangevuld met bovien groei serum toe aan de cellen. Resuspendeer voorzichtig de cellen pellet en breng het eindvolume op 15 milliliter met vers Neurobasal A Medium dat 10% bovien groei serum bevat. Filter de celsuspensie door een 40 micron celzeven in een nieuwe 50 milliliter conische buis en breng het eindvolume op 30 milliliter met vers Neurobasal A Medium dat 10% bovien groei serum bevat.Splits vervolgens de gefilterde celsuspensie tussen twee 15 milliliter conische buizen voor centrifugatie. en resuspendeer de pellets in 2,5 milliliter ijskoud magnetisch celsorteer buffer voordat u de cellen poolt. Na het tellen, centrifugeer de cellen opnieuw en resuspendeer het pellet in 90 microliter vers magnetisch celsorteer buffer per een keer 10 tot de zeven cellen.Voeg vervolgens 10 microliter anti-04 kralen toe per een keer 10 tot de zeven cellen en meng de celsuspensie voorzichtig met voorzichtig schudden. Na 15 minuten bij vier graden Celsius met een voorzichtig schudden elke vijf minuten, voeg voorzichtig twee milliliter magnetisch celsorteer buffer per een keer 10 tot de zeven cellen toe voor een wassing door centrifugatie en gooi het supernatant weg door zorgvuldige vacuüm aspiratie. Resuspendeer het pellet in 500 microliter vers magnetisch celsorteer buffer voor elke een keer 10 tot de zeven cellen en plaats een magnetisch kralen sorteerkolom van de juiste grootte in de bijbehorende magnetische separator.Plaats een 40 micron zeven op de kolom en spoel de zeven voor met drie milliliter magnetisch celsorteer buffer, laat de buffer door de kolom lopen zonder de kolom te laten drogen. Voeg de cellen toe aan de zeven, gevolgd door een wassing van een milliliter met magnetisch celsorteer buffer. Was de kolom drie keer met drie milliliter magnetisch celsorteer buffer per wassing en een keer met Oligodendrocyte Proliferatie Medium.Breng vervolgens de kolom over in een 15 milliliter buis en gebruik de plunjer om onmiddellijk vijf milliliter vers Oligodendrocyte Proliferatie Medium door de kolom te spoelen. Na het tellen, verdun de cellen tot een geschikte plateerdichtheid en vervang de laminine van vooraf gecoate deksels in een 24 wel plate met 100 microliter Oligodendrocyte Proliferatie Medium. Incubeer de oligodendrocyten bij 37 graden Celsius en 5%CO2 gedurende niet langer dan 45 minuten om oligodendrocyte aanhechting aan de deksels te bevorderen.Overspoel vervolgens elke wel van de 24 wel plate met 500 microliter Oligodendrocyte Proliferatie Medium voor een 24 uur incubatie. De volgende dag, vervang de supernatanten met Oligodendrocyte Differentiatie Medium en plaats de cellen terug in de incubator totdat ze klaar zijn voor fixatie. 24 uur na plateren lijken de cellen bi of tripolair onder fase contrast microscopie, een karakteristiek kenmerk van vroeg stadium proliferating oligodendrocyte.Immunofluorescence kleuring toont dat 24 uur na plateren, de meerder

rapid-specific-immunomagnetic-isolation-mouse-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In this video, we describe a protocol for isolating CD11b cells, including microglia, from mouse pup brains using magnetic-activated cell sorting. The brain tissues are homogenized to obtain single-cell suspensions, which are incubated with anti-CD11b antibody-coated microbeads, followed by a magnetic column-based separation to purify the CD11b+ cell population.

Magnetic Isolation of Microglia from Mouse Pup Brains

This video demonstrates a technique for isolating and culturing oligodendrocyte precursor cells (OPCs) from the mouse pup brain cortex.

Isolating and Culturing Oligodendrocyte Precursor Cells from Mouse Pup Brain Cortex

This video demonstrates a method to isolate primary oligodendrocyte cells from a neural cell suspension obtained from a mouse pup using magnetic separation. The technique employs magnetic beads coated with antibodies specific to oligodendrocyte antigens, enabling selective isolation of these cells.

Isolating Murine Primary Oligodendrocytes Using Immunomagnetic Beads

This video demonstrates a protocol for extracting microglial cells from demyelinating lesions in mouse brains using magnetic cell sorting. The protocol involves dissecting the lesioned brain tissue containing microglial cells, treating the tissue with specific enzymes to obtain a single-cell suspension, and utilizing microglial receptor-specific magnetic beads to isolate the microglial cells.

Isolating Microglia from Mouse Brain Demyelinating Lesions Using Magnetic Activated Cell Sorting

Hier presenteren we een protocol microglia van postnatale muizen pups isolaat (dag 1) voor in vitro experimenten. Deze geïmproviseerde winmethode genereert zowel hoge opbrengst en zuiverheid, een significant voordeel boven alternatieve werkwijzen die breed experimenten met het oog op toelichting van microgliale biologie maakt.

Snelle en Geraffineerde CD11b magnetische Isolatie van Primary Microglia met verbeterde zuiverheid en veelzijdigheid

Een protocol voor de isolatie van primaire microglia vanuit lymfkliertest brains wordt gepresenteerd. Deze techniek helpt bij het bevorderen van het huidige begrip van neurologische aandoeningen. Dichtheid kleurovergang centrifugeren en magnetische scheiding worden gecombineerd om voldoende opbrengst van een zeer zuivere monster. Voorts schetsen we de stappen voor de karakterisering van microglia.

Karakterisering en isolatie van de primaire Microglia muis door dichtheid kleurovergang centrifugeren

Hier presenteren we een protocol voor in vitro isolatie van meerdere gliacelpopulaties van een muis CNS. Deze methode maakt de segregatie van regionale microglia, oligodendrocytenvoorlopercellen en astrocyten mogelijk om de fenotypen van elk in verschillende cultuursystemen te bestuderen.

Dissectie en isolatie van Murine Glia uit meerdere regio's van het centrale zenuwstelsel

Primaire microgliaculturen worden vaak gebruikt om nieuwe ontstekingsremmende moleculen te evalueren. Het huidige protocol beschrijft een reproduceerbare en relevante methode om microglia magnetisch te isoleren van pasgeboren pups.

Magnetische isolatie van microgliale cellen van neonate muis voor primaire celculturen

Hier presenteren we een protocol om primaire microglia te isoleren en te zuiveren in diermodellen van demyeliniserende ziekten, met behulp van kolomvormige magnetisch geactiveerde celsortering.

Isolatie van primaire microglia van muizen door magnetisch geactiveerde celsortering in diermodellen van demyelinisatie

Tot op heden zijn protocollen voor de gelijktijdige isolatie van alle belangrijke celtypen van het centrale zenuwstelsel uit dezelfde muis een onvervulde vraag. Het protocol toont een procedure die toepasbaar is bij naïeve en experimentele auto-immuun encefalomyelitis-muizen om complexe cellulaire netwerken tijdens neuro-inflammatie te onderzoeken en tegelijkertijd het vereiste aantal muizen te verminderen.

Gelijktijdige isolatie van de belangrijkste celtypen van het centrale zenuwstelsel van volwassen auto-immuun encefalomyelitis-muizen

We beschrijven een protocol voor het isoleren van microgliacellen uit de hypothalamus van de muis (of gelijkwaardige kleine hersenstructuren) met behulp van magnetisch geactiveerde celsortering (MACS), in een relatief korte tijd. De MACS-gesorteerde hypothalamische microglia kunnen worden gebruikt voor ex vivo-analyse en kunnen worden geplateerd om in vitro-assays uit te voeren.

Isolatie van hypothalamische microglia uit vers doorbloede volwassen muizenhersenen door magnetisch geactiveerde celsortering  

Leer immunomagnetische isolatie van primaire oligodendrocyten uit neonatale muizen voor in vitro myelinisatiestudies. Deze methode bereikt meer dan 80% zuiverheid in ongeveer een uur.

Snelle en specifieke Immunomagnetic isolatie van de primaire oligodendrocyten muis

Meer video's verkennen