Snelle en specifieke Immunomagnetic isolatie van de primaire oligodendrocyten muis

Het algemene doel van deze techniek is om immunomagnetische isolatie te gebruiken om O4-positieve oligodendrocyten van neonatale muisjes te selecteren voor hun in vitro-cultuuranalyse. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de neurale wetenschap met betrekking tot de studie van ziekten die myeline en myelinisatie beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de voorbereiding van de uiteindelijke oligodendrocytencultuur van meer dan 80% zuiverheid in ongeveer uur uren mogelijk maakt.

Begin door kleine disserperende schaar te gebruiken om de huid langs de middenlijn van de hoofdhuid van een muis van vijf tot zeven postnatale dagen te snijden. Trek de huidflap terug om de schedel bloot te leggen en snijd de schedel voorzichtig langs de middenlijn van de opening aan de achterkant tot het voorste gebied. Vanuit de opening aan de achterkant van de schedel, snijd naar elke oogkas langs de basis van het bot en gebruik fijne pincetten om de cortices voorzichtig los te maken van de middenhersenen.

Breng vervolgens de cortices over in een 60 millimeter weefselcultuurbakje dat zeven milliliter B-27 Neurobasal A Medium bevat. Wanneer alle hersenen zijn verzameld, breng de cortices over in een nieuw 60 millimeter weefselcultuurbakje dat vijf milliliter dissociatiebuffer bevat en gebruik een scalpelmesje nummer 15 om de cortices in één kubieke millimeter stukken te snijden. Incubeer de hersenstukken in een 37 graden Celsius 5%CO2 incubator gedurende 20 minuten.

Voeg vervolgens een milliliter bovien groei serum toe om de enzymatische reactie te stoppen. Gebruik een 10 milliliter serologische pipet om de weefselslurry over te brengen in een 15 milliliter conische buis en dissocieer het hersenweefsel zes tot acht keer voorzichtig met pipetten. Laat de gedissocieerde weefselklontjes twee tot drie minuten bezinken.

Breng vervolgens het supernatant over in een nieuwe buis. Voeg vervolgens drie milliliter Neurobasal A Medium, aangevuld met bovien groei serum en DNase I toe aan de weefsels en gebruik een vijf milliliter pipet om de weefsels voorzichtig te dissociëren met meer pipetten. De juiste pipetkrachten zijn cruciaal om een hoog rendement aan levensvatbare cellen te garanderen.

Als pipetten te hard is, kan de levensvatbaarheid laag zijn. Terwijl als pipetten te zacht is, het cellulaire rendement laag kan zijn. Laat de weefselstukken nog eens twee tot drie minuten bezinken.

Breng vervolgens het supernatant over in een nieuwe buis en voeg drie milliliter vers Neurobasal A Medium, aangevuld met bovien groei serum en DNase I toe aan het weefsel. Dissocieer het hersenweefsel voorzichtig met een P-1000 pipettip totdat er geen grote weefselklontjes meer overblijven, zorg ervoor dat u bubbels vermijdt. Gebruik een 10 milliliter pipet om de celsuspensie door een 70 micron celzeven te filteren in een 50 milliliter conische buis en breng het eindvolume van de enkele celsuspensie op 30 milliliter met vers Neurobasal A Medium, aangevuld met bovien groei serum en DNase I. Splits de celsuspensie in twee 15 milliliter conische buizen en pellet de neurale cellen door centrifugatie.

Verwijder alle behalve de laatste vijf tot 10 microliters troebele supernatant en voeg drie milliliter Neurobasal A Medium aangevuld met bovien groei serum toe aan de cellen. Resuspendeer voorzichtig de cellen pellet en breng het eindvolume op 15 milliliter met vers Neurobasal A Medium dat 10% bovien groei serum bevat. Filter de celsuspensie door een 40 micron celzeven in een nieuwe 50 milliliter conische buis en breng het eindvolume op 30 milliliter met vers Neurobasal A Medium dat 10% bovien groei serum bevat.

Splits vervolgens de gefilterde celsuspensie tussen twee 15 milliliter conische buizen voor centrifugatie. en resuspendeer de pellets in 2,5 milliliter ijskoud magnetisch celsorteer buffer voordat u de cellen poolt. Na het tellen, centrifugeer de cellen opnieuw en resuspendeer het pellet in 90 microliter vers magnetisch celsorteer buffer per een keer 10 tot de zeven cellen.

Voeg vervolgens 10 microliter anti-04 kralen toe per een keer 10 tot de zeven cellen en meng de celsuspensie voorzichtig met voorzichtig schudden. Na 15 minuten bij vier graden Celsius met een voorzichtig schudden elke vijf minuten, voeg voorzichtig twee milliliter magnetisch celsorteer buffer per een keer 10 tot de zeven cellen toe voor een wassing door centrifugatie en gooi het supernatant weg door zorgvuldige vacuüm aspiratie. Resuspendeer het pellet in 500 microliter vers magnetisch celsorteer buffer voor elke een keer 10 tot de zeven cellen en plaats een magnetisch kralen sorteerkolom van de juiste grootte in de bijbehorende magnetische separator.

Plaats een 40 micron zeven op de kolom en spoel de zeven voor met drie milliliter magnetisch celsorteer buffer, laat de buffer door de kolom lopen zonder de kolom te laten drogen. Voeg de cellen toe aan de zeven, gevolgd door een wassing van een milliliter met magnetisch celsorteer buffer. Was de kolom drie keer met drie milliliter magnetisch celsorteer buffer per wassing en een keer met Oligodendrocyte Proliferatie Medium.

Breng vervolgens de kolom over in een 15 milliliter buis en gebruik de plunjer om onmiddellijk vijf milliliter vers Oligodendrocyte Proliferatie Medium door de kolom te spoelen. Na het tellen, verdun de cellen tot een geschikte plateerdichtheid en vervang de laminine van vooraf gecoate deksels in een 24 wel plate met 100 microliter Oligodendrocyte Proliferatie Medium. Incubeer de oligodendrocyten bij 37 graden Celsius en 5%CO2 gedurende niet langer dan 45 minuten om oligodendrocyte aanhechting aan de deksels te bevorderen.

Overspoel vervolgens elke wel van de 24 wel plate met 500 microliter Oligodendrocyte Proliferatie Medium voor een 24 uur incubatie. De volgende dag, vervang de supernatanten met Oligodendrocyte Differentiatie Medium en plaats de cellen terug in de incubator totdat ze klaar zijn voor fixatie. 24 uur na plateren lijken de cellen bi of tripolair onder fase contrast microscopie, een karakteristiek kenmerk van vroeg stadium proliferating oligodendrocyte.

Immunofluorescence kleuring toont dat 24 uur na plateren, de meerder